KR102620909B1 - 신규 락티플랜티바실러스 플란타룸(Lactiplantibacillus plantarum) SKO-001 균주 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 신규한 락티플랜티바실러스 플란타룸(Lactiplantibacillus plantarum) SKO-001 균주(수탁번호 KCTC 14816BP) 및 이를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방, 치료, 및 개선용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 신 균주는 다양한 종류의 항생제에 대한 내성이 없으며, 용혈 활성, 생체 아민, β-글루쿠론산분해효소(β-glucuronidase) 등을 생성하지 않은 안전한 균주로 염증유발 인자인 산화질소(NO), iNOS, TNF-α 및 IL-6의 발현을 억제하는 항염증 활성을 갖고 있어 염증의 예방, 치료, 및 개선을 위해 다양하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 신규 락티플랜티바실러스 플란타룸(Lactiplantibacillus plantarum) SKO-001 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
건강한 인체의 내부에는 인체의 세포수보다 10배 많은 약 100조에 이르는 미생물이 공생하고 있다. 이들의 유전자 수는 인간의 100배가 넘으며, 장내 미생물총은 개인별, 병증별로 특이하게 구조화되어 있다. 건강한 장내 공생 미생물총은 인체 세포와 복잡한 상호 작용을 하며 물질 대사, 면역 반응의 조절을 통한 면역계 발달과 장내 항상성을 유지하는 등 다양한 기능을 수행한다.
한편, 염증성 질환은 염증을 주병변으로 하는 질병으로서, 그 중에서도 염증성 장질환은 호전과 재발을 반복하면서 장내 만성적인 염증 및 궤양을 일으키는 질환이다.
염증성 장질환은 환경적 요인, 유전적 요인과 함께 장 내에 정상적으로 존재하는 세균에 대한 몸의 과도한 면역반응 등이 주요 발병 원인으로 알려져 있다. 염증성 질환의 종류로는 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 크론병(Crohn's disease) 등의 염증성 장질환이 존재하는데, 증상, 병의 경과 및 치료방법 등이 비슷하여 이들 질환을 염증성 장질환으로 총칭한다. 현재 국내의 서구화된 생활 및 식습관의 변화로 인하여 20 및 30대에 해당하는 비교적 젊은 세대에서 발병률이 꾸준하게 증가하고 있다.
염증성 장질환은 증상이 완화되는 관해기와 악화되는 활동기가 반복되는 만성 질환이다. 따라서, 질병의 완치보다는 증상의 조절과 합병증 예방을 통해 삶의 질을 향상시키는 것을 치료 목적으로 하며, 일반적으로 흔히 사용되는 약물제제는 면역억제제이다.
그러나 이 면역억제제는 일부의 환자에서 구역질, 속쓰림, 두통, 어지러움, 빈혈 및 피부발진 등 부작용을 유발하는 것으로 보고되고 있으며, 이를 개선하기 위하여 부작용이 적은 치료제의 개발이 요구되고 있다.
최근에는 차세대 염기서열분석(Next-Generation Sequence; NGS)기법이 개발이 되며 장내에 존재하는 마이크로바이옴(microbiome)에 대한 연구가 활성화되었으며, 염증성 장질환의 병인론과 마이크로바이옴의 관계성에 관련된 연 구가 많이 보고되었다.
그 중 장내에 유익한 역할을 하는 유산균들이 염증성 장질환에 대하여 보호 효과를 보이는 결과를 도출한 연구 내용들이 다수 보고되었으나, 유산균의 종류에 따라서 염증성 장질환의 보호효과에 대한 결과는 상이하므로 이와 관련한 부가적인 연구가 필요하다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 신규 락티플랜티바실러스 플란타룸(Lactiplantibacillus plantarum) SKO-001 균주가 안전하고 세포 독성을 가지지 않으며, 다양한 항생제에 대한 감수성을 가지고, 나아가 항염 효과를 가져 염증성 질환에 대한 예방, 개선 또는 치료 효과를 가질 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 수탁번호 KCTC 14816BP로 기탁된 락티플랜티바실러스 플란타룸(Lactiplantibacillus plantarum) SKO-001 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 신규 균주를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 신규 균주를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 신규 균주를 포함하는 유당불내증의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 신규 균주를 포함하는 유당불내증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 신규 균주를 포함하는 포스트바이오틱스 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 수탁번호 KCTC 14816BP로 기탁된 락티플랜티바실러스 플란타룸(Lactiplantibacillus plantarum) SKO-001 균주가 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 균주는 서열번호 1로 표시되는 16S rRNA 서열을 가지는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 균주는 유당불내증 개선, 항염 또는 항생제에 대한 감수성을 가지는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 균주는 추가로 용혈 활성이 없고, 생체 아민 또는 β-글루쿠론산분해효소(β-glucuronidase)을 생성하지 않는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 항생제는 암피실린(ampicillin), 반코마이신(vancomycin), 젠타마이신(gentamicin), 카나마이신(kanamycin), 스트렙토마이신(streptomycin), 에리트로마이신(erythromycin), 클린다마이신(clindamycin), 테트라사이클린(tetracycline) 및 클로람페니콜(chloramphenicol)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 신규 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물, 상기 균주의 추출물, 상기 배양물의 추출물 및 상기 파쇄물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 염증성 질환은 염증성 장질환(inflammatory bowel diseases, IBD), 과민성 대장증후군(irritable bowel syndrome), 베체트 병(Behcet's disease), 장염(enteritis), 크론병(Crohn's disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 염증성 피부질환, 자가면역 질환, 자가면역성 염증성 질환, 인후염, 편도염, 기관지염, 폐렴, 위염, 관절염, 간염 및 신장염으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 신규 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물, 상기 균주의 추출물, 상기 배양물의 추출물 및 상기 파쇄물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 신규 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물, 상기 균주의 추출물, 상기 배양물의 추출물 및 상기 파쇄물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 유당불내증의 예방 또는 개선용 식품 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 신규 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물, 상기 균주의 추출물, 상기 배양물의 추출물 및 상기 파쇄물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 유당불내증의 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 신규 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물, 상기 균주의 추출물, 상기 배양물의 추출물 및 상기 파쇄물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 포스트바이오틱스 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 신규 균주 락티플랜티바실러스 플란타룸(Lactiplantibacillus plantarum) SKO-001 균주(수탁번호 KCTC 14816BP)는 다양한 종류의 항생제에 대한 내성이 없으며, 용혈 활성, 생체 아민, β-글루쿠론산분해효소(β-glucuronidase) 등을 생성하지 않아 안전하고, 나아가 염증유발 인자인 산화질소(NO), iNOS, TNF-α 및 IL-6의 발현을 억제하는 항염증 활성을 갖고 있어 염증의 예방, 치료, 및 개선을 위해 다양하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 신규 균주인 락티플랜티바실러스 플란타룸 SKO-001 균주의 유전체 염기서열 평균 유사도(ANI)를 이용한 유전학적 계통도(phylogenetic tree)를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 락티플랜티바실러스 플란타룸 SKO-001 균주의 용혈 활성 여부를 확인한 결과이다.
