KR20180118362A

KR20180118362A - 항염증 및 대사성 질환 개선 효과를 갖는 락토바실러스 플란타룸 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20180118362A
Application number: KR1020170051574A
Authority: KR
Inventors: 지요셉; 박소영; 홀잡펠 빌헤름
Original assignee: 한동대학교 산학협력단
Priority date: 2017-04-21
Filing date: 2017-04-21
Publication date: 2018-10-31

Abstract

본 발명은 항염증 및 대사성 질환 개선 효과를 갖는 락토바실러스 플란타룸 균주 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게 본 발명은 항염증 및 대사성 질환 개선 효과를 갖는 락토바실러스 플란타룸 균주, 이를 포함하는 프로바이오틱스 제제, 건강기능식품 조성물 및 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 HAC03 균주는 내산성 및 내담즙성이 우수하고, 다양한 종류의 항생제에 대한 내성이 없으며, 생체 아민 생성능이 없고, 장내 짧은 사슬 지방산 생산을 촉진시켜 프로바이오틱스 제제, 만성염증을 완화할 수 있는 기능성 식품, 기능성 식품 첨가제, 다양한 유산균 발효 제품을 생산하기 위한 기능성 스타터로서도 사용될 수 있을 것으로 기대되며 항염증 및 대사성 질환의 예방/개선을 위한 건강기능 식품 또는 약학적 조성물로도 이용 가능하므로, 산업적으로 유용할 것으로 기대된다.

Description

항염증 및 대사성 질환 개선 효과를 갖는 락토바실러스 플란타룸 균주 및 이의 용도{Lactobacillus plantarum having anti-inflammation and metabolic disease improvement effect and uses thereof}

본 발명은 항염증 및 대사성 질환 개선 효과를 갖는 락토바실러스 플란타룸 균주 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게 본 발명은 항염증 및 대사성 질환 개선 효과를 갖는 락토바실러스 플란타룸 균주 HAC03, 이를 포함하는 프로바이오틱스 제제, 건강기능식품 조성물 및 약학적 조성물에 관한 것이다.

유산균은 인간과 그 역사를 함께 해왔으며, 인간의 건강에 매우 유익한 영향을 미치는 미생물로서 그 유용성이 날로 증가하고 있다. 최근에는 유산균에 대한 연구가 활발히 진행되어 일반 식품뿐만 아니라 건강식품 및 약품으로서 개발되는 등 그 응용범위가 넓어지고 있다. 이러한 유산균들은 동물의 장내에 서식하면서 동물이 섭취한 영양분 및 섬유소 등을 분해시켜 에너지원으로 사용하고, 젖산 및 항생물질 등을 생산하여 장내 유해균의 발육을 억제함으로써 장내 건강유지에 중요한 역할을 한다. 또한, 유산균은 동물의 성장촉진 및 사료 이용률 개선, 병에 대한 저항력증가, 유해세균의 증식억제, 폐사율 감소, 부패 독성물질의 생성 억제 및 각종 비타민 생성에도 이용되고 있다. 그러나 상기와 같은 효능을 발휘하려면 외부로부터 유입되는 유산균이 아무런 장애 없이 장내에 도달하여 그 기능을 나타내어야 한다. 그러기 위해서는 경구 투여 시 위산에 의한 파괴가 적어야 하며, 담즙산에 대한 내성이 강해야 한다.

비만은 외관상의 심미적 측면에서도 사회적 이슈가 되고 있지만, 사실 이로 인해 당뇨, 고혈압 등의 대사질환 합병증과 같은 건강상의 심각한 위험이 초래될 수 있다는 점이 비만의 가장 심각한 문제점이다. 이와 같은 비만의 병적인 상태와 관계 있는 증상이 비만 개체에게서 나타나는 전신성 만성염증(systemic chronic inflammation)이다. 염증반응은 체내에서 일어나는 면역 기작의 하나로서, 국소적으로 발생할 시 외부로부터의 병균이나 바이러스의 침입으로부터 몸을 방어하는 중요한 반응이다. 그러나 이와 같은 염증반응이 체내 면역반응의 균형 붕괴로 인하여 전신적, 만성적으로 과다하게 활성화 되면 체내에서 일어나는 대사작용에 장애를 유발하게 된다.

