KR20170130341A - 항균 활성을 나타내는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 균주 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD 7-7 균주(기탁번호 KACC 92071P)는 청국장 발효시에 접종할 경우 점질물을 많이 생성시키고, 단백질 분해효소(protease), 아밀라아제(amylase) 활성 및 아미노태 질소 함량이 높고, 발효과정 중 발생하는 이취 성분이 낮으므로 발효 특성이 우수하고, 다양한 미생물에 항균 활성을 가지며, 식중독을 유발하는 바실러스 세레우스와의 공동 배양시 바실러스 세레우스의 생장을 저해함으로써 품질이 우수하고 안전한 발효식품 제조에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

항균 활성을 나타내는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 균주 및 이의 용도{Bacillus amyloliquefacience having antibacterial activity and uses thereof}
본 발명은 항균 활성을 나타내는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
대두는 우리나라 전통 발효식품 원료 및 식물유래 기능성 소재로서 다양하게 이용되어 왔다. 대두는 이소플라본(isoflavone), 사포닌(saponin), 피트산(phytic acid), 올리고-사카라이드(oligo-saccharides) 등과 같은 기능성 성분을 많이 함유하고 있다. 발효 중 미생물 유래 효소들에 의해 콩의 섬유질 성분과 세포내 당류 및 단백질 등이 분해되어 소화율이 향상되며, 아마이드(amide), 펩톤(peptone), 폴리글루타메이트(polyglutamate), 폴리펩타이드(polypeptide) 등과 같은 생리활성물질이 생성되어 혈압 강하, 혈전 용해능, 항암 효과, 항산화 등이 증가되는 것으로 알려졌다.
콩 발효식품에서 영양 및 품질을 결정하는 가장 중요한 요인은 관여하는 미생물의 종류이며, 균주 및 발효조건에 따라 다양한 생리활성물질이 생성되어 기능성이 달리 나타난다. 대두 발효식품인 청국장 또는 된장의 메주를 발효시킬 경우, 볏짚에 존재하는 고초균이 이용되어 왔다. 볏짚 유래의 바실러스균(Bacillus sp.)은 다양한 효소(protease, amylase 및 cellulase 등)를 분비하여 생리활성을 가지는 다양한 대사물질을 생산한다. 분비되는 단백질 분해효소(protease)는 카제인 분해능, 젤라틴 분해능의 특성을 지니고 발효 중 특유의 맛과 향을 생성하는 역할을 한다. 콩 발효식품의 이취는 바실러스균으로부터 생성되는 알킬피라진(alkylpyrazine), 암모니아 화합물 및 함황화합물, 그 외에도 수분, 염도 및 온도 등과 같은 미생물 생육 환경에 따라 결정되는 것으로 알려져 있다. 불쾌취를 저감화시키기 위해 재료 성분을 변화시키거나 불쾌취 원인 화합물의 생성 정도가 낮은 발효 균주를 이용한 콩 발효물 제조에 대한 연구가 보고된 바 있다. 콩 발효물의 점질물은 바실러스균이 대두의 당질과 단백질들을 기질로 하여 합성한 레반(levan)형 프룩탄(fructan)과 폴리글루타메이트(polyglutamate)에 의하여 생성된다.
바실러스균 균주는 가수분해 효소의 생산성이 우수하여 산업용 효소 생산균으로 개발된 예가 많으며, 청국장에서 유래한 바실러스 리케니포르미스(B. licheniformis)의 베타-갈락토시다아제(β-galactosidase) 생산 및 단백질 분해효소 생산, 혈전용해 효소를 생산하는 바실러스 아밀로리퀴페시언스(B. amyloliquefaciens) 및 바실러스 서브틸리스(B. subtilis), 면역증강 활성이 우수한 균주로 바실러스 푸미루스(B. pumilus)가 보고되었다. 또한 균주를 스타터(starter)로 이용하여 콩 발효물의 품질을 개선하는 연구도 보고되었으며, 스타터로 이용되는 바실러스균은 포자 형성균으로 토양이나 물 등에서 자라며 대부분이 유기물을 분해하는 특성을 가지고 그 유용성과 안전성이 널리 인정되어 있다.
바실러스 세레우스(Bacillus cereus)는 그람 양성 간균으로, 사슬 형태로 배열하며, 편모가 있어 운동성이 있다. 포자를 형성하여 열에 대한 저항성이 강하고 산소 조건에서 잘 증식하는 호기성으로 7~49℃에서 발육하며, 최적 온도는 28~35℃이다. 다른 바실러스 속과 구별되는 특징으로는 β-용혈 형상을 가지고 있고, 레시틴 분해효소(lecithinase)를 생성하여 난황(egg yolk) 반응에서 집락주변이 유백색을 띄는 양성을 나타낸다.
바실러스 세레우스는 토양세균의 일종이므로 토양, 먼지, 하수 등 자연계에 널리 분포하여 식물에 오염되어 부패나 식중독을 일으키며, 동물에 대해서는 기회감염을 일으킨다. 검출되는 비율은 높으나 상대적으로 식중독 발생빈도는 낮다. 그러나 영국 등 유럽에서는 발생빈도가 높아 오래 전부터 주목을 받아 왔으며, 최근 우리나라에서도 각종 식품에서 검출되어 규제 대상이 되고 있다. 식중독을 막기 위해서는 식품에서 이 균(또는 포자)을 사멸시키거나, 발아를 억제시키고 증식을 방지해야 한다. 바실러스 세레우스 포자의 열 저항성은 100℃에서 1.2~7.5분으로 보고되고 있다.
바실러스 세레우스는 두 종류의 식중독을 일으킨다고 알려져 있다. 첫 번째는 식품에 바실러스 세레우스 균이 성장하여 생산한 독소(cereulide)를 섭취하여 발생하는 구토형 식중독이고, 다른 하나는 바실러스 세레우스 세균의 생장 세포 또는 포자를 섭취한 후 인체의 장 내에서 장독소(enterotoxin)가 생산되어 발생하는 설사형 식중독이다(FEMS Microbiol Rev. 2008 Jul;32(4): 579-606).
바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefacience)는 포자를 형성하는 호기성 세균으로, 단백질 및 전분 분해 효소 활성이 우수한 것으로 알려져 있으며, 천연 항균 단백질인 Barnase(ribonuclease)를 생산한다. 또한 식품 원재료로 사용가능한 미생물이다.
본 연구자들은 바실러스 세레우스 저해 활성 및 발효특성이 우수한 균주를 개발하기 위해 연구하던 중, 쌀된장에서 분리한 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주가 청국장 발효시에 접종할 경우 점질물을 많이 생성시키고, 단백질 분해효소(protease), 아밀라아제(amylase) 활성 및 아미노태 질소 함량이 높고, 발효과정 중 발생하는 이취 성분이 낮으므로 발효 특성이 우수하고, 다양한 미생물에 대한 항균 활성이 우수하며, 식중독을 유발하는 바실러스 세레우스와의 공동 배양시 바실러스 세레우스의 생장을 저해하는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
FEMS Microbiol Rev. 2008 Jul;32(4): 579-606.