도 3은 LPS로 염증이 유도된 RAW264.7 세포에서 본 발명의 락티플랜티바실러스 플란타룸 SKO-001 균주의 세포독성을 확인한 결과이다. 결과는 평균+표준편차(n=3)으로 표시하였으며, Tukey's 다중 비교 테스트를 사용한 일원 분산 분석(One-way ANOVA wirh Tukey's multiple comparison test)을 통해 LPS처리군에 대한 통계학적 유의차를 계산하여 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001로 표시하였다.
도 4는 LPS로 염증이 유도된 RAW264.7 세포에서 본 발명의 락티플랜티바실러스 플란타룸 SKO-001 균주의 산화질소(NO) 억제능을 확인한 결과이다. 결과는 평균+표준편차(n=3)으로 표시하였으며, Tukey's 다중 비교 테스트를 사용한 일원 분산 분석(One-way ANOVA wirh Tukey's multiple comparison test)을 통해 LPS처리군에 대한 통계학적 유의차를 계산하여 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001로 표시하였다.
도 5는 LPS로 염증이 유도된 RAW264.7 세포에서 본 발명의 락티플랜티바실러스 플란타룸 SKO-001 균주의 iNOS 및 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-6)의 mRNA 발현 억제능을 확인한 결과이다 (5a: iNOS, 5b: TNF-α, 5c: IL-6) 참고로, 결과는 평균+표준편차(n=3)으로 표시하였으며, Tukey's 다중 비교 테스트를 사용한 일원 분산 분석(One-way ANOVA wirh Tukey's multiple comparison test)을 통해 LPS처리군에 대한 통계학적 유의차를 계산하여 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001로 표시하였다.
도 2는 본 발명의 락티플랜티바실러스 플란타룸 SKO-001 균주의 용혈 활성 여부를 확인한 결과이다.
도 3은 LPS로 염증이 유도된 RAW264.7 세포에서 본 발명의 락티플랜티바실러스 플란타룸 SKO-001 균주의 세포독성을 확인한 결과이다. 결과는 평균+표준편차(n=3)으로 표시하였으며, Tukey's 다중 비교 테스트를 사용한 일원 분산 분석(One-way ANOVA wirh Tukey's multiple comparison test)을 통해 LPS처리군에 대한 통계학적 유의차를 계산하여 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001로 표시하였다.
도 4는 LPS로 염증이 유도된 RAW264.7 세포에서 본 발명의 락티플랜티바실러스 플란타룸 SKO-001 균주의 산화질소(NO) 억제능을 확인한 결과이다. 결과는 평균+표준편차(n=3)으로 표시하였으며, Tukey's 다중 비교 테스트를 사용한 일원 분산 분석(One-way ANOVA wirh Tukey's multiple comparison test)을 통해 LPS처리군에 대한 통계학적 유의차를 계산하여 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001로 표시하였다.
도 5는 LPS로 염증이 유도된 RAW264.7 세포에서 본 발명의 락티플랜티바실러스 플란타룸 SKO-001 균주의 iNOS 및 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-6)의 mRNA 발현 억제능을 확인한 결과이다 (5a: iNOS, 5b: TNF-α, 5c: IL-6) 참고로, 결과는 평균+표준편차(n=3)으로 표시하였으며, Tukey's 다중 비교 테스트를 사용한 일원 분산 분석(One-way ANOVA wirh Tukey's multiple comparison test)을 통해 LPS처리군에 대한 통계학적 유의차를 계산하여 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001로 표시하였다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명은 수탁번호 KCTC 14816BP로 기탁된 락티플랜티바실러스 플란타룸(Lactiplantibacillus plantarum) SKO-001 균주를 확인한 것에 기초한다.
이하에서 본 발명의 일 실시예에 따른 신규 균주에 대하여 보다 자세히 설명한다.
본 발명의 신규 균주는 수탁번호 KCTC 14816BP로 기탁된 락티플랜티바실러스 플란타룸(Lactiplantibacillus plantarum) SKO-001 균주로, 락티플랜티바실러스 플란타룸은 종래 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)으로 불리웠다.
락토바실러스 플란타룸은 그람양성의 간균으로 가장 분포가 넓은 유산균 중 하나이다. 락토바실러스 플란타룸은 아라비노스, 글루코스, 프럭토스, 갈락토스, 말토스, 슈크로스, 덱스트란 등을 발효하여 젖산을 생성한다. 주로 유제품이나 피클이나 김치와 같은 침채류, 토마토 등에서 분리되며 특히 김치의 발효 후기에 김치의 발효가 많이 되어 신맛이 날 때 주로 생장하여 우점하게 되면서 다른 종의 생육을 억제하는 균으로 통상적으로 내산성 및 내담즙성이 우수한 것으로 알려져 있다.
