KR102065581B1 - 항균 물질을 합성하는 유전자를 보유하며, 프로바이오틱스 특성을 가지는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 srcm101368 균주 및 이의 용도 - Google Patents

항균 물질을 합성하는 유전자를 보유하며, 프로바이오틱스 특성을 가지는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 srcm101368 균주 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 내산성, 내담즙성, 내열성, 세포외 효소 분비능, α-용혈 활성, 혈전분해 활성, 유해 미생물에 대한 항균활성 및 장내 상피세포 부착능이 있고, 항균 물질을 합성하는 유전자를 보유하면서, 바이오제닉 아민 및 유해효소를 생성하지 않는, 기탁번호가 KCCM12260P인 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) SRCM101368 균주에 관한 것으로, 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 SRCM101368 균주는 정장제, 장류 제조를 위한 스타터 균주 및 항균용 조성물 등의 관련 산업 분야에 매우 유용하게 이용될 수 있다.

Description

항균 물질을 합성하는 유전자를 보유하며, 프로바이오틱스 특성을 가지는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 SRCM101368 균주 및 이의 용도{Bacillus amyloliquefaciens SRCM101368 strain having gene synthesizing antimicrobial compound and probiotics properties and uses thereof}
본 발명은 항균 물질을 합성하는 유전자를 보유하며, 프로바이오틱스 특성을 가지는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 SRCM101368 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
최근 현대인들의 생활수준 향상과 더불어 건강에 대한 관심도 높아지고 있으며, 건강 증진을 위하여 체내 자연 균총을 새롭게 형성하거나 면역계 활성 등을 위하여 프로바이오틱스(probiotics)라는 미생물 식품 보충제가 널리 사용되고 있다. 일반적으로 프로바이오틱스로 사용되는 미생물들은 위장의 위산, 담낭의 담즙 및 소장에서 분비되는 각종 소화효소와 같은 저해환경으로부터 저항력을 가지며 대장과 직장에 도달해 증식하고 정착하는 능력을 구비해야 한다. 현재, 프로바이오틱스로는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus), 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) 등이 주로 연구되었다. 그 중 바실러스 속은 산업적으로 중요한 종으로 오랜 세월 동안 식품, 의약품 및 각종 발효 산업에서 사용되어 안전성이 확립되어 있다.
프로바이오틱스(probiotics)는 인간 및 동물에 투여되어 장내 미생물 균총의 균형을 개선하여, 성장의 촉진, 사료 이용률 증대, 장 이상 발효나 설사의 방지, 영양 섭취 저해인자를 제거하는 미생물로 간주되고 있으며, 이유 자돈에서 프로바이오틱스의 공급은 성장과 사료효율을 개선시킨다는 보고가 있다. 프로바이오틱스에 사용되는 균들은 주로 건강한 사람의 장에서 흔하게 발견되는 상주균들로 락토바실러스와 비피더스균이 주종을 이룬다. 프로바이오틱스로서 필요한 특성은 안전성, 기능적 측면(생존성, 정착성, 서식성, 항미생물제 생성능, 면역 촉진능, 항유전독성 활성, 병원성 세균의 억제능), 기술적 측면(관능적 특성, 안정성, 박테리오파지 저항성, 제조 과정 중의 생존성) 및 GRAS(Generally Recognized As Safe) 미생물이다. 프로바이오틱스는 항생제와는 반대되는 특성을 가지고 있는데, 항생제가 미생물이 생산하는 대사 산물로서 소량으로 다른 미생물의 발육을 억제하거나 사멸시키는 물질이라면, 프로바이오틱스는 균들의 공생, 상생의 능력을 이용하여 면역기능을 증진시키고 유해 미생물의 성장을 저해하는 등의 효과를 나타내고 있어 이러한 면역 증진 기능을 지닌 기능성 물질 및 프로바이오틱스는 현재 오남용으로 사회적 문제가 되고 있는 항생제의 대체 물질로서 이용이 가능하다.
한편, 한국등록특허 제1839375에는 '항균 활성과 프로바이오틱스 특성을 갖는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 SRCM 100730 균주 및 이의 용도'에 대해 개시하고 있고, 한국등록특허 제1219572호에는 '효소 활성 및 항균 활성을 갖는 저영양 바실러스 아밀로리큐파시엔스 B4-4 균주'에 대해 개시하고 있다. 하지만, 본 발명의 '항균 물질을 합성하는 유전자를 보유하며, 프로바이오틱스 특성을 가지는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 SRCM101368 균주 및 이의 용도'에 대해 아직까지 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 내산성, 내담즙성, 내열성, 프로테아제, 셀룰라제 및 아밀라제인 세포외 효소 분비능, α-용혈 활성, 혈전분해 활성, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 및 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에 대한 항균활성 및 장내 상피세포 부착능이 있고, 항균 물질인 이투린 A(iturin A) 및 설팩틴(surfactin)을 합성하는 유전자를 보유하고, hblC , nheA , entFM , cytK , ces 및 bceT인 독소 유전자를 보유하지 않으며, 티라민인 바이오제닉 아민 및 트립토파나아제(tryptophanase), β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase) 및 우레아제(urease)인 유해효소를 생성하지 않는 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) SRCM101368 균주(KCCM12260P)를 분리하였다. 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 SRCM101368 균주는 상기와 같은 프로바이오틱스 특징을 모두 가지므로, 정장제로 유용하게 사용될 수 있으며, 또한 품질 좋은 장류 제조를 위한 스타터 균주 및 바실러스 세레우스, 리스테리아 모노사이토제네스 및 에스케리키아 콜라이에 대한 항균용 제제로도 사용이 가능함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 내산성, 내담즙성, 내열성, 세포외 효소 분비능, α-용혈 활성, 혈전분해 활성, 유해 미생물에 대한 항균활성 및 장내 상피세포 부착능이 있고, 항균 물질을 합성하는 유전자를 보유하면서, 바이오제닉 아민 및 유해효소를 생성하지 않는, 기탁번호가 KCCM12260P인 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) SRCM101368 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 장류 제조용 스타터(starter) 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 유해 미생물에 대한 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) SRCM101368 균주(KCCM12260P)는 내산성, 내담즙성, 내열성, 프로테아제, 셀룰라제 및 아밀라제인 세포외 효소 분비능, α-용혈 활성, 혈전분해 활성, 유해 미생물에 대한 항균활성 및 장내 상피세포 부착능이 있고, 항균 물질인 이투린 A(iturin A) 및 설팩틴(surfactin)을 합성하는 유전자를 보유하면서, 티라민인 바이오제닉 아민 및 트립토파나아제(tryptophanase), β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase) 및 우레아제(urease)인 유해효소를 생성하지 않으므로, 정장제, 장류 제조를 위한 스타터 균주 및 항균용 조성물 등의 관련 산업 분야에 매우 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명에서 분리한 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) SRCM101368 균주의 16S rRNA의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에서 분리한 바실러스 아밀로리퀴페시언스 SRCM101368 균주의 계통도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에서 분리한 바실러스 아밀로리퀴페시언스 SRCM101368 균주의 내산성을 확인한 결과를 나타낸 것이다. SRCM101379 및 SRCM101396은 비교 대조구로 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SRCM101379 및 SRCM101396 균주를 나타낸다.
