KR101683686B1 - 담즙산 분해능 및 간 세포 내 HMG-CoA 환원효소 활성 억제능이 우수한 락토바실러스 플랜타럼 LLP5273 균주 및 이의 용도 - Google Patents
담즙산 분해능 및 간 세포 내 HMG-CoA 환원효소 활성 억제능이 우수한 락토바실러스 플랜타럼 LLP5273 균주 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 김치로부터 분리한 신규한 유산균인 락토바실러스 플랜타럼 LLP5273에 관한 것이다. 락토바실러스 플랜타럼 LLP5273은 복합담즙산에 대한 분해력이 뛰어나고 내산성 및 내담즙성이 우수하여 장내에 무사히 도달할 수 있다. 또한 균체 파쇄물로 제조하여 간 세포에 처리할 경우, 콜레스테롤 합성에 관여하는 주요 효소 중 하나인 HMG-CoA 환원효소에 대해 유의적인 억제력을 보유하고 있다.
Description
본 발명은 김치로부터 분리한 신규한 유산균인 락토바실러스 플랜타럼 LLP5273 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 균주는 체외(in vitro)에서 담즙산 분해능이 우수하고, 이의 균체 파쇄물은 동물세포의 간 세포의 지질 대사에 관여하는 생체효소인 HMG-CoA 환원효소에 대한 억제능이 우수하여 이를 유효성분으로 포함하는 조성물은 음료, 식품, 기능성 식품, 의약품에 널리 적용될 수 있다.
세계적으로 비만 인구가 급속도로 증가하고 있으며, 특히 비만에 의해 콜레스테롤 함량이 높아지고 심장질환, 뇌혈관 장애, 고혈압 등의 위험성이 높아지고 있다. 일반적으로 콜레스테롤 저하를 위한 치료제로서 스타틴(statins)이나 니아신(niacin)과 같은 약물이 많이 사용하고 있다.
스타틴 계열의 컴팩틴(compactin) 유도체인 로바스타틴(lovastatin), 프로바스타틴(provastatin), 심바스타틴(simvastatin)은 세계적으로 가장 많이 사용되는 약물 중 하나이다. 이 약물들은 콜레스테롤 생합성 조절 인자인 HMG-CoA 환원효소(3-hydroxy-methyl-glutamyl coenzyme A reductase)의 활성을 저해하는 기능을 한다. 그 결과, LDL-receptor의 발현량이 증가되고 LDL의 세포 내 유입이 증가하게 됨에 따라 혈중 콜레스테롤 함량이 감소하게 된다. 이런 콜레스테롤 저하 기능을 가지고 있음에도, 위와 같은 약제들은 간독성, 근육통, 위장장애, 발암성 등의 부작용이 있다. 따라서 약물 요법에 의존하기보다 식이요법을 병행함으로써 효과를 기대하는 방향으로 치료를 하고 있는 실정이다. 하지만 식이요법 역시 쉬운 방법이 아니기에 콜레스테롤 수치가 높은 환자들에게는 다른 방법으로의 접근이 필요하다.
최근 고콜레스테롤혈증 환자의 혈청 콜레스테롤 수준을 낮추거나 정상적인 콜레스테롤 수준을 갖는 사람의 고콜레스테롤혈증을 예방하기 위해, 포유동물의 장에 존재하는 장내 세균, 특히 유산균에 의한 담즙산염 분해 가능성에 대한 연구가 증가하고 있다.
간에서 합성되는 담즙산은 포유동물에서 콜레스테롤 대사의 중요한 최종 산물이며, 글리신(glycine) 또는 타우린(taurine)과 접합(conjugation)한 후에 담즙에서 분비된다. 식사 중에 포함되어 있는 지질의 섭취 시에 담즙산은 혼합되며, 십이지장에서 흡수를 위해 지질과 유화된다. 유산균에 의해 생산된 담즙산염 분해효소(BSH, Bile Salt Hydrolase)는 글리신 또는 타우린 등과 담즙산 사이의 아미드 결합의 가수분해를 촉매하며 탈접합된 담즙산(Deconjugated bile acid)은 수용성이 낮기 때문에 대변으로 용이하게 배출된다.