상기 락티플랜티바실러스 플란타룸(Lactiplantibacillus plantarum) SKO-001 균주는 서열번호 1로 표시되는 16S rRNA 서열을 가지는 것일 수 있으며, 당귀, 구체적으로는 당귀 뿌리로부터 분리 및 동정된 것일 수 있다.
상기 락티플랜티바실러스 플란타룸(Lactiplantibacillus plantarum) SKO-001 균주는 락티플랜티바실러스 플란타룸 균주 중에서도 우수한 β-갈락토시다아제 활성과 항염 활성을 가지는 것을 특징으로 한다.
뿐만 아니라, 상기 락티플랜티바실러스 플란타룸(Lactiplantibacillus plantarum) SKO-001 균주는 세포 독성이 없어 생체 안전성을 확보할 수 있으며 항생제에 대한 감수성을 가질 수 있다.
구체적으로, 상기 항생제는 특별히 제한되지 않으나, 암피실린(ampicillin), 반코마이신(vancomycin), 젠타마이신(gentamicin), 카나마이신(kanamycin), 스트렙토마이신(streptomycin), 에리트로마이신(erythromycin), 클린다마이신(clindamycin), 테트라사이클린(tetracycline) 및 클로람페니콜(chloramphenicol)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에 대한 것일 수 있다.
또한, 상기 균주는 용혈 활성이 없고, 생체 아민 또는 β-글루쿠론산분해효소(β-glucuronidase)을 생성하지 않을 수 있다.
상기 용어, 용혈 활성은 적혈구의 세포막이 파괴되어 그 안의 헤모글로빈이 혈구 밖으로 나오는 현상으로, 구체적으로는 β-용혈(β-hemolysis) 활성 또는 γ-용혈(γ-hemolysis) 활성을 의미하는 것일 수 있다.
상기 용어, 생체 아민은 식품의 발효과정에서 흔히 아미노산 디카르복실라제(amino acid decarboxylase) 생산 미생물에 의해 생성되는 유해한 물질로서, 체내 과다 축적 시 구토, 설사, 협압 저하 등의 증상을 유발하여 식품의 안전을 좌우하는 주요 인자로 알려져 있다.
상기 용어, β-글루쿠론산분해효소는 베타-글루쿠로니데이스(글루쿠로니다제)라고도 하며, 천연 또는 합성 글루쿠론산 화합물의 글루코사이드결합을 분해하는 효소이다. 에스트로젠 대사 및 세포분열에 관여한다고 알려져 있으며, 비장, 간 및 내분비선에 존재한다고 보고된다.
상기 락티플랜티바실러스 플란타룸(Lactiplantibacillus plantarum) SKO-001 균주는 항염 활성을 가져 염증성 질환에 대한 예방, 개선 또는 약학 조성물로 활용될 수 있다.
상기 용어, "염증성 질환"이란 염증을 주병변으로 하는 질병으로서, 구체적으로는 염증성 장질환(inflammatory bowel diseases, IBD), 과민성 대장증후군(irritable bowel syndrome), 베체트 병(Behcet's disease), 장염(enteritis), 크론병(Crohn's disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 염증성 피부질환, 자가면역 질환, 자가면역성 염증성 질환, 인후염, 편도염, 기관지염, 폐렴, 위염, 관절염, 간염 및 신장염으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 보다 구체적으로는 염증성 장질환 또는 염증성 피부질환일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 용어, "염증성 장질환"은 호전과 재발을 반복하면서 장내 만성적인 염증 및 궤양을 일으키는 질환이다. 염증성 장질환은 환경적 요인, 유전적 요인과 함께 장 내에 정상적으로 존재하는 세균에 대한 몸의 과도한 면역반응 등이 주요 발병 원인으로 알려져 있다. 구체적으로, 염증성 장질환은 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 크론병(Crohn's disease) 등이 포함될 수 있으며, 증상, 병의 경과 및 치료방법 등이 비슷하여 이들 질환을 염증성 장질환으로 총칭할 수 있다.
상기 용어, "염증성 피부질환"은 피부에 만성적인 염증을 유발하는 질환으로, 구체적으로는 아토피 피부염, 건선 또는 피부염일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 락티플랜티바실러스 플란타룸(Lactiplantibacillus plantarum) SKO-001 균주는 β-갈락토시다아제 활성을 가짐으로써, 유당불내증 예방, 치료 또는 개선용 조성물로 유용하게 활용될 수 있다.
상기 용어, "유당불내증"이라 함은 소장의 유당분해효소 결핍 때문에 유당의 분해와 흡수가 충분히 이루어지지 않아 대장 내에서 유당은 수분을 흡인함과 동시에 대장의 세균성 유당분해에 의해 포도당 그리고 유산이 되며 이 때문에 대장의 연동운동이 자극되어 설사, 가스에 의한 복통 등의 증상을 일으키는 질환을 말한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구제 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화되어 사용할 수 있고, 제형화를 위하여 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
상기 담체 또는, 부형제 또는 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리게이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조할 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제는 상기 균주에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제조할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다.
경구를 위한 액상 제제로는 현탁액, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용하는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등을 사용할 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(Tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 구체적인 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서는 1일 0.0001 내지 2,000 mg/kg으로, 구체적으로는 0.001 내지 2,000 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어서 투여할 수도 있다. 다만, 상기 투여량에 의해서 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유 동물에 다양한 경로로 투여할 수 있다. 투여의 모든 방식은 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해서 투여할 수 있다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 건강기능식품 조성물을 포함할 수 있다. 건강기능식품 조성물에 있어서, 상기 균주를 건강기능식품의 첨가물로 사용하는 경우 이를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 예방, 건강 또는 치료 등의 각 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다.
식품의 제형은 산제, 과립제, 환, 정제, 캡슐제의 형태뿐만 아니라 일반 식품 또는 음료의 형태 어느 것이나 가능하다.