도 4는 본 발명에서 분리한 바실러스 아밀로리퀴페시언스 SRCM101368 균주의 내담즙성을 확인한 결과를 나타낸 것이다. SRCM101379 및 SRCM101396은 비교 대조구로 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SRCM101379 및 SRCM101396 균주를 나타낸다.
도 5는 본 발명에서 분리한 바실러스 아밀로리퀴페시언스 SRCM101368 균주의 내열성을 확인한 결과이다. SRCM101379 및 SRCM101396은 비교 대조구로 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SRCM101379 및 SRCM101396 균주를 나타낸다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 내산성, 내담즙성, 내열성, 세포외 효소 분비능, α-용혈 활성, 혈전분해 활성, 유해 미생물에 대한 항균활성 및 장내 상피세포 부착능이 있고, 항균 물질을 합성하는 유전자를 보유하면서, 바이오제닉 아민 및 유해효소를 생성하지 않는, 기탁번호가 KCCM12260P인 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) SRCM101368 균주를 제공한다.
본 발명에서는 전통장류로부터 균주를 분리하였고, 그 중 내산성, 내담즙성, 내열성, 세포외 효소 분비능, α-용혈 활성, 혈전분해 활성, 유해 미생물에 대한 항균활성 및 장내 상피세포 부착능이 있고, 항균 물질을 합성하는 유전자를 보유하면서, 바이오제닉 아민 및 유해효소를 생성하지 않는 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) 균주를 확인하였으며, 이를 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) SRCM101368 균주로 동정하여 한국미생물보존센터(KCCM)에 2018년 05월 11일에 기탁하였다(기탁번호: KCCM12260P).
본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 SRCM101368 균주(KCCM12260P)에 있어서, 상기 세포외 효소는 프로테아제, 셀룰라제 및 아밀라제이며, 유해 미생물은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 및 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)이며, 항균 물질은 이투린 A(iturin A) 및 설팩틴(surfactin)이고, 바이오제닉 아민은 티라민이며, 유해효소는 트립토파나아제(tryptophanase), β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase) 및 우레아제(urease)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 내산성은 pH 2~5에 대한 내산성이며, 내담즙성은 0.1~1%의 담즙산염에 대한 내담즙성이며, 내열성은 40~80℃의 내열성이다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스 제제를 제공한다.
상기 프로바이오틱스 제제는 당업계에 공지된 방법에 따라 다양한 제형과 방법으로 제조 및 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 SRCM101368 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물은 약제학적 분야에서 통상적으로 사용되는 담체와 혼합하여 산제(powder), 액제(liquids and solutions), 정제(tablet), 캡슐(capsule), 시럽(syrup), 현탁제(suspension) 또는 과립제(granule) 등의 형태로 제조되어 투여될 수 있다. 상기 담체로는 예를 들어, 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 투여 용량은 체내에서의 활성성분의 흡수도, 불활성률, 배설속도, 피투여자의 연령, 성별, 축종, 상태 및 질병의 중증 정도 등에 따라 적절히 선택할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 프로바이오틱스 제제를 포함하는 식품을 제공한다.
본 발명의 상기 프로바이오틱스 제제는 내산성, 내담즙성, 내열성, 세포외 효소 분비능, α-용혈 활성, 혈전분해 활성, 유해 미생물에 대한 항균활성 및 장내 상피세포 부착능이 있고, 항균 물질을 합성하는 유전자를 보유하면서, 바이오제닉 아민 및 유해효소를 생성하지 않는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 SRCM101368 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 상기 프로바이오틱스를 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 프로바이오틱스를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 프로바이오틱스는 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 혼합양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 혼합양은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 프로바이오틱스를 첨가할 수 있는 식품의 예로는 빵, 캔디류, 스낵류, 과자류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 장류 제조용 스타터(starter) 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 장류 제조용 스타터(starter)란 장류 제조를 위해 발효에 관여하는 미생물을 포함하는 제제 또는 조성물을 의미한다. 장류 제조 시에 첨가함으로써 발효된 장류에서 생장할 수 있는 미생물 또는 우점종으로 생장할 수 있는 미생물을 제공하기 위하여 사용된다. 상기 장류 발효용 스타터를 사용하여 장류를 제조하는 경우, 상기 장류 발효용 스타터에 포함된 미생물에 의하여, 장류의 품질을 일정하게 조절하거나, 특정한 목적, 일 예로 장류에서 이취를 발생시키지 않거나, 감소시키는 목적 또는 장류에서 구수한 맛이나 단맛을 강화시키기 위한 목적을 달성할 수 있다.