담즙산염의 감소된 양은 체내 항상성 유지를 위해 콜레스테롤로부터 담즙산염으로의 전환을 증가시키게 되며 결국 체내 혈중 콜레스테롤 수준을 낮출 수 있게 된다.
그러나 이러한 담즙산염 분해효소 분비능이 우수한 유산균을 이용하여 체내 콜레스테롤을 저하한 연구들을 살펴보면, 체외 실험에서 담즙산염 분해효소 유산균을 분리한 다음, 실험동물에 급여한 다음 혈중 콜레스테롤 저하능을 평가한 수준에 그치고 있으며 실제 투여되는 유산균이 생합성 조절 인자에 대해 어떤 영향을 끼치는지에 대해 밝힌 연구는 극히 미비한 수준이다. 이 경우 담즙산염 분해효소에 의해 체내 콜레스테롤이 저하된다는 추정은 가능하지만 실제 간 세포에서 합성되는 콜레스테롤에 대한 저하에 대해 명확한 근거를 제시하기 어려운 문제가 있다. 특히 대표적인 콜레스테롤 치료약품인 스타틴 계열을 대체하기 위해서는 이 약품이 HMG-CoA 환원효소 억제의 활성을 저해하는 기작을 가지는 만큼, 유사한 기작을 가진 유산균을 개발하는 것이 매우 중요하며 최소 동물세포 수준에서 기작과 효능을 검증하는 것이 매우 필수적일 것으로 예상된다.
한국 공개특허 제10-2014-0085916호는 유아 분변으로부터 분리되며 내산성, 담즙산내성, 장부착능력, 콜레스테롤 저하 및 비만을 억제하는 기능이 있는 균주와 이를 이용한 식품 조성물, 건강기능식품, 약품 조성물 등의 개시하고 있지만, 이러한 균주가 HMG-CoA 환원효소 억제의 활성을 저해하는 기작을 갖는 것인지 아니면 또 다른 기작이 있는 것인지 구체적인 효능을 명확하게 규명하고 있지 못하다.
1. Larsen et al. 2000. Blood Press 9: 91-97
2. Begley et al. 2006. Appl.Environ. Microbiol. 72: 1729-1738
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7. Kim et al. 2004. Appl. Environ. Microbiol. 70: 5603-5612
따라서 본 발명은 김치로부터 분리하여 담즙산염 분해능 및 간 세포에 처리 시 HMG-CoA 환원효소의 활성 억제능이 우수한 락토바실러스 플랜타럼 균주를 제공하는데 그 목적이 있다.
또한 본 발명은 상기 균주를 유효성분으로 포함하는 HMG-CoA 환원효소 활성 억제용 조성물을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
또한 본 발명은 상기 HMG-CoA 환원효소 활성 억제용 조성물을 유효성분으로 포함하는 식품을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
또한 본 발명은 상기 HMG-CoA 환원효소 활성 억제용 조성물을 유효성분으로 포함하는 의약품을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않는다. 본 발명의 목적은 이하의 설명으로 보다 분명해 질 것이며, 특허청구범위에 기재된 수단 및 그 조합으로 실현될 것이다.
본 발명은 담즙산 분해능 및 간 세포에 처리 시 HMG-CoA 환원효소의 활성 억제능이 우수한 유산균인 락토바실러스 플랜타럼 LLP5273(기탁번호 KCCM11696P) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 상기 균주의 균체 파쇄물, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 및 상기 배양액의 건조물로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 한 가지 이상을 유효성분으로 포함하는 HMG-CoA 환원효소 활성 억제용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 HMG-CoA 환원효소 활성 억제용 조성물을 유효성분으로 포함하는 식품을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 HMG-CoA 환원효소 활성 억제용 조성물을 유효성분으로 포함하는 의약품을 제공한다.
본 발명에 따른 락토바실러스 플랜타럼 균주는 담즙산 분해능이 우수하고 HMG-CoA 환원효소의 활성 억제를 통해 혈중 콜레스테롤을 저하시키는데 효능이 있다.
또한, 본 발명에 따른 락토바실러스 플랜타럼 균주의 균체 파쇄물을 간 세포에 처리하였을 때 HMG-CoA 환원효소 활성 억제능이 우수하여 간 세포에서 콜레스테롤 합성을 저해할 수 있다.