본 발명의 목적은 항균 활성을 나타내는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기탁번호 KACC 92071P로 수탁된 항균 활성을 나타내는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 발효용 스타터(starter)를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주 또는 본 발명의 발효용 스타터를 이용하여 생산된 발효식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주 또는 본 발명의 발효용 스타터를 접종하는 단계를 포함하는 발효식품 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 기탁번호 KACC 92071P로 수탁된 항균 활성을 나타내는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주를 유효성분으로 함유하는 항균용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 기탁번호 KACC 92071P로 수탁된 항균 활성을 나타내는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주를 유효성분으로 함유하는 항균용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 기탁번호 KACC 92071P로 수탁된 항균 활성을 나타내는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주를 유효성분으로 함유하는 항균용 사료첨가제을 제공한다.
본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주는 식중독을 유발하는 바실러스 세레우스와의 공동 배양시 바실러스 세레우스의 생장을 저해하고, 각종 미생물에 대한 항균활성이 우수하며, 청국장 발효시에 접종할 경우 점질물을 많이 생성시키고, 단백질 분해효소(protease), 아밀라아제(amylase) 활성 및 아미노태 질소 함량이 높고, 발효과정 중 발생하는 이취 성분이 낮으므로 발효특성 및 품질이 우수하고 안전한 발효식품 제조에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefacience) RD7-7 균주의 형태를 주사전자 현미경으로 관찰한 도이다.
도 2는 실시간 PCR(real-time PCR)의 표준곡선을 나타낸 도이다.
도 3은 바실러스 세레우스 및 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주의 공동 배양액에서 바실러스 세레우스의 groEL 및 nheA 유전자의 역전사 PCR(reverse transcription polymerase chain reaction) 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 바실러스 세레우스 및 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주의 공동 배양액에서 바실러스 세레우스의 groEL 및 nheA 유전자의 정량적 실시간 PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction) 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 바실러스 세레우스 및 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주의 공동 배양액에서 바실러스 세레우스의 AtpB 단백질의 발현량을 웨스턴 블롯팅(western blotting)으로 나타낸 도이다.
도 6은 바실러스 세레우스 및 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주를 비율을 달리하여 접종한 청국장의 발효상태를 나타낸 도이다.
도 7은 바실러스 세레우스 및 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주를 공동 접종한 청국장 발효물에서 바실러스 세레우스의 AtpB 단백질의 발현량을 웨스턴 블롯팅(western blotting)으로 나타낸 도이다.
도 8은 다양한 바실러스균을 접종한 콩발효물의 시료추출액에서 미생물수를 측정한 결과를 나타낸 도이다:
대조군: 바실러스를 접종하지 않은 실험군;
HJ18-4: 바실러스 서브틸리스 HJ18-4를 접종한 실험군;
RD7-7: 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7을 접종한 실험군;
HJ5-2: 바실러스 아밀로리퀴페시언스 HJ5-2를 접종한 실험군; 및
HJ39-5: 바실러스 아밀로리퀴페시언스 HJ39-5를 접종한 실험군.
도 9는 다양한 바실러스균을 접종한 콩발효물의 시료추출액에서 단백질 분해효소(protease) 및 아밀라아제 활성 측정 결과를 나타낸 도이다:
대조군: 바실러스를 접종하지 않은 실험군;
HJ18-4: 바실러스 서브틸리스 HJ18-4를 접종한 실험군;
RD7-7: 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7을 접종한 실험군;
HJ5-2: 바실러스 아밀로리퀴페시언스 HJ5-2를 접종한 실험군; 및
HJ39-5: 바실러스 아밀로리퀴페시언스 HJ39-5를 접종한 실험군.
도 10은 다양한 바실러스균을 접종한 콩발효물의 시료추출액에서 환원당 함량 측정 결과를 나타낸 도이다:
대조군: 바실러스를 접종하지 않은 실험군;
HJ18-4: 바실러스 서브틸리스 HJ18-4를 접종한 실험군;
RD7-7: 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7을 접종한 실험군;
HJ5-2: 바실러스 아밀로리퀴페시언스 HJ5-2를 접종한 실험군; 및
HJ39-5: 바실러스 아밀로리퀴페시언스 HJ39-5를 접종한 실험군.
도 10은 다양한 바실러스균을 접종한 콩발효물의 시료추출액에서 아미노태 질소 함량 측정 결과를 나타낸 도이다:
대조군: 바실러스를 접종하지 않은 실험군;
HJ18-4: 바실러스 서브틸리스 HJ18-4를 접종한 실험군;
RD7-7: 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7을 접종한 실험군;
HJ5-2: 바실러스 아밀로리퀴페시언스 HJ5-2를 접종한 실험군; 및
HJ39-5: 바실러스 아밀로리퀴페시언스 HJ39-5를 접종한 실험군.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 기탁번호 KACC 92071P로 수탁된 항균 활성을 나타내는 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefacience) RD7-7 균주를 제공한다.
상기 균주는 쌀된장으로부터 분리된 것이 바람직하나, 이에 한정하지 아니한다.
상기 항균 활성은 리스테리아균(Listeria monocytogenes), 대장균(Escherichia coli), 포도상구균(Staphylococcus aureus), 살모넬라 엔테릭(Salmonella enteric) 및 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나에 대한 것임이 바람직하며, 본 발명의 구체적인 실시예에 의하면 바실러스 세레우스인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주는 각종 미생물에 대한 항균 활성이 우수하며(표 1 참조), 식중독을 유발하는 바실러스 세레우스와 공동 배양할 경우 바실러스 세레우스의 groEL 및 nheA 유전자의 발현 및 AtpB 단백질의 발현을 감소시키고(도 3 내지 도 5 참조), 청국장 발효시 점질물을 많이 생성시키며(도 6 참조), 단백질 분해효소(protease), 아밀라아제(amylase) 활성 및 아미노태 질소 함량이 높고(도 9 내지 11 참조), 발효과정 중 발생하는 이취 성분이 낮으므로(표 9) 안전성 및 품질이 우수한 발효식품제조에 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 발효용 스타터(starter)를 제공한다.
상기 발효용 스타터란 발효에 관여하는 유산균 또는 세균 등을 포함하는 미생물, 이의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 포함하는 제제 또는 조성물을 의미하며, 발효용 스타터는 발효식품 등의 생산시 첨가하여 발효식품에서 생장할 수 있는 미생물 또는 우점종으로 생장할 수 있는 미생물을 제공하기 위하여 사용된다. 상기 발효용 스타터를 사용하여 발효식품을 제조하는 경우, 상기 발효용 스타터에 포함된 미생물에 의하여 발효식품의 품질을 일정하게 조절하거나, 발효의 속도 또는 단계를 조절할 수 있으며, 특정한 목적을 달성한 발효 식품을 제조할 수 있다. 또한, 상기 발효용 스타터에는 통상적으로 사용되는 첨가제를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주는 식중독을 유발하는 바실러스 세레우스와의 공동 배양시 바실러스 세레우스의 생장을 저해하고, 각종 미생물에 대한 항균활성이 우수하며, 청국장 발효시에 접종할 경우 점질물을 많이 생성시키고, 단백질 분해효소, 아밀라아제 활성 및 아미노태 질소 함량이 높고, 발효과정 중 발생하는 이취 성분이 낮으므로 발효특성 및 품질이 우수하고 안전한 발효식품 제조에 있어서 발효용 스타터로 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주 또는 본 발명의 발효용 스타터를 이용하여 생산된 발효식품을 제공한다.