본 발명의 균주를 배양하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법에 따라 배양할 수 있으며, 특별한 방법에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 균주를 배양하는 단계에서 얻어지는 상기 균주 또는 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 첨가제로 사용할 경우, 상기 균주 또는 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 그대로 첨가하거나 다른 첨가제를 함께 사용할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 스타터(starter) 균주로 이용하여 장류를 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 유해 미생물에 대한 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명의 항균 조성물이란 항미생물제를 총칭하는 의미인 항생제와 같은 의미일 수 있고, 항진균제, 살균제, 방부제, 보존제 또는 제균제와 같은 의미일 수 있으며, 바람직하게는 바실러스 세레우스, 리스테리아 모노사이토제네스 및 에스케리키아 콜라이 등을 포함하는 병원성 미생물의 발육과 생활 기능을 저지 또는 억제할 수 있는 물질을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항균 조성물은 바실러스 아밀로리퀴페시언스 SRCM101368 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물 외에 당질, 단백질, 지질, 비타민류 및 미네랄류를 포함할 수 있다. 상기 당질, 단백질, 지질, 비타민류 또는 미네랄류는 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일 예로 상기 당질은 벌꿀, 덱스트린, 수크로오스, 팔라티노스, 포도당, 과당, 물엿, 당알콜(sugar alcohol), 소르비톨, 크실리톨, 말티톨일 수 있고 상기 단백질은 카제인(casein), 유청 단백질(whey protein) 등의 우유 유래 단백질, 대두 단백질, 이들 단백질의 트립신, 펩신 등의 동물 유래 효소 및 뉴트라아제(neutrase), 알칼라아제(alkilase)에 의한 가수분해물일 수 있으며, 상기 지질은 제1가 포화지방산, 다가 불포화지방산을 포함하는 해바라기유, 채종유(rapeseed oil), 올리브유, 홍화유(safflower oil), 옥수수유, 대두유, 팜유(palm oil), 야자유 등의 각종 식물 유래 유지, 중쇄 지방산(middle-chain fatty acid), EPA, DHA, 대두유래 인지질, 우유 유래 인지질일 수 있고, 상기 미네랄류는 인산칼륨, 탄산칼륨, 염화칼륨, 염화나트륨, 유산칼슘, 글루콘산칼슘, 판토텐산칼슘, 카제인칼슘, 염화마그네슘, 황산제1철, 탄산수소나트륨일 수 있으나, 각각의 예에 의해 특별히 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
균주 분리 및 배양 조건
전라북도 순창군에서 전통적인 방법으로 제조한 된장 시료를 수거하여 실험에 사용하였다. 수거한 된장 1g의 시료를 9mL의 멸균 생리식염수(0.85% NaCl)에 넣어 십진법으로 희석한 후 LB(트립톤 1%, 효모추출물 0.5%, 염화나트륨 0.5%, 한천 1.5%) 고체배지에 도말하여 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 순수한 균주를 분리하기 위해 단일 콜로니를 분리하였고, LB 액체배지에서 30℃, 24시간 동안 배양하였다. 선별한 균주를 대상으로 멸균된 10% 스킴 밀크 보존액에 혼합하여 4℃에서 보관하였다. 보관 후 세포의 활성화는 LB 액체배지에서 30℃, 24시간 배양하여 활성화하여 사용하였다.
선별 균주의 동정
선별 균주의 동정을 위해 균체는 한천 고체배지로부터 회수하였으며, 이들의 DNA는 Qiuagen QIAamp DNA mini kit를 사용하여 추출하였다. 16S rRNA 유전자는 두 개의 알려진 유니버설 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 두 유니버설 프라이머의 염기서열은 다음과 같다. 먼저, 정방향 프라이머는 27F 프라이머 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'(서열번호 2), 역방향 프라이머는 1492R 프라이머 5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'(서열번호 3)이다. PCR 반응의 조건은 다음과 같다. 95℃에서 10분간 1회 초기 변성 후 DNA 증폭을 위하여 90℃에서 30초간 변성, 60℃에서 30초간 결합, 72℃에서 30초간 증폭 과정을 35회 실시하고 72℃에서 10분간 마지막 증폭을 1회 실시하였다. 반응이 끝난 PCR 산물은 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동 한 후 UV 트랜스일루미네이터(Gel documentation, Bio-Rad)를 이용하여 밴드를 확인한 후 증폭이 확인된 PCR 산물은 마크로젠(주)에 의뢰하여 16S rRNA 유전자의 서열분석을 실시하였다.
세포외 효소의 활성측정
선별 균주의 세포외 효소들 중 발효와 관련된 단백질, 섬유소 및 전분 분해 효소의 활성을 분석하기 위하여 각 효소와 특이적으로 반응하는 기질을 첨가한 고체배지를 제조하였다. 단백질 분해효소(protease)의 활성은 Vermelho 등의 방법에 따라 2% 스킴 밀크에 1.5% 아가를 첨가하여 스킴 밀크 아가 배지를 제조하였으며, 섬유소 분해효소(cellulase)의 활성은 Teather와 Wood의 방법에 따라 1% CMC(carboxylmethyl cellulose)에 1.5% 아가 및 0.01% 트리판 블루를 첨가하여 CMC 아가 배지를 제조하였다. 또한, 전분 분해효소(amylase)의 활성을 확인하기 위하여 1% 가용성 전분과 1.5% 아가를 첨가한 전분 아가 배지를 제조하였고, 웰 확산(well diffusion) 방법을 이용하여 효소활성을 측정하기 위하여 각각의 배지에 8mm의 구멍을 뚫었다. 선별된 바실러스 균은 LB 액체배지에서 30℃, 24시간 진탕배양 하였다. 선별 균주 배양액은 13,000rpm로 10분간 원심 분리하여 상등액을 취하고, 0.45㎛ 멤브레인 필터로 제균한 뒤 100㎕씩 각각의 세포외 효소 활성 측정 배지의 구멍에 분주하여 25℃에서 24시간 동안 반응시킨 후 웰 주위로 생기는 환의 크기를 측정하였다. 아밀라아제 활성의 경우 반응 후 루골 용액(Lugol's solution)으로 염색한 뒤 생기는 환의 크기를 측정하였다.