비만으로 인해 유발되는 만성염증 반응은 당뇨, 심혈관계질환, 동맥경화 등 각종 대사성 질환의 원인으로 밝혀지고 있으며 비만을 질병으로 규정하는 가장 중요한 요소이기도 하다. 만성염증 반응으로 인한 이차적 대사성 질환의 발병 없이는 비만은 단순히 미용상의 문제이며, 최근 세계보건기구에서도 당뇨와 같이 삶의 질을 현저히 떨어트리는 이차적 대사성 질환을 유발할 수 있는 만성 염증반응을 이유로 들어 비만을 질병으로 규정한 바 있다.

한편, 한국공개특허 제2011-0000871호에는 '항산화 및 항염증 효능을 갖는 락토바실러스 플란타룸 에이취와이 7711 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품'이 개시되어 있으나, 본 발명의 항염증 및 대사성 질환 개선 효능을 모두 가지는 락토바실러스 플란타룸 균주에 관해서는 개시된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 백김치로부터 내산성과 내담즙성이 강하고, 생체 아민 생성능이 없으며, 항생제에 대한 내성이 없는 락토바실러스 플란타룸 HAC03 균주를 분리하였고, 상기 균주를 쥐의 맹장에 접종하였을 때 대조군에 비해 짧은 사슬 지방산 생성이 현저히 높은 점을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 항염증 및 대사성 질환의 예방 또는 개선 효능을 갖는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HAC03 균주(기탁번호: KCTC13242BP)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액 및 건조물로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스 제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액 및 건조물로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 식품 및 음료를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액 및 건조물로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 항염증 및 대사성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액 및 건조물로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 항염증 및 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 락토바실러스 플란타룸 HAC03 균주는 내산성 및 내담즙성이 우수하고, 다양한 종류의 항생제에 대한 내성이 없으며, 생체 아민 생성능이 없고, 다양한 염증 유발 사이토카인의 발현을 억제하는 효능을 가짐으로써, 프로바이오틱스 제제, 만성염증을 완화할 수 있는 기능성 식품, 기능성 식품 첨가제 등으로 활용할 수 있으며, 다양한 유산균 발효유 및 발효 제품을 생산하기 위한 발효식품 기능성 스타터로서도 사용될 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 HAC03 균주는 장내 짧은 사슬 지방산 생산을 촉진시켜 혈중 글루코스, 콜레스테롤 및 중성지방의 수준을 완화시킴으로써 항염증 및 대사성 질환의 예방/개선을 위한 건강기능 식품 또는 약학적 조성물로도 이용 가능하므로, 산업적으로 유용할 것으로 기대된다.

도 1은 마우스 맹장에 유산균을 접종한 후 짧은 사슬 지방산 양을 분석한 결과이다. A는 아세트산, B는 프로피온산, C는 뷰트린산, D는 짧은 사슬 지방산의 총량을 분석한 결과이다(control: 대조군, HAC02: Lactobacillus plantraum HAC02 접종, HAC03: Lactobacillus plantraum HAC03 접종, HAC07: Lactobacillus plantraum HAC07 접종, 299v(비교예): Lactobacillus plantraum 299v 접종). 결과값은 평균과 표준편차로 표현되었으며, 대조군(control)과 ANOVA로 비교하여 p<0.05 일 때 *, p<0.01 일 때 **, p<0.001 일 때 ***로 표기하였다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항염증 및 대사성 질환 예방 또는 개선 효능을 갖는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HAC03 균주를 제공한다.

본 발명자들은 백김치로부터 유산균인 락토바실러스 플란타룸 균을 분리하고, 분리한 유산균의 내산성 및 내담즙성, 항생제 내성 및 생체 아민 생성능을 분석한 결과, 분리한 유산균이 우수한 내산성 및 내담즙성을 보이며, 항생제 내성이 없고, 생체 아민 생성능이 없음을 확인하여, 상기 분리한 균주를 락토바실러스 플란타룸 HAC03으로 명명하고 한국생명공학연구원에 2017년 4월 10일 기탁하였다(수탁번호: KCTC 13242BP).

본 발명의 일실시예에 따른 균주에 있어서, 상기 대사성 질환은 비만, 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 고콜레스테롤증, 동맥경화증, 지방간, 심혈관 질환 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일실시예에 따른 상기 균주는 에리트로마이신, 젠타마이신, 암피실린, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 시프로플록사신 또는 페니실린에 대한 내성이 없는 것이나, 상기 열거한 항생제에 한정되지 않는다.