상기 식품의 종류에는 특별히 제한은 없고, 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸콜렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함할 수 있다.
일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 상기 균주는 원료 100 중량부에 대하여 0.0001~50 중량부 이하, 구체적으로는 0.1~20 중량부 이하의 양으로 첨가할 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다. 유효성분은 안전성 문제가 없기에 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있으므로 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 건강기능식품 중 음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명에 따른 음료 100 mL당 약 0.01 ~ 0.04 g, 구체적으로는 약 0.02 ~ 0.03 g일 수 있다.
상기 외에 본 발명에 따른 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제를 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명에 따른 건강기능식품 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 제한되지 않으나 본 발명에 따른 건강기능식품 조성물 100 중량부 대비 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명에 따른 사료 첨가제는 기존의 동물용 항생제를 대체하고 유해한 병원성 미생물의 생장을 억제하여 동물체의 건강상태를 양호하게 하고, 동물체의 증체량과 육질을 개선시키며, 산유량 및 면역력을 증가시키는 효과가 있다. 상기 사료 첨가제는 발효사료, 배합사료, 펠렛 형태 및 사일레지 등의 형태로 제조될 수 있다.
상기 발효사료는 상기 균주 이외의 여러 가지 미생물군 또는 효소들을 첨가함으로써 유기물을 발효시켜 제조할 수 있으며, 배합사료는 여러 종류의 일반사료와 상기 균주 등을 혼합하여 제조할 수 있다. 펠렛 형태의 사료는 상기 배합사료 등을 펠렛기에서 열과 압력을 가하여 제조할 수 있으며, 사일레지는 청예사료를 미생물로 발효시킴으로써 제조할 수 있다. 습식발효사료는 음식물 쓰레기 등과 같은 유기물을 수집 및 운반하여 살균과정과 수분조절을 위한 부형제를 일정비율로 혼합한 후, 발효에 적당한 온도에서 24시간 이상 발효하여, 수분함량이 약 70%으로 포함되도록 조절하여 제조할 수 있다. 발효건조사료는 습식발효사료를 건조과정을 추가로 거쳐 수분함량이 30% 내지 40% 정도 함유되도록 조절하여 제조할 수 있다.
또한, 상기 락티플랜티바실러스 플란타룸(Lactiplantibacillus plantarum) SKO-001 균주는 포스트바이오틱스 조성물로 유용하게 활용될 수 있다.
상기 용어, "락티플랜티바실러스 플란타룸(Lactiplantibacillus plantarum) SKO-001 균주"는 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 용어, 포스트바이오틱스는 프로바이오틱스가 발효과정 중 생산하는 유용한 대사산물과 미생물의 구성성분을 포함하는 소재이다. 즉, 프로바이오틱스에 의해서 생성되는 단쇄지방산(short-chain fatty acids), 항균 펩타이드(antimicrobial peptide), 비타민, 세포외다당류, 세포벽성분 등의 대사산물이나 생균의 프로바이오틱스를 사균화 처리한 형태를 포함한다. 최근 연구 결과들은 기존 프로바이오틱스가 갖는 다양한 질환 개선 효능이 포스트바이오틱스에서도 동등하게 유지되는 것으로 보고되었다. 또한, 포스트바이오틱스는 기존 프로바이오틱스 소재가 갖는 안전성(safety), 기능성(function), 안정성(stability)의 한계를 극복할 수 있는 새로운 대안 소재로 주목받고 있다. 이런 장점으로 포스트바이오틱스는 건강기능식품, 화장품, 의약품의 원료로 다양하게 활용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 락티플랜티바실러스 플란타룸 SKO-001 균주 분리 및 동정
본 발명의 신규 균주인 락티플랜티바실러스 플란타룸 SKO-001을 당귀에서 분리 및 동정하였다.
구체적으로, 신규 균주를 분리하기 위해 당귀(Angelica gigas) 뿌리를 시료로 사용하였다. 먼저, 당귀 뿌리에 붙은 흙을 제거한 뒤 멸균 증류수로 3회 세척하였다. 이후, 뿌리 표면을 멸균 여과지로 닦아내고 여과지를 멸균수에 희석하여 스토마커로 5분간 균질화하였다. 균질화된 샘플은 적정배율로 희석한 후 MRS 고체배지에 도말하고 37℃에서 48시간 배양하였다. 생성된 콜로니를 형태 및 색깔로 구별하여 다시 순수 분리하였다. 분리 균주의 계통을 확인하기 위해 16S rRNA 염기서열 분석을 실시한 결과, 락토바실러스 플란타룸 아종 플란타룸 종(Lactobacillus plantarum subsp. plantarum )과 서열 동일성이 99% 이었다.
추가로 더 정확한 분류 동정을 위해, 분리 균주의 전장유전체 분석을 천랩(Korea)에서 수행하였다. 구체적으로, 분리 균주의 전장유전체 서열과 이지바이오클라우드 데이터베이스(EzBioCloud Database)에서 선정된 표준 균주들의 전장유전체 서열을 비교 분석한 결과, 락토바실러스 플란타룸 아종 플란타룸 (Lactobacillus plantarum subsp. plantarum)과 유전체 염기서열 평균 유사도(Average Nucleotide Identity, ANI)가 99.02%로, 최종적으로 락토바실러스 플란타룸 아종 플란타룸 (Lactobacillus plantarum subsp. plantarum)으로 동정되었다 (표 1). 참고로, 도 1은 ANI를 이용하여 분리 균주의 유전학적 계통도(phylogenetic tree)를 나타낸 것이다.