바실러스 균의 세포외 효소 활성 분석 기질, 염색시약 및 판독 방법
균주명 배양배지
및 배양조건		 효소 기질 염색약 생육저지환
바실러스 LB, 30℃, 24hr 프로테아제 2.0(w/w) 스킴밀크 - +
LB, 30℃, 24hr 아밀라아제 1.0% 가용성 전분 루골 용액 +
LB, 30℃, 24hr 셀룰라아제 1.0% CMC
(carboxymethyl cellulose) 		0.2%(w/v)
콩고 레드 용액		 yellow
혈전분해효소 활성 측정
식품의약품안전처 독성연구소 혈전용해제의 효능검색 방법(Fibrin plate 방법, Astrup and Mullertz, 1952)을 변형하여 혈전분해 활성분석에 사용하였다. 100 unit/㎖ 트롬빈 용액을 90mm 페트리 디쉬에 200㎕ 분주하고 0.5% 피브리노겐 용액(in PBS buffer, pH7.4) 10㎖과 1.0% 아가로스 용액 10㎖을 순서대로 분주하고 잘 혼합하여 평판 피브린 플레이트를 제조하였다. 선별된 균주는 LB 액체배지에서 30℃, 24시간 동안 진탕 배양하여 15,000×g로 10분간 원심분리 후 상등액을 취하고 0.45㎛ 멤브레인 필터로 제균한 뒤 피브린 플레이트에 8mm hole에 각각 분주하였다. 37℃에서 20시간 반응 후 생긴 투명한 환의 지름을 측정하여 혈전분해 활성을 확인하였다. 양성대조구로 우로키나아제(urokinase, 0.25 unit/ml)를 사용하였다.
용혈성 및 유해효소 생성 분석
선발 균주의 용혈성을 확인하기 위해서 5% 양 혈액(MBcell, Seoul, Korea)를 첨가된 혈액 아가 배지에 균주를 획선 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양하여 균주 주위에 생기는 환의 형태로 용혈성을 확인하였다. 또한, 발암 관련 유해효소로 알려진 트립토파나아제(tryptophanase), β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase) 및 우레아제(urease)의 생성 여부를 확인하였다. 트립토파나아제의 생성 여부를 확인하기 위하여 TSB(Tryptone Soya Broth, Oxoid Ltd., UK) 배지에 접종한 후 37℃에서 24시간 동안 진탕배양 후 인돌 용액 드로퍼(BBL, USA)를 첨가하여 배지 표면에 색 변화로 확인하였으며, 우레아제의 생성 여부는 우레아 신속 테스트 키트(MB cell, Seoul, Korea)에 선별 균주를 접종하고 바셀린 오일(MBcell, Korea)을 첨가하여 산소가 차단된 상태로 37℃에서 4~24시간 동안 배양하여 배지의 색 변화로 확인하였다. β-글루쿠로니다아제의 생성 여부는 TBX 아가(Tryptone Bile X-glucuronide agar, Oxoid Ltd., UK) 배지에 선별 균주를 접종하여 37℃에서 24시간 배양 후 집락의 색 변화로 확인하였다.
식중독 관련 유해병원성 미생물에 대한 항균력 확인
식품을 부패 또는 오염시켜 식중독 유발 등 인체에 유해하다고 알려진 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 및 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에 대한 균주의 항균활성을 확인하였다. 항균 활성을 측정하였다. 항균 활성의 측정을 위해 바실러스 세레우스 KCCM40935, 리스테리아 모노사이토제네스 KCCM43155 및 에스케리키아 콜라이 KCCM11234은 한국미생물보존센터(KCCM)으로부터 분양받아 지시균주로 사용하였다. 측정 방법은 웰 확산 방법을 이용하였으며, 각 지시균주의 배양액(3.0×105 cfu/ml)을 0.8% 한천을 함유한 NB(nutrient broth) 소프트 배지에 첨가하여 고체배지를 제작한 후 선별 균주의 배양 상등액 100㎕을 웰에 분주하여 배양 상등액이 시험 고체배지에 확산되도록 한 후 지시균주의 생육 최적 온도에서 24시간 이상 배양하여 유해미생물의 생육억제 환 크기를 측정하여 항균력을 측정하였다.
선별 균주의 바실러스 세레우스( Bacillus cereus ) 독소 유전자 분석을 통한 안전성 분석
선별 균주의 식품 내 안전성 여부를 확인하기 위해, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)가 생성하는 6개의 설사형 독소 및 구토형 독소 유전자를 보유하고 있는 지를 확인하기 위해 PCR 방법을 이용하여 동정하였다. PCR(Veriti 96-well Thermal Cycler, Life technologies)은 코젠 바이오텍의 PowerChekTM 바실러스 세레우스 Toxin 6-plex Detection Kit를 사용하여 조사하였으며, 6개의 독소 유전자(hblC, nheA , entFM , cytK , ces 및 bceT)를 대상으로 본 발명의 선별 균주의 보유 여부를 조사하였다.
먼저, PCR 반응을 위한 혼합물은 키트 매뉴얼에 따라 실시하였으며, PCR 반응 조건은 95℃에서 10분 1회 초기변성 후, DNA 증폭을 위해 95℃ 30초간 변성, 60℃에서 30초간 결합, 72℃에서 30초간 증폭 과정을 35회 실시하였고, 마지막으로 72℃에서 10분간 증폭을 1회 실시하였다. PCR 산물은 1.5% 아가로스 겔로 전기영동 한 후 UV 트랜스일루미네이터(Gel documentation, Bio-Rad)를 이용하여 밴드를 확인하여 독소 유전자의 보유 여부를 확인하였다.