본 발명의 일실시예에 따른 상기 균주는 티로신, 히스티딘, 오르니틴 또는 라이신 아미노산 전구체로부터 티라민, 히스타민, 푸트레신 또는 카다베린과 같은 생체 아민을 생성하지 않는 것을 특징으로 하나, 상기 열거한 생체 아민에 한정되지 않는다.

본 발명의 일실시예에 따른 상기 균주는 짧은 사슬 지방산(short chain fatty acids)을 생성함으로써 항염증 및 대사성 질환의 예방 또는 개선 효과를 갖는 것을 특징으로 한다. 상기 짧은 사슬 지방산은 아세트산, 프로피온산 또는 뷰트린산일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 락토바실러스 플란타룸 HAC03 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액 및 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스 제제를 제공한다.

본 발명의 락토바실러스 플란타룸 HAC03 균주는 우수한 내산성 및 내담즙성을 보유하고 있으며, 과민성 면역반응을 유발할 수 있는 생체 아민 생성능이 없고, 에리트로마이신, 젠타마이신, 암피실린, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 시프로플록사신 및 페니실린 등의 항생제에 대한 내성이 관찰되지 않아 프로바이오틱스로서 유용하게 이용될 수 있다.

상기 프로바이오틱스 제제는 당업계에 공지된 방법에 따라 다양한 제형과 방법으로 제조 및 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 HAC03 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물은 약제학적 분야에서 통상적으로 사용되는 담체와 혼합하여 산제(powder), 액제(liquids and solutions), 정제(tablet), 캡슐(capsule), 시럽(syrup), 현탁제(suspension) 또는 과립제(granule) 등의 형태로 제조되어 투여될 수 있다. 상기 담체로는 예를 들어, 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 투여 용량은 체내에서의 활성성분의 흡수도, 불활성률, 배설속도, 피투여자의 연령, 성별, 축종, 상태 및 질병의 중증 정도 등에 따라 적절히 선택할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 락토바실러스 플란타룸 HAC03 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액 및 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 항염증 및 대사성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 건강기능식품 조성물은 정제, 과립, 분말, 캅셀, 액상의 용액 및 환으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형으로 제조된 것일 수 있다. 본 발명에 따른 건강기능식품 조성물은 상기 락토바실러스 플란타룸 HAC03 균주 등을 유효성분으로 포함시켜 분말제, 액제, 정제, 연질캅셀제, 과립제, 티백차, 인스턴트 차 또는 드링크제 등의 형태로 제형화될 수 있다. 유효 성분으로서의 락토바실러스 플란타룸 HAC03 균주의 함량은 그 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 조성물 중에 포함되는 락토바실러스 플란타룸 HAC03 균주의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량%로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 식품 조성물은 락토바실러스 플란타룸 HAC03 균주 이외에 본 발명이 목적으로 하는 주효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 바람직하게는 주효과에 상승효과를 줄 수 있는 다른 성분을 함유하는 것도 무방하다.

상기와 같은 형태로 제형화된 식품 조성물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능 식품은 모두 포함한다.

본 발명의 식품 조성물이 음료인 경우는 지시된 비율로 필수성분으로서 락토바실러스 플란타룸 HAC03 균주를 함유하며, 그 밖의 음료 제조를 목적으로 사용되는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 및 합성 향미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

또한 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍 미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에도 본 발명의 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 HAC03 균주 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

또한, 본 발명은 상기 락토바실러스 플란타룸 HAC03 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액 및 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 항염증 및 대사성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 항염증 및 대사성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 처리량은 약학적으로 유효한 양이어야 한다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 유효량은 당업자에게 인식되어 있듯이 처리의 경로, 부형제의 사용 및 다른 약제와 함께 사용할 수 있는 가능성에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 항염증 및 대사성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 약학적 제형으로 제조될 수 있다. 제형의 제조에 있어서, 활성 성분을 담체와 함께 혼합 또는 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다.

따라서, 본 발명의 항염증 및 대사성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제 및 패치의 형태로 제형화하여 사용될 수 있고, 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 백김치로부터 균주의 분리 및 동정

만든지 10 ~ 15일 정도 되어 발효가 진행중인 백김치를 구입한 후에 pH를 측정하고 유산균을 분리하였다.