상기 발효식품이란, 유산균이나 효소 등 미생물을 한가지 또는 둘 이상 첨가하고 상기 미생물의 발효 작용을 이용하여 만든 식품을 의미하며, 상세하게는 식품 기재에 발효식품용 종균을 첨가하고 숙성시켜 제조하는 식품을 의미한다. 상기 발효식품으로는 주류, 빵류, 김치, 젓갈, 된장, 간장, 치즈, 버터, 요구르트 등 비살균 개방형 발효식품 모두가 포함된다.
상기 발효식품은 청국장일 수 있으며, 상기 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주 또는 발효용 스타터를 첨가하여 제조된 청국장의 경우, 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주에 의하여 식중독을 유발하는 바실러스 세레우스의 생장이 저해되고, 단백질 분해효소, 아밀라아제 효소 활성 및 아미노태 질소 함량이 높으므로 청국장의 안전성, 맛 및 풍미가 향상된다.
상기 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주 또는 발효용 스타터는 콩을 포함한 식품원재료를 발효시켜 제조되는 어떠한 식품 분야에도 적용될 수 있다.
상기 발효식품은 식품에 상기 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주 또는 발효용 스타터를 첨가하고 숙성시켜 제조할 수 있으며, 이때 균주의 사용량은 발효식품의 종류 및 종균의 종류에 따라 적절히 조절하는 것이 좋다.
본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주는 식중독을 유발하는 바실러스 세레우스와의 공동 배양시 바실러스 세레우스의 생장을 저해하고, 각종 미생물에 대한 항균활성이 우수하며, 청국장 발효시에 접종할 경우 점질물을 많이 생성시키고, 단백질 분해효소, 아밀라아제 활성 및 아미노태 질소 함량이 높고, 발효과정 중 발생하는 이취 성분이 낮으므로 발효특성 및 품질이 우수하고 안전한 발효식품 제조에 있어서 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주 또는 본 발명의 발효용 스타터를 접종하는 단계를 포함하는 발효식품 제조방법을 제공한다.
상기 발효식품 제조방법은 청국장 제조방법일 수 있으며, 상기 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주 또는 발효용 스타터를 접종하는 단계를 포함하는 청국장 제조방법의 경우, 대두를 20°C에서 18시간 침지한 후 100℃에서 2시간 증자하는 단계; 상기 증자된 콩을 40℃ 이하가 되도록 냉각하고, 대두에 상기 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주 또는 발효용 스타터선별균주를 접종하고 혼합하는 단계; 및 습도 70%, 온도 37℃의 배양기에서 36시간 발효시키는 단계를 포함하는 방법으로 수행할 수 있다.
본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주는 식중독을 유발하는 바실러스 세레우스와의 공동 배양시 바실러스 세레우스의 생장을 저해하고, 각종 미생물에 대한 항균활성이 우수하며, 청국장 발효시에 접종할 경우 점질물을 많이 생성시키고, 단백질 분해효소, 아밀라아제 활성 및 아미노태 질소 함량이 높고, 발효과정 중 발생하는 이취 성분이 낮으므로 발효특성 및 품질이 우수하고 안전한 발효식품 제조방법에 있어서 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 기탁번호 KACC 92071P로 수탁된 항균 활성을 나타내는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주를 포함하는 항균용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주는 쌀된장으로부터 분리된 것이 바람직하나, 이에 한정하지 아니한다.
상기 항균 활성은 리스테리아균(Listeria monocytogenes), 대장균(Escherichia coli), 포도상구균(Staphylococcus aureus), 살모넬라 엔테릭(Salmonella enteric) 및 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 그 이상에 대한 항균 활성인 것이 바람직하며, 본 발명의 구체적인 실시예에 의하면 바실러스 세레우스인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주를 포함하는 유효성분을 0.1 내지 99.9 중량%로 함유하고, 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다.
비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여시 피부외용 또는 복강내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사 방식을 선택하는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 피부외용으로 사용한다.
본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주를 포함하는 유효성분의 양을 기준으로 0.01 내지 1000 mg이고, 바람직하게는 30 내지 500 mg/kg이고, 더욱 바람직하게는 50 내지 300 mg/kg이며, 하루 1 내지 6회 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 단독으로 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 기탁번호 KACC 92071P로 수탁된 항균 활성을 나타내는 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefacience) RD7-7 균주를 포함하는 항균용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강기능식품 100 중량부당 0.01 ~ 0.04 중량부, 구체적으로는 약 0.02 ~ 0.03 중량부 범위에서 선택할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강식품 100 중량부 당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명은 기탁번호 KACC 92071P로 수탁된 항균 활성을 나타내는 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefacience) RD7-7 균주를 포함하는 항균용 사료첨가제를 제공한다.
상기 사료첨가제는 항균 활성을 가지므로 가금류, 가축 등에게 꾸준히 섭취하게 함으로써 세균성 질환을 예방할 수 있고, 이미 발생한 세균성 질환을 개선시킬 수 있다. 사료는 영양가, 주성분, 유통, 수분 함량 배합상태 및 가공형태 등에 따라 여러 가지로 분류할 수 있으며, 사료는 조사료, 농후사료, 보충사료, 단백질사료, 녹말사료, 지방질사료 또는 섬유질사료가 사용가능하다.
상기 사료첨가제는 추가적으로 허용되는 담체를 함유할 수 있으며, 예를 들어, 상기 사료첨가제를 그대로 또는 공지의 담체, 안정제 등을 가할 수 있다. 또한, 필요에 따라 비타민, 아미노산류, 미네랄 등의 각종 양분, 항산화제, 항생물질, 항균제 및 기타의 첨가제 등을 가할 수도 있으며, 그 형상으로서는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등의 적당한 상태일 수 있다. 본 발명의 사료첨가제는 단독으로 또는 사료에 혼합하여 공급할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 콩발효식품 유래 발효미생물의 다양한 항균 스펙트럼 확인
콩발효식품에서 유래한 발효미생물들의 항균 스펙트럼을 확인하기 위하여, 리스테리아균(Listeria monocytogenes), 대장균(Escherichia coli), 포도상구균(Staphylococcus aureus), 살모넬라 엔테릭(Salmonella enteric) 및 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대하여 아가 스팟 어세이(Agar spot assay)를 실시하였다.
<1-1> 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주 동정 방법
Bacillus amyloliquefaciens RD7-7의 균주동정은 16r DNA Sequencing을 통해 분석하였다. 16S rDNA 유전자 염기서열 분석은 균주의 크로모좀 DNA(chromosomal DNA)를 DNA 분리 키트(GenEX genomic Sx DNA kit, GeneAll Biotechnology Co., 서울, 대한민국)를 이용하여 제조사의 설명에 따라 추출하였으며, 27F(5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3', 서열번호 13) 및 1492R(5'-GGATACCTTGTTACGACTT-3', 서열번호 14) 프라이머를 이용하여 분리 균주의 16S rDNA 유전자 단편을 중합효소연쇄반응(PCR)으로 증폭한 후, 염기서열을 분석하였다(Genocell, 대전, 대한민국). 그 결과를 NCBI GenBank database(http://ncbi.nlm.nih.gov)의 염기서열과 비교하여 계통분류학적 유연관계를 확인하였다.