바이오제닉 아민 생성여부 확인
티라민, 히스타민의 정량 분석은 HPLC를 이용하여 분석하였다. 표준용액은 0.1N 염산에 녹여 약 1g/L 되도록 제조한 후 0.1~100mg/L의 농도로 2종의 표준 용액을 희석해 준비하였고, 분석을 통하여 검량곡선을 작성하였다. 바이오제닉 아민의 생성여부를 확인하기 위해 선별 균주를 티라민 및 히스타민의 전구물질인 티로신 및 히스티딘이 각각 200ppm이 함유된 LB 액체배지에 접종한 후 30℃에서 24시간 동안 배양하였고, 배양액을 13,000rpm에서 10분간 원심분리 하여 상등액을 분석에 활용하였다. 배양액과 표준용액을 각각 시험관에 0.5mL씩 취한 후 1,7-디아미노헵탄 (0.1g/L) 0.25mL씩 첨가하였다. 포화탄산나트륨용액 0.25mL과 1% 댄실염화물(dansyl chloride) 아세톤 용액 0.4mL을 첨가하여 혼합한 후 45℃에서 1시간 동안 유도체화 하였다. 유도체화 후 10% 프롤린 용액 0.25mL을 가하여 과잉의 댄실염화물을 제거하고, 시험관에 에테르 2.5mL을 가하여 3분간 진탕한 후 상등액을 취하여 이를 질소농축기에서 완전히 증발시킨 후 잔사를 아세토나이트릴 0.5mL에 녹여 0.45㎕ 필터로 여과한 후 HPLC를 이용하여 분석하였다. 분석조건은 아래 표와 같다.
바이오제닉 아민 분석을 위한 HPLC 기기 분석 조건
HPLC 조건
기기 Agilent 1200 series
(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)
칼럼 CapcellPak C18 Column
검출기 DAD detector (254 nm)
이동상 A: 0.1% formic acid in H2O
B: 0.1% formic acid in ACN
구배조건 A:B = 45:55, 0~10 min
A:B = 35:65, 10~15 min
A:B = 20:80, 15~20 min
A:B = 10:90, 20~30 min
A:B = 10:90, 40 min over
유량 1.0 mL/min
온도 40oC
주입량 20㎕
바이오제닉 아민 합성 유전자 분석
선별 균주에서 바이오제닉 아민 합성과 연관 있다고 알려진 티로신 디카르복시라제(hdc) 및 히스타민 디카르복시라제(tdc) 유전자 유무를 확인하기 위해 배양한 배양액을 QIAamp DNA mini kit(QIAGEN)을 이용하여 DNA를 추출 후, 특정 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응의 조건은 다음과 같다. 95℃에서 5분간 1회 초기 변성 후 DNA 증폭을 위하여 95℃에서 45초간 변성, 어닐링 온도에서 45초간 결합, 72℃에서 2분간 증폭 과정을 35회 실시하고 72℃에서 5분간 마지막 증폭을 1회 실시하였다. 반응이 끝난 PCR 산물은 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동한 후 UV 트랜스일루미네이터(Gel documentation, Bio-Rad)를 이용하여 밴드를 확인하여 바이오제닉 합성 관련 유전자 보유 여부를 확인하였다.
바이오제닉 아민 합성 유전자 분석에 사용된 프라이머
타겟
유전자		 염기서열(5'-3', 정방향) 염기서열(5'-3', 역방향) AT
(℃)		 생성물 사이즈
(bp)
hdc GATGGTATTTCKTATGA
(서열번호 4)		 CAAACACCAGCATCTTC
(서열번호 5)		 52 435
tdc CAAACACCATCTTC
(서열번호 6)		 ACATAGTCAACCATRTTGAA
(서열번호 7)		 48 1,100
내산성 , 내담즙성 및 내열성 분석
pH, 담즙산 및 열에 대한 내성 효과를 알아보기 위하여 선발 균주를 LB 액체배지에서 30℃에서 24시간 배양 후, 이를 실험의 초기 접종 배양액으로 사용하였다. 내산성 분석은 각각 pH 2.0~5.0으로 조절한 LB 액체배지에 초기 접종 배양액을 5%씩 접종하여 30℃에서 30분 진탕배양한 후, 생균수를 측정하여 내산성 정도를 확인하였다. 내담즙성 분석은 담즙(oxgall)을 0.1~1.0% 첨가한 LB 액체배지에 초기 접종 배양액을 5%씩 접종하여 30℃에서 6시간 진탕배양한 후 생균수를 측정하여 내담즙성을 확인하였다. 또한, 내열성 분석은 LB 액체배지에 초기 접종 배양액을 5%씩 접종한 LB 액체배지를 각각 40~80℃에서 10분간 반응 후 생균수를 측정하여 내열성 정도를 확인하였다. 각 실험의 대조구는 pH를 조절하지 않은 배지, 담즙을 첨가하지 않은 배지, 30℃에서 반응한 생균수로 정하였다.
항균 생리활성 물질 합성 관련 유전자 분석
바실러스 균은 병원성 세균을 억제하는 항균 펩타이드를 합성한다고 잘 알려져 있다. 대표적으로 생산하는 것으로 알려진 지질 펩타이드 항생물질 생산에 관여하는 유전자를 확인하기 위해서 PCR 검출법을 활용하였다. 바실로마이신 D(bmyA), 펜기신(fenD), 이투린 A(ituA), 설팩틴(surA) 및 즈위터미신 A(zwiA) 생합성 유전자를 각각의 특정 프라이머를 사용하여 검출하였다. PCR 반응은 전체 부피 25㎕의 반응 혼합물(GeDEPOT)을 사용하였으며, 1㎕의 게놈 DNA와 10pmol 프라이머들을 첨가하였다. PCR 산물은 1.0% 아가로스 겔로 전기영동한 후 UV 트랜스일루미네이터에서 밴드를 확인하였다.
항균물질 합성 관련 유전자 분석에 사용된 프라이머 정보
타겟
유전자		 염기서열(5'-3', 정방향) 염기서열(5'-3', 역방향) AT
(℃)		 생성물 사이즈
(bp)
bmyA GAAGGACACGGCAGAGAGTC
(서열번호 8) 		CGCTGATGACTGTTCATGCT
(서열번호 9) 		55 875
fenD TTTGGCAGCAGGAGAAGTTT
(서열번호 10) 		GCTGTCCGTTCTGCTTTTTC
(서열번호 11) 		54 964
ituA GATGCGATCTCCTTGGATGT
(서열번호 12) 		ATCGTCATGTGCTGCTTGAG
(서열번호 13)		 54 647
surA ACAGTATGGAGGCATGGTC
(서열번호 14)		 TTCCGCCACTTTTTCAGTTT
(서열번호 15)		 55 441
zwiA TTGGGAGAATATACAGCTCT
(서열번호 16)		 GACCTTTTGAAATGGGCGTA
(서열번호 17)		 55 779
장내 상피세포 부착능
24-웰 플레이트에 2×105 세포/웰로 접종된 결장 상피 세포(Normal colon fibroblasts)인 CCD-18Co 세포들을 24시간 배양한 후 선발된 바실러스 균을 MOI(multiplicity of infection) 10으로 45분간 감염시켰다. 세포에 침투하지 못한 처리 균주는 PBS 버퍼로 3회 세척하여 제거하였고, 1% 트리톤 X-100(in PBS buffer)으로 CCD-18Co 세포들을 파괴하여 세포에 침투했던 선발 균주를 연속적으로 희석해 LB 고체 배지에 도말하였다. 장내 상피세포 부착율은 하기 식을 이용하여 산출하였다.