고압 멸균된 비닐백에 90 mL 생리식염수(0.85% NaCl/L)를 넣고, 백김치 샘플 10 g을 넣어 5분 간 200 rpm에서 균일하게 혼합하였다. 1 ml를 분주하여 9 ml의 생리식염수(0.85% NaCl/L)에 10배수로 계단 희석하여 MRS 고체배지(5.5% Lactobacillus MRS broth, BD Difco, USA 및 1.5% Bacteriological Agar, Affymetrix, USA)에 도말 하였다. 그 후 37℃ 배양기에서 24 ~ 48시간 동안 키우고, 분리 및 동정하였다.

먼저, 플레이트 상의 균주 종류를 추정하기 위해 현미경 관찰로 콜로니 형태를 비교하였으며, 세포 형태가 끝이 둥근 형태의 짧은 로드(rod) 모양인 균은 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)로, 볼록한 형태의 짧거나 중간 길이의 로드 모양은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)으로, 구형의 로드 모양은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)로 추정하였다.

다음으로 자라난 균을 0.3% 과산화수소를 이용하여 37℃에서 24 ~ 48시간 동안 배양하면서 카탈라제 활성(catalase activity) 및 그람 염색 분석을 수행하였다. 카탈라제 음성 균주는 양방향 16S rDNA 유전자 염기서열을 분석을 통해 분류학적 종(species)을 규명하였다. 균주의 염기서열 규명은 ㈜솔젠트(한국)에 의뢰하여 수행하였다.

백김치로부터 분리한 본 발명의 균주는 카탈라제 음성이고, 그람 양성이며, 로드 모양인 균주로서 락토바실러스 플란타룸으로 확인되었고, 락토바실러스 플란타룸 HAC03으로 명명하였다.

본 발명에서 분리된 락토바실러스 플란타룸 HAC03 균주의 당 이용 특성을 API 50 CH 키트(Biomerieux)를 사용하여 해당 매뉴얼의 방법을 따라 수행하여 검사하였다. 각 균주의 당 이용 특성은 하기 [표 1]과 같이 나타났다.

당종류	이용성	당종류	이용성
CONTROL	-	Esculin ferric citrate	++
Glycerol	-	Salicin	++
Erythritol	-	D-celobiose	++
D-arabinose	-	D-maltose	++
L-arabinose	++	D-lactose	++
D-rivose	++	D-melibiose	++
d-xylose	-	D-saccharose (sucrose)	++
l-xylose	-	D-trehalose	++
d-adonitol	-	Inulin	-
methyl-βD-xylopyranoside	-	D-melezitose	++
d-galactose	++	d-raffinose	+
d-glucose	++	Amdon(starch)	-
D-fructose	++	Glycogen	-
D-manose	++	Xylitol	-
L-sorbose	-	Gentiobiose	++
L-rhamnose	-	D-turanose	++
dulcitol	-	D-lyxose	-
inositol	-	D-tagatose	-
D-manitol	++	D-fucose	-
D-sorbitol	++	L-fucose	-
Methyl-αD-Mannopyranoside	++	D-arabitol	-
Methyl-αD-glucopyranoside	-	L-arabitol	-
N-acetylglucosamine	++	Potassium GlucoNaTe	+
Amygdalin	++	Potassium 2-KetoGluconate	-
Arbutin	++	Potassium 5-KetoGluconate	-

실시예 2. 락토바실러스 플란타룸 HAC03 균주의 생체 아민 생성 여부 분석

생체 아민(biogenic amines)은 식품의 발효에 의해 생성되고, 미생물 종류 또는 화학적, 물리적 조건에 따라 다양할 수 있다. 발효 식품에 생성된 생체 아민은 식중독 또는 알러지 반응을 일으킬 수 있기 때문에 식품 공학적으로 안전한 균주를 선택하기 위한 중요한 기준이 된다.

이에 본 발명의 균주의 생체 아민 형성 여부를 확인하기 위해 MRS 액체 배지, 37℃ 조건에서 16시간 동안 자란 균주를 Bover-Cid 및 Holzapfel(1999)에 따른 특수 배지로 옮기고 37℃에서, 48시간 동안 배양하였다.