<1-2> 아가 스팟 어세이
식중독 유발균(OD: 0.4)이 0.5%의 농도로 포함된 한천배지(Nutrient agar)를 페트리디쉬에 분주하여 실온에서 굳힌 후, 콩발표식품에서 분리한 선발균주(OD: 0.4)를 10 ㎕씩 배지에 점적하고, 37℃에서 24 내지 48시간 배양한 후 생성된 클리어 존(Clear Zone)의 직경을 재어 활성도(-, not shown; +, 0.30 mm; ++, 0.31-0.5 mm; 및 +++, 0.51-0.80 mm)로 나타내었다.
그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이 발효미생물들의 항균 활성을 확인할 수 있었으며, 바실러스 세레우스에 대한 항균 활성이 우수한 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주를 선별하였고, 상기 균주의 형태를 도 1에 나타내었다(도 1).
이름 종 항균 활성
R11 R22 R33 R44 R115
RD5-4 Bacillus amyloliquefaciens subsp .
plantarum FZB42(T)		 + + + +
RD7-5 Bacillus tequilensis NRRL B-41771(T) +++ ++ + ++
RD7-7 Bacillus amyloliquefaciens subsp . amyloliquefaciens DSM 7(T) ++ ++ + ++ +++
RD12-3 Bacillus amyloliquefaciens subsp . amyloliquefaciens DSM 7(T) - - - - -
RD13-6 Bacillus subtilis subsp .
inaquosorum BGSC 3A28(T)		 - - - - -
RD13-9 Bacillus methylotrophicus CBMB205(T) - - - - -
HJ11-1 Bacillus subtilis strain ZT-4-5 + - + + -
HJ11-3 Bacillus subtilis strain BRZ6 ++ - + + +
1리스테리아균(steria monocytogenes), 2대장균(Escherichia coli), 3포도상구균(Staphylococcus aureus), 4살모넬라 엔테릭(Salmonella enteric) 및 5바실러스 세레우스(Bacillus cereus)
< 실험예 1> 바실러스 아밀로리퀴페시언스 ( Bacillus amyloliquefaciens ) RD7-7 균주의 바실러스 세레우스(Bacillus cereus KACC10004) 생장 억제 효과 확인
<1-1> 균수 측정을 통한 바실러스 세레우스 균주의 생장 억제 확인
바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주의 바실러스 세레우스 생장 저해 효과를 확인하기 위하여, 두 균을 공동배양하여 균수 측정을 통해 이를 확인하였다.
구체적으로, 바실러스 세레우스 0.5% 및 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 0.125%, 0.25%, 0.5% 및 1%를 LB 배지(Luria-Bertani broth) 5 ㎖에 혼합 접종하여 37℃에서 24 시간 배양한 후, 멸균 식염수(saline)에 10진 희석법으로 10단계 희석하였다. 그리고나서, 상기 희석액을 바실러스 세레우스 선택배지인 크롬아가(CHROMagar)에 분주하여 37℃에서 24 시간 배양한 뒤, 바실러스 세레우스 균주의 수를 측정하였다.
그 결과, 표 2에 나타난 바와 같이 바실러스 세레우스 및 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주를 공동 배양한 실험군은 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주 농도에 의존적으로 바실러스 세레우스의 생장을 저해하였고, 대조군인 바실러스 아밀로리퀴페시언스 R48 KACC 15866 균주와 공동 배양한 실험군은 바실러스 세레우스의 생장을 저해하지 않았다(표 2).
샘 플 cfu/㎖ 생존율(%)
대조군(바실러스 세레우스 KACC10004) 2.65×108
바실러스 아밀로리퀴페시언스
RD 7-7		 0.13% 2.71×107 88.24
0.25% 1.36×107 84.67
0.50% 9.35×105 70.88
1% 4.20×103 43.01
바실러스 아밀로리퀴페시언스
KACC 15866		 0.13% 3.40×108 101.28
0.25% 2.70×108 100.10
0.50% 3.05×108 100.72
1% 3.00×108 100.64
<1-2> 실시간 중합효소연쇄반응 ( real time polymerase chain reaction )을 이용한 바실러스 세레우스 생장 저해 확인
상기 실험예 <1-1>의 바실러스 세레우스 및 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주를 공동 배양한 배양액에서 바실러스 세레우스의 생장 저해 효과를 확인하기 위하여 실시간 PCR(real time polymerase chain reaction)을 수행하였다.
구체적으로, 바실러스 세레우스 0.5% 및 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 0.125%, 0.25%, 0.5% 및 1%를 공동 배양한 배양액을 10, 100, 500 및 1000배로 단계적으로 희석하여 QIAamp DNA mini kit(QIAGEN, 미국)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 DNA를 추출하였다. 그 후 하기 표 3의 조건으로 바실러스 세레우스 실시간 PCR 키트(real time PCR kit)를 사용하여 groEL 유전자를 타겟으로 실시간 PCR을 수행하였고, 이때 표준곡선은 공동 배양액을 10, 100, 500 및 1000배로 희석한 배지상의 균주 수 및 실시간 PCR의 역치 사이클(threshhold cycle, C(t)) 값을 이용하여 도출하였다.
PCR 단계 온도 시간 사이클 수
Uracil-N-glycosylase 50℃ 2분 1
preheat 95℃ 10분 1
변성(denaturation) 95℃ 30초 40
결합(annealing) 55℃ 50초
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 표준곡선을 도출하였고(도 2), 표 4에 나타난 바와 같이 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주에 의해 바실러스 세레우스의 생장이 저해된 것을 확인하였으며, 이는 상기 실험예 <1-1> 의견과 같은 경향을 나타내었다.
샘 플 C(t) y =-3.9756x+49.693
log cfu/㎖
대조군(바실러스 세레우스 KACC10004) 18.46 7.86
바실러스 아밀로리퀴페시언스
RD 7-7		 0.125% 19.08 7.70
0.25% 21.29 7.14
0.5% 23.41 6.61
1% 25.07 6.19
바실러스 아밀로리퀴페시언스
KACC 15866		 0.125% 16.85 8.26
0.25% 15.99 8.48
0.5% 16.47 8.36
1% 16.64 8.31
<1-3> 독소 관련 유전자의 전사량 확인을 통한 바실러스 세레우스 생장 저해 확인
바실러스 세레우스의 생장 저해 효과 확인을 위해 바실러스 세레우스의 독소 관련 유전자인 groEL 및 nheA 유전자의 전사량을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <1-1>의 공동 배양액에서 RNeasy plus mini kit(QIAGEN)를 이용하여 mRNA를 추출하였고, 상기 mRNA로부터 cDNA 합성 키트(amfiRivert Platinum cDNA synthesis Master Mix, GenDEPOT)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 그리고나서, 합성된 cDNA를 이용하여 유전자의 발현량을 역전사-PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)로 확인하고, iQ™ SYBR® Green Supermix(Bio-Rad)를 사용하여 CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System에서 시그날을 수치화하여 정량적으로 비교 측정하였다. PCR 조건 및 프라이머는 하기 표 5 및 6에 나타난 바와 같다.