부착율(adhesion) (%) = [부착 균수/초기 처리균수] × 100
실시예 1. SRCM101368의 동정
선별된 SRCM101368 균주의 동정을 위해 16S rRNA 유전자 염기서열(서열번호 1, 도 1)을 분석하였으며, 결과를 기반으로 NCBI BLAST 검색 결과, SRCM101368 균주는 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens)와 98%의 상동성을 보였으며, 표준균주의 16S rRNA 염기서열을 토대로 계통수(phylogenetic tree)를 작성한 결과, SRCM101368 균주는 표준균주 바실러스 아밀로리퀴페시언스 DSM 및 15535와 가장 가까운 근연관계를 확인하였다(도 2). 최종적으로 선별된 균주를 바실러스 아밀로리퀴페시언스 SRCM101368로 명명하였으며, 한국미생물보존센터(KCCM, Korean Culture Center of Microorganisms)에 KCCM12260P(Bacillus amyloliquefaciens SRCM101368)로 기탁하였다.
실시예 2. 세포외 효소의 활성 측정
미생물이 생성하는 다양한 효소들은 발효과정을 통해 콩이 가지는 단백질, 지질, 이소플라본 등을 아미노산, 지방산, 이소플라본 아글리콘 등으로 분해하여 발효식품의 풍미를 향상시키고 기능성을 가지는 2차 대사산물을 생성한다고 알려져 있어 대표적인 세포 외 분해 효소인 단백질 분해효소와 다당류 분해효소, 섬유소 분해효소의 활성을 확인하였다. 각각의 효소 반응물질인 스킴밀크(skim milk), CMC(carboxymethyl cellulose) 및 전분(starch)를 이용한 배지를 이용하여 웰 확산 방법을 이용하여 효소활성을 확인하였다. 각종 효소의 활성이 검증되는 25℃에서 24시간 반응한 후 스킴밀크, CMC 및 전분의 분해능을 효소기질반응환(clear zone)의 직경을 측정하여 확인하였다. 그 결과, 하기 표 5에 개시한 바와 같이, SRCM101368 균주는 단백질, 전분 및 섬유소 분해효소인 프로테아제, 셀룰라아제 및 아밀라아제의 활성이 우수하였으며, 특히 셀룰라아제 및 아밀라아제의 활성이 매우 높은 균주로 나타났다.
세포외 효소 활성 검정
균주명 동정 효소활성(diameter, mm)
프로테아제 셀룰라아제 아밀라아제
SRCM101368 B. amyloliquefaciens 1.5 2.1 2.1
SRCM101379 B. subtilis 1.4 1.8 1.9
SRCM101396 B. subtilis 1.3 1.0 1.18
실시예 3. 혈전분해효소 활성 측정
SRCM101368 균주의 세포 외로 분비되는 혈전분해 효소의 활성을 확인하기 위하여 피브린 플레이트 방법을 이용하였다. 그 결과, 하기 표 6에 개시한 바와 같이 SRCM101368 균주는 혈전분해효소 활성이 20.0mm로 양성대조구인 우로키나아제(19.0mm) 보다는 높은 활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 고지방식과 비만 등으로 야기되는 혈전증(thrombosis) 치료에는 플라스민을 절단하는 우로키나아제, tPA(tissue type plasminogen activator) 등의 효소가 사용되나 고가로 판매되며, 그 부작용으로 인하여 미생물에 의한 대체 혈전용해제에 대한 관심이 높아지는 추세에 부합하는 기존의 혈전용해제 대체에 새로운 가능성을 보여 주었다.
혈전 용해 활성 분석
균주명 동정 혈전분해효소 활성
(halo size(mm), Mean±SD)
SRCM101368 B. amyloliquefaciens 20.0±0.3
SRCM101379 B. subtilis 0.97±0.2
SRCM101396 B. subtilis 12.3±0.1
우로키나아제 - 19.0±0.1
실시예 4. 용혈성 및 유해효소 생성 여부 확인
용혈은 자연적으로 적혈구가 파괴에 의해 일어나기도 하지만 유전적 결함, 화학물질 및 미생물에 의한 독성물질에 의해 비정상적으로 일어나기도 한다. 특히, 미생물 감염에 의한 용혈성은 혈전성 혈소판 감소증이나 용혈성요독증후군과 같은 질병으로 이어질 수 있어 SRCM101368 균주의 용혈성을 분석하였다. 용혈성은 적혈구 막을 파괴하여 황달 및 빈혈을 유발하는 β-헤몰리시스(γ-hemolysis)와 적혈구 막을 파괴하지 않고 헤모글로빈을 메트헤모글로빈으로 산화시키는 α-헤몰리시스, 용혈현상이 없는 γ-헤몰리시스로 나눠볼 수 있는데, 본 발명의 SRCM101368 균주는 가용성 헤몰리신(hemolysin)에 의한 적혈구 막 파괴를 일으키는 주로 병원성 미생물이 나타내는 β-헤몰리시스가 아님을 확인할 수 있었다. 또한, 장내 미생물이 생산하는 트립토파나아제(tryptophanase), β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase) 및 우레아제(urease) 등은 대장암을 유발하는 것으로 알려져 있어, SRCM101368의 안전성 확보를 위하여 트립토파나아제, β-글루쿠로니다아제 및 우레아제의 생성 여부를 확인한 결과, 모두 생성하지 않는 것으로 확인되어 SRCM101368 균주의 안정성을 확인할 수 있었다(표 7).