티로신(tyrosine), 히스티딘(histidine), 오르니틴(ornithine) 및 라이신(lysine) 각각의 아미노산 전구체를 첨가한 MRS 액체 배지를 제조하고, 각각의 배지에서 균주에 의해 생체 아민(티라민(tyramine), 히스타민(histamine), 푸트레신(putrescine) 및 카다베린(cadaverine))이 생성되는지 확인하였다. 구체적으로 상기 아미노산 전구체 0.1%를 첨가한 MRS 액체 배지에 분리한 락토바실러스 플란타룸 균주를 1%씩 접종한 뒤, 5 ~ 10번 계대 배양하여, 탈탄산효소(decarboxylase)를 활성화시켰다. 탈탄산효소 배지[트립톤 0.5%, 효모 추출물 0.5%, 고치 추출물 0.5%, 염화나트륨 0.5%, 글루코스 0.25%, 트윈-80 0.05%, 황산마그네슘 0.02%, 황산망간 0.005%, 황산철 0.004%, 시트르산염 0.2%, 티아민 0.001%, K2PO4 0.2%, 탄산칼슘 0.01%, 피로독살-5-포스페이트(pyridoxal-5-phosphate) 0.005%, 아미노산 1%, 브로모크레솔 퍼플(bromocresol purple) 0.006% 및 한천 2%를 증류수에 섞은 후 pH를 5.3으로 맞추어 사용]에 효소 활성화된 균을 도말한 후 37℃에서 24 ~ 48시간 배양하여 보라색으로 색이 변하는지를 확인함으로써 생체 아민 생성능을 판별하였다.

탈탄산효소 배지 속에 있는 브로모크레솔 퍼플은 pH 5.2에서 노란색을 띄지만 pH가 6.8로 올라갈수록 보라색으로 변한다. 따라서 생체 아민 생성으로 인해 pH가 올라갈 때 보라색으로 변하는 것을 이용하여 생체 아민 생성을 확인할 수 있다.

본 발명의 균주 락토바실러스 플란타룸 HAC03의 생체 아민 생성능을 분석한 결과, 하기 [표 2]에 나타난 바와 같이 티로신, 히스티딘, 오르니틴 및 라이신에 대하여 모두 음성으로 확인되었다. 이로부터 본 발명의 균주는 과민성 면역반응을 유발할 수 있는 생체 아민 생성능이 없음을 확인할 수 있었다.

	아미노산 전구체로부터 생체 아민 생성 여부
균주 이름	티로신	히스티딘	오르니틴	라이신
L. plantarum HAC03	-	-	-	-

실시예 3. 락토바실러스 플란타룸 HAC03 균주의 항생제 내성

에리트로마이신(erythromycin), 젠타마이신(gentamycin), 암피실린(ampicillin), 테트라사이클린(tetracycline), 클로람페니콜(chloramphenicol), 스트렙토마이신(streptomycin), 시프로플록사신(ciprofloxacin) 및 페니실린 지(penicillin G)에 대한 상기 분리한 균주의 항생제 내성을 확인하였다.

구체적으로, 각각의 항생제를 계단 희석(1:2)하고, 0.025 ~ 64 ㎍/ml의 농도로 MRS 고체배지에 혼합하였다. 18시간 배양한 락토바실러스 플란타룸 균주를 1 x 10⁵ CFU가 되도록 상기 항생제가 섞인 고체배지에 접종한 후, 37℃에서 24시간 동안 배양하여 최소저해농도(MIC)를 측정하였다.

그 결과 하기 [표 3]에 나타난 바와 같이, 에리트로마이신, 젠타마이신, 암피실린, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 시프로플록사신 및 페니실린의 총 8종의 항생제에 대하여 최소저해농도를 기준으로 내성이 없음을 확인하였다.

균주	최소저해농도 (㎍/mL)
균주	Em	Gm	Am	Te	Ch	Sm	Ci	Pe
L. plantarum HAC03	<0.25	32	2	64	4	>128	32	2
기준값	4	128	4	64	16	>256	>32	4
* Em: 에리트로마이신; Gm: 젠타마이신; Am: 암피실린; Te: 테트라사이클린; Ch: 클로람페니콜; Sm: 스트렙토마이신; Ci: 시프로플록사신; Pe: 페니실린 G * 기준값 : Danielsen and Wind (2003)에 따른 락토바실러스 플란타룸 항생제 내성 판별 기준값

실시예 4. 락토바실러스 플란타룸 HAC03 균주의 내산성 및 내담즙성 분석

유산균은 음식물과 함께 섭취하였을 때 강한 위산을 분비하는 위에서 1시간 정도 머무르고, 십이지장의 고농도 담즙에서 2시간 정도 머무른 후 장으로 이동하게 된다. 유산균이 이런 극심한 환경에서 살아남아 장으로 들어갈 수 있어야 장에 달라붙어 숙주에게 좋은 영양을 끼치게 되며, 프로바이오틱스로서의 역할을 할 수 있다. 따라서 본 발명에서 분리한 유산균의 내산성 및 내담즙성을 확인하기 위하여 인체(위와 십이지장) 환경과 비슷한 조건으로 설정된 SSDP(simulated stomach duodenum passage) 방법을 수행하였다.