단계 온도 시간 사이클 수
초기 변성 및 효소 활성 95℃ 3분 1
변성 95℃ 15초 33(RT-PCR)
40(qPCR)
결합 55℃ 30초
신장 72℃ 30초
(qPCR)멜팅 커브 72℃ 30초 1
서열번호 프라이머 서열(5'→3') 용도
1 groEL-L TGCAACTGTATTAGCACAAGCT RT-PCR, qPCR
2 groEL-R TTACCAACGCGCTCCATTGCTT RT-PCR, qPCR
3 nheA-L GTTAGGATCACAATCACCGC RT-PCR, qPCR
4 nheA-R ACGAATGTAATTTGAGTCGC RT-PCR, qPCR
5 nheC-L TGGATTCCAAGATGTAACG RT-PCR, qPCR
6 nheC-R ATTACGACTTCTGCTTGTGC RT-PCR, qPCR
7 entFM-L AAAGAAATTAATGGACAAACTCAAACTCA RT-PCR, qPCR
8 entFM-R GTATGTAGCTGGGCCTGTACGT RT-PCR, qPCR
9 ces-L GGTGACACATTATCATATAAGGTG RT-PCR, qPCR
10 ces-R ATTCAACATAATATTATACGCCGT RT-PCR, qPCR
11 16s-rRNA-L AGAGTTTGATCCTGGCTCAG RT-PCR, qPCR
12 16s-rRNA-R GGCTACCTTGTTACGACTT RT-PCR, qPCR
그 결과, 도 3 및 도 4에 나타난 바와 같이 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주가 농도 의존적으로 바실러스 세레우스 균주의 groEL 및 nheA 유전자의 전사량을 감소시킴으로써(도 3 및 도 4) 바실러스 세레우스의 생장이 저해된 것을 확인하였다.
<1-4> AtpB 단백질 발현량 확인을 통한 바실러스 세레우스 생장 저해 확인
바실러스 세레우스의 생장 저해 효과를 확인하기 위하여 AtpB 단백질의 발현량을 확인하기 위하여 웨스턴 블랏(western blotting)을 수행하였다.
구체적으로, 공동 배양액을 10,000 X g에서 5분간 원심분리를 하여 얻은 세포 펠릿(pellet)에 SDS 샘플 버퍼를 첨가하여 100 ℃에서 10분간 변성시키고, 12 % SDS 폴리아크릴아마이드 젤(polyacrylamide gel)에 전기 영동한 다음 젤을 니트로셀룰로우스 막(nitrocellulose membrane)으로 이동시켰다. 막을 1 시간 동안 블로킹(blocking)한 후, 항-AtpB 1차 항체(Affinity purified rabbit anti-AtpB, Agrisera, Vannas, Sweden)를 넣어 1 시간 동안 반응시키고, TBS-T(Tris-buffered saline with 0.1% Tween-20) 용액으로 10분 간격으로 3회 세척하였다. 막을 다시 서양고추냉이 과산화효소-결합 고트 IgG 2차 항체(horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat IgG secondary antibody)(Bio-Rad, USA) 용액에 넣고 1 시간 동안 반응시켰다. 그 후, TBS-T 용액으로 10분 간격으로 3회 막을 세척하고 BM 케미루미니신스 블랏팅 서브스트레이트(chemiluminescence blotting substrate, POD) (Roche, Mannheim, Germany)를 이용하여 엑스레이 필름에 감광하여 현상하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 대조군과 비교하여 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주가 농도 의존적으로 바실러스 세레우스의 AtpB 단백질의 발현을 감소시키는 것을 확인하였다.(도 5).
< 실험예 2> 콩발효물(청국장)에서 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD 7-7 균주의 발효 특성 확인
콩발효물에서 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주의 발효 특성 및 바실러스 세레우스 생장 저해 효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.
<2-1> 콩발효물의 제조
구체적으로, 콩발효물을 제조하기 위해 대두를 20°C에서 18시간 침지한 후 100℃에서 2시간 증자하였다. 증자된 콩은 40℃ 이하가 되도록 냉각 후, 대두 1 kg에 선별균주를 LB 배지(Difco, 미국)에 18시간 배양한 배양액(OD: 0.5, 108 CFU/㎖)을 1%(v/w) 접종하고 혼합한 후, 스티로폼 상자(21×27×1.8 cm)에 담았으며, 대조군은 균주를 접종하지 않고 자연발효하였다. 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주 및 바실러스 세레우스를 비율을 달리하여 접종하고, 발효조건은 습도 70%, 온도 37℃의 배양기에 36시간 발효시켜 콩 발효물을 제조하였다.
<2-2> 콩발효물에서 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주의 발효 특성 및 바실러스 세레우스 생장 저해 효과를 확인
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주를 접종하여 발효시킨 샘플 1이 균을 접종하지 않은 대조군보다 점진물의 양이 훨씬 많이 생기는 것을 확인하여, 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주의 발효특성이 우수함을 알 수 있었다. 또한 바실러스 세레우스만 접종하여 발효시킨 샘플 2에서는 점진물이 전혀 생기지 않았고, 쾌쾌한 냄새가 난 것을 확인하여 정상적인 발효가 되지 않았음을 알 수 있었다. 특히, 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 및 바실러스 세레우스를 9:1 또는 5:5로 혼합하여 발효시킨 샘플 3 및 4에서는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7의 영향으로 점진물이 많이 생긴 것을 확인할 수 있었다. (도 6).
<실험예 3> 콩발효물에서 바실러스 세레우스의 생장 저해 효과 확인
콩발효물에서 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주에 의한 바실러스 세레우스 생장 저해 효과를 확인하기 위하여, 전처리 후 모은 콩발효물 세포에서 상기 실험예 <1-4>의 방법에 따라 단백질을 분리 및 분석하여 AtpB 단백질의 발현량을 확인하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이 RD7-7 균주 및 바실러스 세레우스를 공동 접종한 경우 RD7-7 균주의 농도에 의존적으로 AtpB 단백질의 발현량이 감소한 것을 확인하여, 바실러스 세레우스의 생장이 저해된 것을 알 수 있었다(도 7).
<실험예 4> 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD 7-7 균주의 발효특성 확인
바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD 7-7 균주의 발효특성을 확인하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.
<4-1> 콩발효물 제조 및 시료 추출액 제조
상기 실험예 <2-1>의 방법에 따라 콩발효물을 제조하였고, 접종 균주는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) HJ18-4, 바실러스 아밀로리퀴페시언스 HJ5-2, 바실러스 아밀로리퀴페시언스 HJ39-5를 이용하였다.
시료 추출액은 콩 발효물 20 g에 증류수를 가하여 100 ㎖로 정용하고 균질화한 후, 이를 원심분리(8,000×g, 10 min)하여 상등액을 시료 추출액으로 사용하였다.