순위 | 유사종 | ANI 유사도(%) |
1 | Lactobacillus plantarum subsp. plantarum | 99.02 |
2 | Lactobacillus plantarum subsp. argentoratensis | 95.59 |
3 | Lactobacillus paraplantarum | 88.72 |
4 | Lactobacillus fabifermentan | 85.45 |
5 | Lactobacillus pentosus | 85.19 |
6 | CM001538_s | 84.82 |
7 | Lactobacillus herbarum | 84.45 |
따라서 상기 과정을 통해 당귀에서 분리한 균주를 락티플랜티바실러스 플란타룸 (Lactiplantibacillus plantarum) SKO-001로 명명하고, 2021년 12월 8일 한국생명공학연구원 생물자원센터 (Korean Collection for Type Cultures)에 수탁번호 KCTC 14816BP로 기탁하였다.
분석된 락티플랜티바실러스 플란타룸 SKO-001의 16S rRNA 서열 정보는 다음과 같다.
GACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCA TGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGCTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATA CGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCACCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAACCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTAGGGTG
실시예 2. 락티플랜티바실러스 플란타룸 SKO-001의 균주 특성 분석
2-1. 당 대사 특성 확인
본 발명의 락티플랜티바실러스 플란타룸 SKO-001의 당 대사 특성을 API 50 CH kit (bioMerieux Vitex, France)을 이용하여 확인 후 그 결과를 하기 표 2와 같이 나타내었다.
그 결과, 하기 표 2에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 락티플랜티바실러스 플란타룸 SKO-001 균주는 L-아라비노스(L-Arabinose), 리보오스(Ribose), 갈락토오스(Galactose), D-글루코스(D-Glucose), D-프럭토스(D-Fructose), D-만노오스(D-Mannose), L-소르보오스(L-Sorbose), 만니톨(Mannitol), α-메틸-D-만노시드(α-Methyl-D-mannoside), N-아세틸-글루코사민(N-Acethyl-Glucosamine), 아미그달린(Amygdaline), 아르부틴(Arbutine), 에스쿨린(Esculine), 살리신(Salicine), 셀로비오스(Cellobiose), 말토오스(Maltose), 락토오스(Lactose), 멜리비오스(Melibiose), 수크로스(Sucrose), 트레할로오스(Trehalose), 멜리지토오스(Melizitose), D-라피노오스(D-Raffinose), 겐티비오즈(Gentibiose), D-투라노스(D-Turanose), 글루콘산염(Gluconate) 등 다양한 당을 대사할 수 있는 특성을 가짐을 확인할 수 있었다.
특히, 본 발명의 락티플랜티바실러스 플란타룸 SKO-001 균주는 갈락토오스(Galactose), 락토오스(Lactose) 및 D-라피노오스(D-Raffinose) 등의 당을 대사할 수 있다는 특징이 있어 유제품 산업에서도 활용가치가 높다는 것을 시사한다.
당 종류 | 이용성 | 당 종류 | 이용성 |
Glycerol | - | Salicin | + |
Erythritol | - | Cellobiose | + |
D-Arabinose | - | Maltose | + |
L-Arabinose | + | Lactose | + |
Ribose | + | Melibiose | + |
D-Xylose | - | Sucrose | + |
L-Xylose | - | Trehalose | + |
Adonitol | - | Inuline | - |
β-Methyl-xylose | - | Melizitose | + |
D-Galactose | + | D-Raffinose | + |
D-Glucose | + | Amidon | - |
D-Fructose | + | Glycogene | - |
D-Mannose | + | Xylitol | - |
L-Sorbose | + | Gentibiose | + |
Rhamnose | - | D-Turanose | + |
Dulcitol | - | D-Lyxose | - |
Inositiol | - | D-Tagatose | - |
Mannitol | + | D-Fucose | - |
Sorbitol | - | L-Fucose | - |
α-Methyl-D-mannoside | + | D-Arabitol | - |
α-Methyl-D-glucoside | - | L-Arabitol | - |
N-Acethyl-Glucosamine | + | Gluconate | + |
Amygdaline | + | 2-keto-gluconate | - |
Arbutine | + | 5-keto-gluconate | - |
Esculine | + |
+: Positive, -: Negative
2-2. 효소 활성 시험
본 발명의 신규 균주인 락티플랜티바실러스 플란타룸 SKO-001의 효소 활성을 API ZYM 키트(BIOMIUX, France)를 이용하여 확인하였다.
보다 구체적으로, 37℃에서 16시간 동안 배양한 균주를 원심분리(10,000rpm, 5min)하여 균체를 회수하고 1XPBS로 2회 세척한 뒤, 1.8 x 109 CFU/ml로 조정하였다. 그후 API ZYM 스트립 각 큐플에 균액을 접종하고 37℃에서 4시간 동안 호기 배양하였다. 배양 후 각 큐플에 ZYM A, B 시약을 첨가하여 5분동안 발색시킨 후 색의 강도를 통해 효소 활성을 확인하여 그 결과를 하기 표 3에 나타냈다.
하기 표 3에서 확인할 수 있듯이 본 발명의 신규 균주인 락티플랜티바실러스 플란타룸 SKO-001은 알칼리인산분해효소(Alkaline phosphatase), 류신 아릴아미다제(Leucine arylamidase), 발린 아릴아미다제(Valine arylamidase), 시스테인 아릴아미다제(Cystine arylamidase), 산성인산분해효소(Acid phosphatase), 나프톨- AS-BI-포스포하이드롤레이스(Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase), β-갈락토시다제(β-galactosidase), α-글루코시다제(α-glucosidase), β-글루코시다제(β-glucosidase), 및 N-아세틸- β-글루코사미니다제(N-acetyl-β-glucosaminidase) 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
특히, 본 발명의 신규 균주는 유해효소의 하나인 β-글루쿠손산분해효소(β-glucuronidase) 활성이 없어 안전한 것으로 확인할 수 있었으며, 또한, 유당분해효소인 β-갈락토시다제(β-galactosidase) 활성을 나타내어 유제품에 활용 시 유당불내증 개선에 도움을 줄 수 있음을 확인할 수 있다.