구체적으로, 상기 분리한 락토바실러스 플란타룸 균주를 37℃에서 16시간 동안 MRS 액체 배지 배양시킨 후, 1 ml의 균주액을 멸균된 일회용 튜브에 담아 12,000 x g로 5분 간 4℃에서 원심분리한 후, 상층액은 버리고 세포 펠렛은 생리식염수로 씻어주는 과정을 2회 반복 수행하였다. 그 후 생리식염수를 제거하고, 침전된 균을 pH 3으로 조절된 MRS 액체배지 10 ml에 섞은 후 충분히 섞어주었다. 그 현탁액 중 1 ml을 취해 10배로 계단식 희석하여 MRS 고체배지에 도말하고 초기 세포수(CFU/ml)를 계수하였다. 나머지 9 ml은 37℃에서 한 시간 동안 배양한 후, 4 ml의 담즙산(bile acid; 10 g 옥스갈(oxgall)에 증류수 100ml을 섞고 고압멸균하여 사용)과 17 ml의 십이지장액(duodenum juice; 6.4 g/L NaHCO₃, 0.239 g/L KCl 및 1.28 g/L NaCl을 증류수에 잘 섞은 후 pH를 7.4로 맞추어 고압멸균하여 사용)을 연속적으로 섞어 주었다. 이를 37℃ 배양기에서 2시간 이상 배양 후 10배씩 계단 희석하고 MRS 고체배지에 도말하여 살아남은 균의 수를 계수하였다. 그리고 상기에서 계수된 최초 균의 세포수(CFU/ml)와 배양 1시간 후 및 3시간 후 살아 남아 있는 균의 세포수(CFU/ml)를 비교하여 생존률로 나타내었다(표 4).

균주의 내산성 및 내담즙성 분석 시, 이미 잘 알려진 프로바이오틱스 균주인 락토바실러스 람노서스 GG를 동시에 비교하였는데, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 HAC03 균주의 생존률이 약 19%로 비교 균주보다 우수한 내산성 및 내담즙성을 나타내는 것으로 확인되었다.

	초기 세포수 (log CFU/mL)	pH 3.0에서 1시간 후 (log CFU/mL)	3.25% 옥스갈에서 2시간 이상 후 (log CFU/mL)	총 생존률(%)
L. plantarum HAC03	9.49±0.020	9.42±0.035	8.76±0.011	18.72±0.398
L. rhamnosus GG	9.12±0.311	8.54±0.281	6.82±0.064	0.54±0.293

실시예 5. 락토바실러스 플란타룸 균주의 짧은 사슬 지방산 생산 효과

장내 유산균은 장내 물질을 이용하여 대사 산물을 생성함으로써 숙주인 인체와 쌍방향으로 영향을 미친다. 장내 세균은 탄수화물을 섭취하고 분해하여 짧은 사슬 지방산(SCFAs; short chain fatty acids)을 생산하며, 생산된 짧은 사슬 지방산들은 장내에서 여러 가지 유익한 기능을 한다. 아세트산(acetate), 프로피온산(propionate), 뷰트린산(butyrate)을 포함하는 짧은 사슬 지방산은 장 운동성을 높이고, 병원균의 정착을 방해하는 기능을 하며, 장 점막 상피세포의 에너지원으로서 작용하여 신진대사를 활성화하고 지방 축적을 막음으로써 비만 예방에 도움을 줄 수 있다. 또한 짧은 사슬 지방산이 장내에서 흡수되어 간으로 들어가면 콜레스테롤 합성을 감소시켜 혈중 콜레스테롤 농도를 낮추고 당 흡수를 저해하여 고지혈증, 당뇨와 같은 대사성 질환의 예방 및 치료에 도움을 준다.