<4-2> 미생물수 측정
상기 실험예 <6-1>의 콩 발효물에서 수득한 시료 추출액에서 하기와 같은 방법으로 미생물 수를 측정하였다.
구체적으로, 각 시료 추출액 1 g을 멸균 생리식염수를 이용하여 10진 희석법에 의해 10단계로 희석한 후, 희석액을 플레이트 카운트 아가(plate count agar, Difco)에 배양(37℃, 24시간)하여 총균수를 계수하였고, 유산균수는 희석액을 MRS 아가(MRS agar, Difco)에 가스팩(gas pack, Oxoid, Hampshire, England)을 이용하여 혐기적 조건으로 배양(37℃, 48시간)한 후 계수(CFU/g)하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이 총균수는 대조군이 1.12×108 CFU/㎖로 균수가 가장 낮았으며, 바실러스 아밀로리퀴페시언스 HJ5-2를 접종한 발효물이 3.00×109 CFU/㎖로 가장 높았다. 균주 종류에 따라 생균수의 차이가 있으며, 또한 유산균수를 측정한 결과, 균을 접종하지 않은 대조군이 1.40×108 CFU/㎖로 균수가 가장 높았으며, 균주를 접종한 콩 발효물은 2.50×102~7.30×104 CFU/㎖로 대조군보다 낮은 균수를 나타냈다. 이는 바실러스균을 접종함으로써 우점종이 되어 다른 균들의 생성을 저해한 것으로 사료된다(도 8).
<4-3> 효소 활성 측정
단백질 분해효소의 활성은 공지된 방법(Korean J Food Sci Technol 30: 1333-13380)을 변형하여 측정하였다. 구체적으로, 시료 추출액 1 ㎖에 0.6% 카제인(casein) 기질용액(0.2 M phosphate buffer, pH 7.0)을 넣고 37℃에서 10분간 반응시켰다. 반응 후 0.44 M 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid, TCA) 5 ㎖를 넣어 반응을 중지하였다. 그 후, 실온에서 30분간 방치하고, 여과지(No.2, Whatman, Buckinghamshire, UK)에 여과한 여액 2 ㎖에 0.55 M 탄산나트륨(Na2CO3) 용액 5 ㎖ 및 4배 희석된 폴린 반응(Folin reagent) 용액 1 ㎖를 넣어 실온에서 30분간 반응한 후 660 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질 타이로신(tyrosine)을 단계적으로 희석하여 동일한 방법으로 분석하고, 표준 곡선(standard curve)를 이용하여 1 unit은 1분 동안 타이로신 1 ㎍을 유리시키는 양을 환산하여 계산하였다.
알파-아밀라아제(α-Amylase) 활성은 DUN(Dextrinogenic Unit of Nagase, Yoon KS. 1988.,Kunkuk University, Seoul, Korea)법에 의하여 측정하였다. 구체적으로, 1% 가용성전분(in 0.02 M phosphate buffer, pH 7.0) 3 ㎖에 시료 추출액 1 ㎖ 첨가하여 40℃에서 10분간 반응한 후 1 M 염산 10 ㎖를 넣어 반응을 중지하였다. 요오드 용액(0.005% I2＋0.05% KI) 10 ㎖를 넣고 발색한 후 660 nm에서 흡광도를 측정하였다. 공시험(blank test)의 경우 1 M 염산(HCl) 10 ㎖를 넣어 반응을 중지시킨 후 시료추출액을 넣어 반응 및 발색하여 측정하였으며, 조효소액 1 ㎖가 1분 동안 전분 0.1 mg을 분해한 양을 1 unit으로 계산하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이 단백질 분해효소(protease) 활성 측정 결과는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주를 접종한 콩 발효물이 647.92 unit/㎖로 활성이 가장 높았으며, 균주를 접종하지 않은 대조군이 318.13 unit/㎖로 가장 낮은 활성을 보였다. 단백질 활성이 높은 균주는 청국장의 이취를 감소시키고 맛을 향상시킨다고 보고된 바 있으므로, 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주가 청국장 제조에 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다(도 9).
또한, 도 9에 나타난 바와 같이 알파-아밀라아제 활성은 균주를 접종하지 않은 대조군이 33.39 unit/㎖로 활성이 가장 높았으며, 이는 자연 발효로 인한 다양한 미생물에 의한 영향으로 사료된다. 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 또는 바실러스 서브틸리스 HJ18-4를 접종한 콩 발효물은 각각 20.82, 18.45 unit/㎖로 활성이 가장 높았다. 아밀라아제 활성은 당분의 감미성분 등에 관여하여 품질 면에서 중요한 효소라고 할 수 있으므로, 본 발명의 RD7-7 균주가 청국장 제조에 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다(도 10).
<4-4> 환원당 측정
환원당 함량은 DNS법(dinitrosalicylic acid, Anal Biochem 2: 127-132.)으로 측정하였다. 구체적으로, DNS 시약 3 ㎖에 희석한 시료 추출용액 1 ㎖를 가하고 37℃에서 5분간 반응 후 냉각시킨 다음 550 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 글루코오스(glucose)를 이용한 표준곡선으로부터 환원당 함량을 산출하였다.
그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이 환원당의 양을 측정한 결과 1.31~2.35%의 함량을 나타내었으며, 바실러스 서브틸리스 HJ18-4를 접종한 콩 발효물이 높은 함량(2.35%)으로 나타났다.
<4-5> 아미노태 질소 측정
아미노태 질소 함량은 공지된 포르몰(Formol) 적정법(Korean J Food Preserv 14: 356-363.)으로 측정하였다. 구체적으로, 시료 추출액 5 ㎖, 중성 포르말린(formalin) 용액 10 ㎖ 및 증류수 10 ㎖를 혼합한 용액에 0.5% 페놀프탈레인(phenolphthalein) 용액 2~3 방울을 가한 후, 여기에 0.1 N 수산화나트륨(NaOH)를 가하여 미홍색이 될 때까지의 적정량과 공실험의 적정량을 이용하여 산출하였다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이 아미노태 질소 측정 결과는 112.85 ~ 227.69 mg% 함량을 나타내었고, 단백질 분해효소 활성이 높았던 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7이 227.96 mg%로 함량이 가장 높았다. 아미노태 질소는 발효숙성 중 미생물이 생산하는 단백질 분해효소에 의해 생성된 아미노산에 기인하므로 콩 발효식품의 발효 정도의 척도로 이용되며, 따라서 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7을 접종한 콩발효물이 발효가 많이 된 것을 확인할 수 있었다.
<4-6> 아미노산과 유기산 측정
유리 아미노산 함량은 공지된 방법(Korean J Food & Nutr 25:505-512.)에 따라 분석하였다. 구체적으로, 시료 추출액 3 g을 취하여 70% 에탄올 30 ㎖를 가하고 1시간 동안 균질화한 후 21,000×g에서 15분 동안 원심분리하였다. 그리고나서 상등액을 70% 에탄올 25 ㎖로 2회 반복 추출하고 추출액을 합하여 로타리 증발기(rotary evaporator, EYELA A-3S, Rikakikai Co., Ltd., Tokyo, Japan)로 감압 농축하였다. 이 농축물을 0.02 N 염산 20 ㎖에 녹이고 10배 희석하여 0.45 ㎛ 막 필터(Merck Millipore, Darmstadt, Germany)로 여과한 후 아미노산 자동분석기(Blochrom 30, Biochrom Ltd., Cambrdge, UK)를 이용하여 분석하였다.