효소 종류 | 결과 |
Alkaline phosphatase | + |
Esterase | - |
Esterase Lipase | - |
Lipase | - |
Leucine arylamidase | + |
Valine arylamidase | + |
Cystine arylamidase | + |
Trypsin | - |
α-chymotrypsin | - |
Acid phosphatase | + |
Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase | + |
α-galactosidase | - |
β-galactosidase | + |
β-glucuronidase | - |
α-glucosidase | + |
β-glucosidase | + |
N-acetyl-β-glucosaminidase | + |
α-mannosidase | - |
α-fucosidase | - |
+: Positive, -: Negative
3. 락티플랜티바실러스 플란타룸 SKO-001의 안전성 평가 (Safety evaluation)
3-1. 항생제 내성 여부 평가
본 발명의 신규 균주인 락티플랜티바실러스 플란타룸 SKO-001의 항생제 9종 (암피실린(ampicillin), 반코마이신(vancomycin), 젠타마이신(gentamicin), 카나마이신(kanamycin), 스트렙토마이신(streptomycin), 에리트로마이신(erythromycin), 클린다마이신(clindamycin), 테트라사이클린(tetracycline) 및 클로람페니콜(chloramphenicol))에 대한 감수성을 유럽식품안전청(European Food Safety Authority, EFSA, 2018)을 기준으로 MIC 테스트를 통해 확인하였다.
구체적으로, MRS 액체 배지(broth)에 16~18시간 배양한 락티플랜티바실러스 플란타룸 SKO-001 균주를 초기 균수 5 x 105 CFU/ml이 되도록 항생제(0.125-1024 μg/ml)가 섞인 96 웰 플레이트(well plate)에 혼합하였다. 그 후 37℃에서 24시간 동안 혐기 배양하고, 마이크로플레이트 리더(microplate reader/ BioTek, USA)를 이용하여 흡광도를 측정하고 최소저해농도(MIC)를 결정하였다. 유럽식품안전청(European Food Safety Authority, EFSA, 2018)에서 설정한 파라미터에 따라 설정된 컷-오프(cut-off) 값과 같거나 낮은 특정 항생제에 대한 농도에서 억제되었을 때 감수성으로 간주하였으며, 설정된 컷-오프 값보다 높은 특정 항생제 농도에서 억제되지 않으면 내성이 있는 것으로 간주하였다.
그 결과, 하기 표 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 신규 균주인 락티플랜티바실러스 플란타룸 SKO-001 균주는 젠타마이신과 카나마이신을 제외한 대부분의 항생제에 대해 감수성을 나타내는 것으로 확인되었다.
항생제 농도 단위: μg/ml | |||||||||
AMP | VAN | GEN | KAN | STR | ERY | CLI | TET | CHL | |
EFSA Breakpoint | 2 | n.r | 16 | 64 | n.r | 1 | 2 | 32 | 8 |
L. plantarum SKO-001 of MIC | <0.125 | >512 | 32 | 256-512 | 64 | <0.125 | <0.125-0.25 | 8 | 2-4 |
결과 | S | n.r | R | R | n.r | S | S | S | S |
Abbreviations: AMP, ampicillin; VAN, vancomycin; GEN, gentamycin; KAN, kanamycin; STR, streptomycin; ERY, erythromycin; CLI, clindamycin; TET, tetracycline; CHL, chloramphenicol. n.r: not required. S : susceptible R : resistant n.d : not detected |
3.2 락티플랜티바실러스 플란타룸 SKO-001의 생체 아민(biogenic amine) 생성 분석
본 발명의 신규 균주인 락티플랜티바실러스 플란타룸 SKO-001 균주가 생체 아민을 생성하는지 여부를 HPLC를 통해 분석하였다.
구체적으로, 락티플랜티바실러스 플란타룸 SKO-001의 배양상층액을 4℃에서 6,000rpm, 5분동안 원심분리하여 얻고 0.22μm 시린지 필터(syringe filter)로 여과하였다. 이후, 상등액을 1ml에 NaHCO3 200μL, 2M NaOH 20μL, 댄실 염화물(dansyl chloride)(10mg/ml 아세톤) 0.5ml를 혼합한 후 70℃, 10분간 배양하여 유도체화 하였다. 다음으로, 본 샘플에 200 μL의 프롤린(proline)을 첨가하고 암실에서 15분동안 정치하였다. 샘플에 아세토나이트릴(aceronitrile)을 총 부피가 5ml이 되도록 첨가한 후, 0.45μm 시린지 필터(syringe filter)로 여과하여 분석 시료로 사용하였다. 생체 아민 분석은 Athena C18 컬럼(4.6 mm × 250 mm, ANPEL Laboratory analysis, Shanghai, China)이 장착된 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC; LC-NETI/ADC, Jasco, Macclesfield, UK)를 이용하였다. 이동상으로 수성 아세토나이트릴 용액(Aqueous acetonitrile solution, 67:33 of H2O)을 사용하였고, 이의 유속을 0.6ml/min으로 조정하였다. 바이오제닉아민의 정량은 UV 254nm에서 검출하여 각 생체 아민 표준용액의 검량선을 작성하여 정량하였다.
그 결과, 하기 표 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 락티플랜티바실러스 플란타룸 SKO-001은 티라민(tyramine), 히스타민(histamine), 푸트레신(putrescine), 페네틸아민(2-phenethylamine), 카다베린(cadaverine), 트립타민(tryptamine)을 생성하지 않는 것으로 확인하였다.
참고로, 생체 아민은 식품의 발효과정에서 흔히 아미노산 디카르복실라제(amino acid decarboxylase) 생산 미생물에 의해 생성되는 유해한 물질로, 체내 과다 축적 시 구토, 설사, 협압 저하 등의 증상을 유발하여 식품의 안전을 좌우하는 주요 인자로 알려져 있다. 따라서 본 발명의 균주는 생체 아민 비생성 균주로, 발효식품 및 프로바이오틱으로 조성물에 안전하게 활용될 수 있다.