혈성 및 유해효소 생성 여부 확인
균주명 동정 용혈성 유해효소
트립토파나아제 β-글루쿠로니다아제 우레아제
SRCM101368 B. amyloliquefaciens α- hemolysis - - -
SRCM101379 B. subtilis α-hemolysis - - -
SRCM101396 B. subtilis α-hemolysis - - -
-; 음성 효과, +; 양성 효과
실시예 5. 식중독 관련 유해 병원성 미생물에 대한 항균활성
구토와 설사 등을 유발하는 식중독 관련 병원성 미생물 3종에 대한 항균활성을 웰 확산 방법을 이용하여 확인하였다. 그 결과, SRCM101368 균주는 식품유해 미생물 3종인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) KCCM40935, 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) KCCM43155 및 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) KCCM11234에 대해 높은 항균 활성을 보이고 있어 식중독 유해 미생물 제어에 효과가 있을 것으로 분석되었다(표 8).
식품유해미생물에 대한 항균 활성 측정 결과
균주명 동정 항균활성(diameter, mm)
바실러스
세레우스
KCTC 3624		 리스테리아 모노사이토제네스 KCCM43155 에스케리키아 콜라이 KCCM11234
SRCM101368 B. amyloliquefaciens 13.0 14.9 14.9
SRCM101379 B. subtilis - 13.0 13.0
SRCM101396 B. subtilis - - -
-; 반응 없음
실시예 6. 바실러스 세레우스 독소 유전자 분석을 통한 안전성 분석
SRCM101368 균주에 대하여 식품 유해균인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)의 설사형 독소 및 구토형 독소 유전자 보유 여부를 확인하여 균주의 안전성을 확인하였다. PCR 분석을 통하여 바실러스 세레우스 독소 유전자 6종에 대하여 확인한 결과, 6종의 독소를 생성하는 유전자가 없는 것으로 나타나 식중독에 대한 안전성을 지니고 있어 식품 및 식품첨가제 등과 같은 다양한 응용 분야에 이용 가능함을 확인하였다(표 9).
바실러스 세레우스 독소 유전자 보유 여부 확인
균주명 동정 독소 유전자
hblC nheA entFM cytK ces bceT
SRCM101368 B. amyloliquefaciens ND ND ND ND ND ND
SRCM101379 B. subtilis ND ND ND ND ND ND
SRCM101396 B. subtilis ND ND ND ND ND ND
ND; 검출 안됨
실시예 7. 바이오제닉 아민 생성여부 확인
식품에 바이오제닉 아민이 다량 존재할 경우 바이오제닉 아민은 메스꺼움, 구토, 고혈압, 두통과 같은 증상을 발생할 수 있다고 연구결과가 보고되기도 하였다. 바이오제닉 아민의 분포도 조사를 한 결과, 한국인의 주된 식재료인 고추장에서는 히스타민은 206.1~952(평균 569.4)mg/kg, 티라민은 284.4~1430.7(평균 669.5)mg/kg으로 한국인들이 주로 섭취하는 34종의 식품 가운데 평균적으로 높았다. 따라서 장류에서 분리한 균주의 바이오제닉 아민의 생성 여부를 확인하여 산업적으로 사용가능한 바이오제닉 아민-저생성 균주를 확인하고자 하였다.
SRCM101368 균주를 대상으로 대표적인 두통과 구토 등을 유발하는 바이오제닉 아민인 티라민과 히스타민의 생성 여부를 확인한 결과, 티라민은 생성하지 않았으며(표 10), 히스타민은 3.53ppm 생성하여 상업적으로 사용할 경우 적은 바이오제닉 아민을 생성 가능할 것으로 사료된다.
선별 균주의 바이오제닉 아민 생성능 분석
균주명 동정 바이오제닉 아민 생성(ppm)
히스타민 티라민
SRCM101368 B. amyloliquefaciens 3.53 ND
SRCM101379 B. subtilis 3.78 ND
SRCM101396 B. subtilis 3.71 ND
ND; 검출 안됨
실시예 8. 바이오제닉 아민 합성 유전자 분석
SRCM101368 균주의 바이오제닉 아민에 대한 안전성을 확인하기 위하여 바이오제닉 아민 합성에 관여하는 유전자를 보유하는지 확인하였다. 티라민과 히스타민 합성에 관여하는 것으로 알려진 티로신 디카르복시라제(tdc)와 히스타민 디카르복시라제(hdc) 유전자의 유무를 확인한 결과 SRCM101368 균주는 상기 유전자를 보유하지 않음을 확인하였다(표 11).
바이오제닉 아민 합성 관련 유전자 분석
균주명 동정 tdc hdc
SRCM101368 B. amyloliquefaciens ND ND
SRCM101379 B. subtilis ND ND
SRCM101396 B. subtilis ND ND
ND; 검출 안됨
실시예 9. 내산성 , 내담즙성 , 내열성 확인
사람의 소화기관을 안정적으로 많은 수의 균이 살아서 장내까지 도달하기 위해 가져야 할 프로바이오틱스 특성 중 낮은 pH의 위액과 미생물의 세포막에 영향을 주어 사멸하게 하는 담즙산에 대한 내성이 필요하여 SRCM101368 균주를 대상으로 내산성 및 내담즙성과 제품화 과정의 고온의 처리 조건을 이겨낼 수 있는지 내열성 실험을 진행하였다. 그 결과, 도 3 내지 도 5에 개시한 바와 같이 비교대조구인 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SRCM101379 및 SRCM101396 균주와 비교하였을 때, SRCM101368 균주의 경우 pH 2.0까지도 50.7%의 생존율을 유지하며, 담즙산염 1.0%에서도 69.0%의 생존율을 유지하여 프로바이오틱스로서 섭취 시 안정적으로 장내까지 많은 생균이 도달할 것으로 사료된다. 또한, 내열성 결과에서는 80℃까지 60.9%의 생존율이 확인되어 고온의 처리과정에서도 사멸하지 않고 많은 수의 생균이 있을 것으로 사료되어 프로바이오틱스 제품화에 적합할 것으로 보여진다.