또한, 유기산 함량 분석을 위해 시료 추출액 3 g 및 증류수 30 ㎖를 50 ㎖ 플라스크에 담아 한 시간 동안 소니케이션(sonication)하였다. 실온으로 식힌 후 증류수를 표선까지 채우고 필터 종이(No.2, Whatman)로 여과한 후 0.45 ㎛ 막 필터(Merck Millipore)로 여과하여 시험용액으로 사용하였다. 유기산 표준물질은 시료와 동일한 용매에 용해하여 검량선 작성에 사용하였다. 유기산 분석은 고성능액체크로마토그래피(HPLC, Agilent technologies, Palo Alto, CA, USA)를 수행하여, 컬럼(column)은 cap cell pak C18-AQ(80A, Shiseido, Tokyo, Japan)를 이용하고, 검출기(detector)는 UV 210 nm, 이동상은 0.1 M 제1 인산암모늄(NH4H2PO4, pH 2.5)을 사용하여 유속은 1.0 ㎖/min의 조건으로 분석하였다.
그 결과, 표 7에 나타난 바와 같이 아미노산 함량은 글루탐산(Glutamic acid)이 3.18~3.39%로 가장 많이 검출되었고, 아스파르트산(aspartic acid)이 1.87~2.07%, 류신(leucine)이 1.28~1.48%, 라이신(lysine)이 1.05~1.18% 및 아르기닌(arginine) 1.03~1.32% 순으로 검출되었다. 총 아미노산 함량은 바실러스 아밀로리퀴페시언스 HJ5-2 및 바실러스 아밀로리퀴페시언스 HJ39-5를 접종한 콩 발효물이 18.38, 17.07%로 가장 높았다(표 7). 콩 발효과정 중 바실러스균(Bacillus sp.)에서 유래한 다양한 효소에 의해 단백질이 분해되어 구수한 맛을 내는 글루탐산 및 아스파르타산(aspartic acid), 쓴맛을 지닌 발린(valine), 이소류신(isoleucine), 류신, 메티오닌(methionine) 및 페닐알라닌(phenylalanine), 단맛을 내는 알라닌(alanine), 글리신(glycine) 및 라이신 등의 유리아미노산이 생성되고 어우러져 콩 발효물의 특유의 맛과 향미를 갖게 해준다는 것이 알려져 있다(J Agric Food Chem 48: 716-723.).
아미노산(%)
대조군1 RD7-72 HJ5-23 HJ18-44 HJ39-55
아스파르트산 1.87 1.90 2.07 1.89 1.92
트레오닌 0.57 0.57 0.61 0.54 0.57
세린 0.83 0.82 0.85 0.81 0.84
글루탐산 3.18 3.25 3.39 3.38 3.31
프롤린 0.90 0.99 1.09 0.91 0.93
글리신 0.69 0.71 0.75 0.69 0.71
알라닌 0.78 0.76 0.91 0.77 0.78
시스테인 0.09 0.07 0.08 0.08 0.08
발린 0.89 0.90 0.99 0.89 0.93
메티오닌 0.20 0.19 0.23 0.19 0.22
이소류신 0.81 0.83 0.91 0.80 0.83
류신 1.38 1.38 1.48 1.28 1.37
타이로신 0.60 0.60 0.70 0.54 0.64
페닐알라닌 0.94 0.97 1.07 1.02 0.94
히스티딘 0.46 0.46 0.51 0.48 0.46
라이신 1.08 1.07 1.18 1.05 1.06
아르기닌 1.31 1.22 1.32 1.03 1.21
트립토판 0.27 0.27 0.27 0.25 0.27
총량 16.83 16.94 18.38 16.62 17.07
1대조군: 바실러스를 접종하지 않은 실험군, 2HJ18-4: 바실러스 서브틸리스 HJ18-4를 접종한 실험군, 3RD7-7: 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7을 접종한 실험군, 4HJ5-2: 바실러스 아밀로리퀴페시언스 HJ5-2를 접종한 실험군, 및 5HJ39-5: 바실러스 아밀로리퀴페시언스 HJ39-5를 접종한 실험군.
또한, 표 8에 나타난 바와 같이 유기산 함량은 옥살산(oxalic acid)이 모든 실험구에서 36.51~63.57 ㎎/100 g이 검출되었고, 숙신산(succinic acid)은 대조군및 RD7-7 접종 콩 발효물에서 600.15~429.49 ㎎/100 g이 검출되었다(표 8). 대조군의 경우 균주를 접종한 콩 발효물보다 높은 유기산 함량이 검출되었는데, 이는 유산발효에 의한 유기산 생성에 의한 것이며, 이는 대조군의 유산균 수가 바실러스균 접종 발효물보다 높은 것과 연관된 것으로 판단된다.
유기산(mg/100 g)
대조군1 RD7-72 HJ5-23 HJ18-44 HJ39-55
시트르산 비검출 비검출 비검출 비검출 비검출
숙신산 600.15 429.49 비검출 비검출 비검출
락틱산 비검출 비검출 비검출 비검출 비검출
옥살산 63.57 57.05 40.3 65.28 36.51
푸마르산 비검출 비검출 비검출 비검출 비검출
말산 비검출 비검출 비검출 비검출 비검출
1대조군: 바실러스를 접종하지 않은 실험군, 2HJ18-4: 바실러스 서브틸리스 HJ18-4를 접종한 실험군, 3RD7-7: 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7을 접종한 실험군, 4HJ5-2: 바실러스 아밀로리퀴페시언스 HJ5-2를 접종한 실험군, 및 5HJ39-5: 바실러스 아밀로리퀴페시언스 HJ39-5를 접종한 실험군.
<4-7> 향기 분석
시료 추출액 2 g에 추출용매(diethyl ether : pentane=1:1) 10 ㎖를 가하여 진탕 추출(20°C, 15 hr)한 후, 원심분리(8,000 rpm, 10 min) 하여 상등액에 황산나트륨(sodium sulfate) 1 g을 첨가하여 수분을 흡착시켰다. 그 후 상등액을 여과(No.2, Whatman)하고, 여액을 0.2 ㎛ 실린지 필터(syringe filter, Merck Millipore)를 이용하여 재여과하여 분석 시료로 사용하였다. 향기 성분 분석은 GC/MS(QP2010, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하였고, 컬럼은 HP-innowax(60 m/ID 0.25 μm, Agilent, Santa Clara, CA, USA)를 사용하였다. 오븐온도는 40℃에서 5분동안 유지한 후 1분당 2℃씩 230℃까지 상승시켰고 30분동안 유지하였다. 인젝션(injection) 온도는 250℃, 캐리어 가스(carrier gas)는 헬륨(He)을 이용하였고, 칼럼 유속은 0.74 ㎖/min으로 하였다. 화합물 동정은 GC-MS로 얻은 매스 스펙트럼(mass spectrum)을 Wiley 275 data base로 검색하여 동정하였고, 정량 분석을 위하여 각 화합물의 함량은 50 ppm 농도의 내부표준물질(4-methyl-2-pentanol)을 이용하여 정량하였다.