균주 | 생체 아민 생성 여부 | |||||
티라민 | 히스타민 | 푸트레신 | 페네틸아민 | 카다베린 | 트립타민 | |
L. plantarum SKO-001 |
n.d | n.d | n.d | n.d | n.d | n.d |
n.d : not detected |
3.3 락티플랜티바실러스 플란타룸 SKO-001의 용혈 활성 분석 (Hemolysis test)
본 발명의 락티플랜티바실러스 플란타룸 SKO-001 균주의 용혈 활성 여부를 확인하여 안전성을 평가하였다. 이때, 양성대조군으로 β-용혈(β-hemolysis) 활성을 갖는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) ATCC25923와 γ-용혈(γ-hemolysis) 활성을 갖는 리모실락토바실러스 루테리(Limosilactobacillus reuteri) IDCC 3701를 사용하였다.
구체적으로, 5%의 양 혈액 한천 배지 (sheep blood agar plates)를 제조하고, 각 균주들을 획선도말하여 37℃에서 24시간동안 배양한 후 집락 주위의 환 형태를 통해 용혈성 유무를 판단하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 양성대조군인 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) ATCC 25923는 적혈구를 완전히 용해시켜 투명한 환을 생성하는 β형 용혈 (β-hemolysis)을 나타내고, 리모실락토바실러스 루테리(Limosilactobacillus reuteri) IDCC 3701는 γ형 용혈을 나타냈으나, 이와 달리 본 발명의 락티플랜티바실러스 플란타룸 SKO-001의 경우 어떤 용혈 활성이 나타나지 않아 안전한 것으로 확인할 수 있었다.
4. 락티플랜티바실러스 플란타룸 SKO-001의 세포 독성 평가
본 발명의 신규 균주인 락티플랜티바실러스 플란타룸 SKO-001의 배양상층액에 의한 세포생존능을 마우스 대식세포인 Raw 264.7 세포를 이용하여 확인하였다.
구체적으로, Raw 264.7 세포를 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS, Atlas, Fort Collins, CO, USA) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin, Sigma-Aldrich, St. Lousi, MO, USA)을 포함한 phenol red-free Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM, Gibco-BRL, Gaithersburg,MD, USA) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 락티플랜티바실러스 플란타룸 SKO-001의 배양상층액을 MRS 액체 배지(broth)에서 37℃에서 24시간 배양하고, 8000 rpm에서 10분간 원심분리한 뒤, 상등액을 0.22 μm 멤브레인 필터(membrane filter, Merck Millipore, Ireland)를 이용하여 필터링을 거친 후 실험에 사용하였다. 이후, Raw 264.7 세포에서 락티플랜티바실러스 플란타룸 SKO-001의 배양상층액에 대한 세포 독성을 MTT 분석을 이용하여 측정하였다. 96 웰 플레이트에 Raw 264.7 세포를 1x105cells/well의 밀도로 시딩하고 24시간 배양한 뒤, LPS(1μg/ml)과 배양상층액을 2시간 동안 처리하였다. 그 후, MTT 용액 (2.5 mg/ml in PBS)을 첨가하고 37℃에서 4시간 동안 반응시킨 후 상층액을 제거하였다. 각 웰에 DMSO를 첨가하여 포르마잔 결정을 용해시키고, 마이크로플레이트 리더(microplate reader, BioTek, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 3에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 락티플랜티바실러스 플란타룸 SKO-001의 배양상층액은 Raw 264.7 세포에 대한 세포독성이 없음을 확인하였다.
5. 락티플랜티바실러스 플란타룸 SKO-001의 항염증 활성 분석
5-1. Nitric oxide(NO) 생성 억제능
본 발명의 신규 균주인 락티플랜티바실러스 플란타룸 SKO-001의 항염증 활성을 마우스 대식세포인 Raw 264.7 세포를 이용하여 확인하였다.
구체적으로, 락티플랜티바실러스 플란타룸 SKO-001 배양상층액의 항염증 효과를 평가하기 산화 질소(NO) 생성량 감소를 측정하였다. 96 웰 플레이트에 Raw 264.7 세포를 1x105 cells/well의 밀도로 시딩하고 24시간 배양한 뒤 LPS(1μg/ml)과 SKO-001 배양상층액을 2시간 동안 처리하였다. 그 후, 각 웰의 상층액을 동량의 Griess reagent(Sigma, USA)과 혼합하여 10분 동안 실온에 방치한 후, 마이크로 플레이트 분광 광도계 (BioTek, Winooski, VT, USA)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 생성된 NO양을 표준물질인 질산나트륨(sodium nitrate)으로 표준곡선을 작성하여 계산하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, LPS 단독 처리군과 비교하여 락티플랜티바실러스 플란타룸 SKO-001과 양성대조구인 락토바실러스 람노서스 GG (LGG) 모두 NO 생성을 유의하게 억제하였다. 특히, SKO-001 처리군은 LGG보다 높은 NO 생성 저해 효과를 보였다.
5-2. iNOS, 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-6)의 mRNA 발현 억제
iNOS와 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-6)의 mRNA 발현 수준을 qRT-PCR(real-time reverse transcription-PCR)을 통해 확인하였다.
구체적으로, 상기와 동일한 조건에서 물질 처리 종료 후 멸균된 PBS로 세포를 세척하고 각 웰에서 Trizol 시약(ThermoFisher Scientic, USA)을 사용하여 total RNA를 추출하고, cDNA 합성 키트(cDNA synthesis kit, ThermoFisher Scientic, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. GAPDH, iNOS, COX-2 유전자는 다음 프라이머 쌍을 사용하여 qRT-PCR을 진행하여 증폭되었다. GAPDH: Forward (5'-ACTCCACTCACGGCAAATTC-3')와 Reverse (5'-GTCATGAGCCCTTCCACAAT-3'); iNOS : Forward (5'-CAGCGGAGTGACGGCAAACAT-3')와 Reverse (5'-GCAAGACCAGAGGCAGCACATC-3'); TNF-α: Forward (5'-AACTAGTGGTGCCAGCCGAT-3')와 Reverse (5'-CTTCACAGAGCAATGACTCC-3'); IL-6: Forward (5'-GTTCTCTGGGAAATCGTGGA-3')와 Reverse (5'-GGAAATTGGGGTAGGAAGGA-3').