실시예 10. 항균 생리활성 물질 합성 관련 유전자 분석
고초균은 병원성 세균을 억제하는 항균 펩타이드를 합성한다고 잘 알려져 있다. 대표적으로 고초균이 생산하는 바실로마이신 D(bmyA), 펜기신(fenD), 이투린 A(ituA), 설팩틴(surA) 및 즈위터미신 A(zwiA) 생합성 유전자를 대상으로 SRCM101368 균주가 보유하고 있는지 확인한 결과, 하기 표 12에 개시한 바와 같이 SRCM101368 균주는 itudA 및 surA 유전자를 보유하고 있어 이투린 A 및 설팩틴을 합성할 것으로 사료되었다.
항균 생리활성 물질 합성 관련 유전자 분석
균주명 동정 독소 유전자
bmyA itudA surA fenD zwiA
SRCM101368 B. amyloliquefaciens ND + + ND ND
SRCM101379 B. subtilis ND ND ND ND ND
SRCM101396 B. subtilis ND ND ND ND ND
ND; 검출 안됨, +; 검출됨
실시예 11. 장내 상피세포 부착능 측정
SRCM101368 균주의 섭취시 장내에 머물며 장내 유해미생물 억제 등 장내 환경 개선에 도움을 줄 수 있는지 확인하기 위하여 장내 상피세포주인 CCD-18Co 세포를 이용하여 장내 상피세포 부착능을 확인하였다. 그 결과, 하기 표 13에 개시한 바와 같이 SRCM101368 균주는 77%의 부착율을 보였으며, 이는 프로바이오틱스 활성이 우수하다고 알려진 락토바실러스 람노서스( Lactobactillus rhamnosus ) GG 균주의 부착율(88%)과 비슷한 수준으로 확인되어 SRCM101368 균주 섭취 시 장내로 도달하여 장내 상피세포에 부착하여 장내 환경 개선에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다.
SRCM101368의 장 상피세포 CCD-18Co 세포 부착능
균주명 동정 부착율(%)
SRCM101368 B. amyloliquefaciens 77
SRCM101379 B. subtilis 55
SRCM101396 B. subtilis 72
LGG L. rhamnosus GG 88
한국미생물보존센터(국외) KCCM12260P 20180511
<110> Microbial Institute for Fermentation Industyry <120> Bacillus amyloliquefaciens SRCM101368 strain having gene synthesizing antimicrobial compound and probiotics properties and uses thereof <130> PN18359 <160> 17 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1503 <212> DNA <213> Bacillus amyloliquefaciens <400> 1 gactagagtt tgattctggc tcaggacgaa cgctggcggc gtgcctaata catgcaagtc 60 gagcggacag atgggagctt gctccctgat gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg 120 gtaacctgcc tgtaagactg ggataactcc gggaaaccgg ggctaatacc ggatggttgt 180 ttgaaccgca tggttcagac ataaaaggtg gcttcggcta ccacttacag atggacccgc 240 ggcgcattag ctagttggtg aggtaacggc tcaccaaggc gacgatgcgt agccgacctg 300 agagggtgat cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag 360 tagggaatct tccgcaatgg acgaaagtct gacggagcaa cgccgcgtga gtgatgaagg 420 ttttcggatc gtaaagctct gttgttaggg aagaacaagt gccgttcaaa tagggcggca 480 ccttgacggt acctaaccag aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac 540 gtaggtggca agcgttgtcc ggaattattg ggcgtaaagg gctcgcaggc ggtttcttaa 600 gtctgatgtg aaagcccccg gctcaaccgg ggagggtcat tggaaactgg ggaacttgag 660 tgcagaagag gagagtggaa ttccacgtgt agcggtgaaa tgcgtagaga tgtggaggaa 720 caccagtggc gaaggcgact ctctggtctg taactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg 780 agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag 840 ggggtttccg ccccttagtg ctgcagctaa cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg 900 tcgcaagact gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt 960 ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac atcctctgac aatcctagag 1020 ataggacgtc cccttcgggg gcagagtgac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt 1080 cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgatcttagt tgccagcatt 1140 cagttgggca ctctaaggtg actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca 1200 aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta caatggacag aacaaagggc 1260 agcgaaaccg cgaggttaag ccaatcccac aaatctgttc tcagttcgga tcgcagtctg 1320 caactcgact gcgtgaagct ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat 1380 acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagt 1440 cggtgaggta acctttatgg agccagccgc cgaaggtggg acagatgatt ggggtgaagt 1500 cgt 1503 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tacggytacc ttgttacgac tt 22 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gatggtattt cktatga 17 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 caaacaccag catcttc 17 <210> 6 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 caaacaccat cttc 14 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 acatagtcaa ccatrttgaa 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gaaggacacg gcagagagtc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 cgctgatgac tgttcatgct 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 tttggcagca ggagaagttt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gctgtccgtt ctgctttttc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gatgcgatct ccttggatgt 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 atcgtcatgt gctgcttgag 20 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 acagtatgga ggcatggtc 19 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 ttccgccact ttttcagttt 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 ttgggagaat atacagctct 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 gaccttttga aatgggcgta 20

Claims (5)

  1. 내산성, 내담즙성, 내열성, 프로테아제, 셀룰라제 및 아밀라제 분비능, α-용혈 활성, 혈전분해 활성, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 및 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에 대한 항균활성 및 장내 상피세포 부착능이 있고, 이투린 A(iturin A) 및 설팩틴(surfactin)을 합성하는 유전자를 보유하면서, 티라민, 트립토파나아제(tryptophanase), β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase) 및 우레아제(urease)를 생성하지 않는, 기탁번호가 KCCM12260P인 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) SRCM101368 균주.
  2. 삭제
  3. 제1항의 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스 제제.
  4. 제1항의 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 장류 제조용 스타터(starter) 조성물.
  5. 제1항의 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 또는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에 대한 항균용 조성물.
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