그 결과, 표 9에 나타난 바와 같이 에스터(esters) 3종, 케톤(ketones) 6종, 알데하이드(aldehydes) 2종, 알코올(alcohols) 4종, 하이드로카본(hydrocarbons) 2종, 파라진(pyrazines) 2종, 산(acids) 4종 및 기타 4종의 향기 성분이 검출되었다. 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 또는 바실러스 서브틸리스 HJ18-4를 접종한 콩 발효물에서 23종의 향기 성분이 검출되었고 HJ39-5를 접종한 콩 발효물에서 15종의 향기 성분이 검출되었다. 청국장에서 휘발성 향기 성분으로 알려진 피라진류는 트리메틸-피라진(trimethyl-pyrazine) 및 테트라메틸-피라진(tetramethyl-pyrazine)이 검출되었으며, 청국장의 자극취로 알려진 테트라메틸-피라진은 RD7-7 및 HJ39-5 균주 발효물에서는 검출되지 않았다(표 9). 청국장의 불쾌취로서 알려진 산류 중 부티르산(butyric acid)와 발레르산(valeric acid)는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7과 바실러스 서브틸리스 HJ18-4가 다른 균주보다 다소 낮게 나타났다. 따라서, 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주는 발효과정에서 이취가 적게 발생함을 확인할 수 있었다.
단위(ppm) 향기 성분 RT1(min) RD7-7 HJ5-2 HJ18-4 HJ39-5
에스터
(esters)		 2-propenoin acid, 2-propenyl ester 6.233 0.46 0.45 0.16 비검출
formic acid, ethyl ester 7.074 1.52 0.60 1.92 1.42
acetic acid, ethyl ester 8.486 78.00 71.82 71.65 76.45
케톤
(ketones)		 2-methyl-3-heptanone 6.445 2.44 2.53 2.08 2.36
2-butanone 8.893 비검출 6.11 비검출
2,3-butanedione 11.905 2.74 2.09 3.04 2.05
acetoin 30.852 185.25 93.28 290.90 246.37
2,2-dimethyl-cyclohexanone-4,4-d2 59.011 비검출 4.02 비검출 비검출
2-oxazolidinone 59.023 4.27 3.04 비검출
알데하이드
(aldehydes)		 2-methyl-propanal 8.928 2.29 비검출 2.56 2.52
acetaldehyde 11.733 0.76 0.75 0.64 0.63
알코올
(alcohols)		 ethanol 9.875 0.91 1.04 0.32 0.63
2-butanol 14.072 4.57 4.32 4.16 4.41
1,3-butanediol 47.951 58.20 22.05 44.14 69.51
1-butanol 61.597 1.37 비검출
하이드로카본
(hydrocarbons)		 benzene 10.164 89.73 87.62 83.48 90.95
1h-indene 44.410 0.46 0.75 비검출 비검출
피라진
(pyrazines)		 trimethyl-pyrazine 38.684 0.61 3.43 1.92 비검출
tetramethyl-pyrazine 43.192 비검출 2.68 2.24 비검출
산
(acids)		 isobutyric acid 49.061 0.76 8.34 2.56 비검출
isovaleric acid 55.069 1.68 46.34 2.08 3.94
propanoic acid 60.788 0.91 34.57 4.00 0.95
carbonic acid 63.165 0.76 비검출 1.76 비검출
기타 cyclohexane 6.107 17.22 17.29 16.15 17.50
1-phenyl-4-penten-1-yne 65.112 비검출 비검출 6.24 비검출
2-methyl-naphthalene 66.999 2.74 2.24 1.60 1.42
3-[(trimethylsilyl)oxy]furan 70.852 1.07 비검출 0.64 비검출
<4-8> 통계 분석
실험결과는 3회 반복으로 측정하였으며, 평균치간의 유의성 검증은 SPSS system(Statistical Package for Social Sciences, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) soft-ware package(version 12)를 이용, P<0.05 수준으로 던컨의 다중검정(Duncan's multiple range test)에 의하여 검정하였다.
<110> Foundation of Agri. Tech. Commercialization&Transfer <120> Bacillus amyloliquefacience having antibacterial activity and uses thereof <130> 2017P-11-043 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 1 tgcaactgta ttagcacaag ct 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 2 ttaccaacgc gctccattgc tt 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 3 gttaggatca caatcaccgc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 4 acgaatgtaa tttgagtcgc 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 5 tggattccaa gatgtaacg 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 6 attacgactt ctgcttgtgc 20 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 7 aaagaaatta atggacaaac tcaaactca 29 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 8 gtatgtagct gggcctgtac gt 22 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 9 ggtgacacat tatcatataa ggtg 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 10 attcaacata atattatacg ccgt 24 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 11 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 12 ggctaccttg ttacgactt 19 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide <400> 13 agagtttgat catggctcag 20 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide <400> 14 ggataccttg ttacgactt 19

Claims (11)

  1. 기탁번호 KACC 92071P로 수탁된 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefacience) RD7-7 균주.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 균주는 쌀된장으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 균주는 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 대장균(Escherichia coli), 포도상구균(Staphylococcus aureus), 살모넬라 엔테릭(Salmonella enteric) 및 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 균에 대해 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주.
  4. 제 1항의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축물 및 상기 배양액의 건조물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 발효용 스타터(starter).
  5. 제 1항의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주 또는 제 4항의 발효용 스타터를 이용하여 생산된 발효식품.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 발효식품은 콩을 이용한 것을 특징으로 하는 발효식품.
  7. 제 5항에 있어서, 상기 발효식품은 청국장인 것을 특징으로 하는 발효식품.
  8. 제 1항의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 RD7-7 균주 또는 제 4항의 발효용 스타터를 원재료에 접종하는 단계를 포함하는 발효식품 제조방법.
  9. 기탁번호 KACC 92071P로 수탁되고, 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefacience) RD7-7 균주를 유효성분으로 함유하는 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 대장균(Escherichia coli), 포도상구균(Staphylococcus aureus), 살모넬라 엔테릭(Salmonella enteric) 및 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 병원균에 의한 감염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 기탁번호 KACC 92071P로 수탁되고, 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 대장균(Escherichia coli), 포도상구균(Staphylococcus aureus), 살모넬라 엔테릭(Salmonella enteric) 및 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 균에 대해 항균 활성을 나타내는 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefacience) RD7-7 균주를 유효성분으로 함유하는 항균용 건강기능식품.
  11. 기탁번호 KACC 92071P로 수탁되고, 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 대장균(Escherichia coli), 포도상구균(Staphylococcus aureus), 살모넬라 엔테릭(Salmonella enteric) 및 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 균에 대해 항균 활성을 나타내는 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefacience) RD7-7 균주를 유효성분으로 함유하는 항균용 사료첨가제.
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