그 결과, 도 5a에 나타난 바와 같이, 본 발명의 락티플랜티바실러스 플란타룸 SKO-001의 배양상측액은 LPS 단독 처리구와 비교하여 NO 생성 관련 효소인 iNOS의 mRNA 발현을 유의하게 억제하였다. 양성대조구로 사용한 LGG 처리구에서 iNOS 억제 경향이 관찰되었지만 유의하지 않았다. 이러한 결과는 SKO-001이 전사수준에서 iNOS 유전자를 조절하여 NO 생성을 효과적으로 억제한다는 것을 의미한다.
나아가, 락티플랜티바실러스 플란타룸 SKO-001의 배양상층액이 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-6)의 유전자 발현에 미치는 효과는 도 4b, 4c에 나타내었다. 그 결과, 도 5b 및 5c에서 확인할 수 있는 것과 같이, SKO-001 처리군은 LPS에 의해 증가된 TNF-α와 IL-6의 mRNA 발현을 유의하게 억제하였다.
결론적으로, 본 발명의 락티플랜티바실러스 플란타룸 SKO-001은 LPS에 의해 유도된 NO 생성과 iNOS, TNF-α 및 IL-6의 발현을 억제하여 항염증 활성을 보임을 확인하여, 염증성 질환에 대하여 예방, 개성 또는 치료 용도로 사용할 수 있음을 알 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
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<400> 1
gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgaac gaactctggt attgattggt 60
gcttgcatca tgatttacat ttgagtgagt ggcgaactgg tgagtaacac gtgggaaacc 120
tgcccagaag cgggggataa cacctggaaa cagatgctaa taccgcataa caacttggac 180
cgcatggtcc gagcttgaaa gatggcttcg gctatcactt ttggatggtc ccgcggcgta 240
ttagctagat ggtggggtaa cggctcacca tggcaatgat acgtagccga cctgagaggg 300
taatcggcca cattgggact gagacacggc ccaaactcct acgggaggca gcagtaggga 360
atcttccaca atggacgaaa gtctgatgga gcaacgccgc gtgagtgaag aagggtttcg 420
gctcgtaaaa ctctgttgtt aaagaagaac atatctgaga gtaactgttc aggtattgac 480
ggtatttaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg 540
gcaagcgttg tccggattta ttgggcgtaa agcgagcgca ggcggttttt taagtctgat 600
gtgaaagcct tcggctcaac cgaagaagtg catcggaaac tgggaaactt gagtgcagaa 660
gaggacagtg gaactccatg tgtagcggtg aaatgcgtag atatatggaa gaacaccagt 720
ggcgaaggcg gctgtctggt ctgtaactga cgctgaggct cgaaagtatg ggtagcaaac 780
aggattagat accctggtag tccataccgt aaacgatgaa tgctaagtgt tggagggttt 840
ccacccttca gtgctgcagc taacgcatta agcattccgc ctggggagta cggccgcaag 900
gctgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc 960
gaagctacgc gaagaacctt accaggtctt gacatactat gcaaatctaa gagattagac 1020
gttcccttcg gggacatgga tacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga 1080
tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttattatc agttgccagc attaagttgg 1140
gcactctggt gagactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc 1200
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tcgcgagagt aagctaatct cttaaagcca ttctcagttc ggattgtagg ctgcaactcg 1320
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cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgagagtttg taacacccaa agtcggtggg 1440
gtaacctttt aggaaccagc cgcctaaggt gggacagatg attagggtg 1489
Claims (11)
- 수탁번호 KCTC 14816BP로 기탁된 락티플랜티바실러스 플란타룸(Lactiplantibacillus plantarum) SKO-001 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물, 상기 균주의 추출물, 상기 배양물의 추출물 및 상기 파쇄물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 항염증용 식품 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1로 표시되는 16S rRNA 서열을 가지는 것인, 항염증용 식품 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 균주는 유당불내증 개선, 항염 또는 항생제에 대한 감수성을 가지는 것인, 항염증용 식품 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 균주는 추가로 용혈 활성이 없고, 생체 아민 또는 β-글루쿠론산분해효소(β-glucuronidase)을 생성하지 않는 것인, 항염증용 식품 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 항생제는 암피실린(ampicillin), 반코마이신(vancomycin), 젠타마이신(gentamicin), 카나마이신(kanamycin), 스트렙토마이신(streptomycin), 에리트로마이신(erythromycin), 클린다마이신(clindamycin), 테트라사이클린(tetracycline) 및 클로람페니콜(chloramphenicol)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 항염증용 식품 조성물.
- 수탁번호 KCTC 14816BP로 기탁된 락티플랜티바실러스 플란타룸(Lactiplantibacillus plantarum) SKO-001 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물, 상기 균주의 추출물, 상기 배양물의 추출물 및 상기 파쇄물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 염증성 질환은 염증성 장질환(inflammatory bowel diseases, IBD), 과민성 대장증후군(irritable bowel syndrome), 베체트 병(Behcet's disease), 장염(enteritis), 크론병(Crohn's disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 염증성 피부질환, 자가면역 질환, 자가면역성 염증성 질환, 인후염, 편도염, 기관지염, 폐렴, 위염, 관절염, 간염 및 신장염으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인, 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 균주는 NO 생성을 억제하고, iNOS, TNF-α 및 IL-6의 발현을 억제하는 것이 특징인, 항염증용 식품 조성물.
- 삭제
- 삭제
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Publication number | Publication date |
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KR20230172285A (ko) | 2023-12-22 |
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AMND | Amendment | ||
X701 | Decision to grant (after re-examination) |