마우스 맹장 샘플을 각각의 유산균주와 공배양(co-culture)하여 짧은 사슬 지방산의 변화량을 측정함으로써 비교적 간단하게 균주들의 장내 생성능을 조사할 수 있다. 본 발명에서는 상기 분리한 락토바실러스 플란타룸 균주가 장내에서 생산하는 짧은 사슬 지방산을 확인하기 위하여 동물 실험을 수행하였다.

구체적으로, 7주령의 수컷 C57BL/6J 쥐(specific pathogen free)를 구입한 후 23℃, 55±10% 습도, 12시간 명/암 주기의 환경에서 키웠다. 마우스 맹장을 분리하고 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 HAC03 균주 또는 비교 균주(Lactobacillus plantraum 299v)를 각각 접종한 후, 혐기 챔버 내에서 6시간 동안 배양하였다. 이를 혐기 환경에서 발효시킨 후, 가스 크로마토그래피(gas chromatography, Shimadzu GC2010)를 통해 각각의 시료 내 짧은 사슬 지방산 양을 분석하였다. 대조군으로는 균주 대신 동일한 양의 멸균된 PBS를 접종하여 그 결과를 비교하였다. 배양액 중의 짧은 사슬 지방산 양을 비교함으로써 프로바이오틱스에 의한 장균총의 짧은 사슬 지방산 생성능 변화를 확인할 수 있었다.

가스 크로마토그래피는 Shimadzu GC2010 사의 기기를 이용하여 분석하였다. Sigma(Supelco) 사의 휘발성 지방산 조성물(volatile fatty acid mixture, ultrapure)을 사용하여 표준곡선(standard curve)과 피크 검출 시간(retention time)을 분석한 후 분변에서 짧은 사슬 지방산을 추출하여 표준 곡선과 대조하였다.

짧은 사슬 지방산 추출은 Schwiertz et. Al.,(2009)에서 기술한 방법을 사용하였다. 간략하게 옥살산(oxalic acid; 0.1 mole/L)과 아지드화나트륨(sodium azide; 40 mmole/L)이 들어간 추출액을 샘플(최대 80 mg)에 섞은 후, 1시간 동안 상온에서 진탕 배양(shaking incubation)하고, 16,000 x g, 24℃에서 5분간 원심분리하여 수득한 상득액을 FID 기기를 사용해 분석하였다. 컬럼은 HP INNO-WAS 30 m x 32 mm를 사용하여 스플리터(splitter) 온도 260℃, FID 260℃, 컬럼은 100℃에서 180℃까지 25℃/m 의 속도로 27.1 psi 압력으로 분석하였다.

그 결과 도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 HAC03는 균주를 접종하지 않은 대조군에 비하여 프로피온산(도 1B) 생산량이 유의적으로 증가하였고, 짧은 사슬 지방산의 총 생산량(도 1D)에 있어서 대조군뿐만 아니라 락토바실러스 플란타룸 299v 균주에 비해서도 유의미하게 높은 것을 확인할 수 있었다.

Claims

항염증 및 대사성 질환의 예방 또는 개선 효능을 갖는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HAC03 균주(기탁번호: KCTC13242BP).
제1항에 있어서,
상기 대사성 질환은 비만, 당뇨병, 고지혈증, 고콜레스테롤증, 동맥경화증, 지방간 및 심혈관 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타룸 HAC03 균주.
제1항에 있어서,
상기 균주는 에리트로마이신, 젠타마이신, 암피실린, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 시프로플록사신 및 페니실린으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 항생제에 대한 내성이 없는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타룸 HAC03 균주.
제1항에 있어서,
상기 균주는 티로신, 히스티딘, 오르니틴 및 라이신으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 전구체로부터 생체 아민을 생성하지 않는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타룸 HAC03 균주.
제1항에 있어서,
상기 균주는 짧은 사슬 지방산(short chain fatty acids)을 생성함으로써 항염증 및 대사성 질환의 예방 또는 개선 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타룸 HAC03 균주.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액 및 건조물로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스 제제.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액 및 건조물로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 항염증 및 대사성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제7항에 있어서,
상기 대사성 질환은 비만, 당뇨병, 고지혈증, 고콜레스테롤증, 동맥경화증, 지방간 및 심혈관 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액 및 건조물로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 항염증 및 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제9항에 있어서,
상기 대사성 질환은 비만, 당뇨병, 고지혈증, 고콜레스테롤증, 동맥경화증, 지방간 및 심혈관 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.