따라서, 본 발명은 혈중 콜레스테롤 저하용 식품 및 고콜레스테롤혈증 또는 이의 합병증을 예방, 개선 또는 치료용 의약품으로 제공될 수 있다.
도 1은 락토바실러스 플랜타럼 LLP5273 균주의 당이용성 측정 결과이다.
도 2는 락토바실러스 플랜타럼 LLP5273 균주의 서열 상동성 분석 결과이다.
도 3은 락토바실러스 플랜타럼 LLP5273 균주의 담즙산에 대한 분해 전후 분석 결과이다.
도 4는 락토바실러스 플랜타럼 LLP5273 균주의 균체파쇄방법에 따라 체외로 용출된 단백질 농도 분석 결과이다.
도 5는 락토바실러스 플랜타럼 LLP5273 균주의 균체파쇄물을 간 세포에 처리할 때 최적 처리농도 분석 결과이다.
도 6은 락토바실러스 플랜타럼 LLP5273 균주와 다른 표준 유산균의 균체파쇄물들을 간 세포에 처리하였을 때 HMG-CoA 환원효소 mRNA 발현량을 분석한 결과이다.
도 2는 락토바실러스 플랜타럼 LLP5273 균주의 서열 상동성 분석 결과이다.
도 3은 락토바실러스 플랜타럼 LLP5273 균주의 담즙산에 대한 분해 전후 분석 결과이다.
도 4는 락토바실러스 플랜타럼 LLP5273 균주의 균체파쇄방법에 따라 체외로 용출된 단백질 농도 분석 결과이다.
도 5는 락토바실러스 플랜타럼 LLP5273 균주의 균체파쇄물을 간 세포에 처리할 때 최적 처리농도 분석 결과이다.
도 6은 락토바실러스 플랜타럼 LLP5273 균주와 다른 표준 유산균의 균체파쇄물들을 간 세포에 처리하였을 때 HMG-CoA 환원효소 mRNA 발현량을 분석한 결과이다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 상세하게 설명한다. 본 발명의 실시예는 발명의 요지가 변경되지 않는 한 다양한 형태로 변형될 수 있다. 그러나 본 발명의 권리범위가 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되면 공지 구성 및 기능에 대한 설명은 생략한다. 본 명세서에서 "포함"한다는 것은 특별한 기재가 없는 한 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다.
본 발명은 체외에서 담즙산 분해능이 우수한 새로운 유산균 락토바실러스 플랜타럼 LLP5273(기탁번호 KCCM11696P) 균주를 제공한다.
담즙산은 포유류에게서 많이 발견되며 체내에서 지방을 유화시키고 소화효소인 라이페이즈(lipase)의 작용을 촉진시켜 지방산을 용해시키기 쉽게 한다. 이 물질은 다 쓰고 난 뒤 장에서 흡수되어 간으로 되돌아가 다시 사용된다. 이 담즙산이 체내에서 합성될 때 전구체(precursor)로서 콜레스테롤이 사용되는데 담즙산 분해효소에 의해 체내 담즙산 농도가 낮아지게 되면 체내 항상성 유지를 위해 콜레스테롤로부터 담즙산을 추가로 생성하게 되며 최종적으로 체내 콜레스테롤 농도가 낮아지게 된다. 따라서 담즙산 분해효소 활성이 높은 유산균의 담즙산 분해능이 높으며 결국 체내 콜레스테롤로부터 담즙산 생성을 더욱 촉진시킬 수 있게 된다.
한편 HMG-CoA 환원효소는 콜레스테롤 합성단계 중 HMG-CoA로부터 메발론산 (mevalonic acid)으로 전환시키는 과정에 작용하는 효소이며 이 효소의 활성에 따라 콜레스테롤 합성 속도가 조절된다. 대표적인 콜레스테롤 저하 의약품으로 많이 사용되는 스타틴 계열(lovastatin, Simvastatin, Pravastatin, Atorvastatin 등)은 체내에서 HMG-CoA 환원효소를 억제하는 것으로 알려져 있다. 따라서 간 세포에 본 발명에 따른 균체 파쇄물을 처리하였을 때 HMG-CoA 환원효소 활성을 억제하는 유산균을 활용하면 유사한 효과를 보일 수 있을 것으로 예상된다.
이에 본 발명은 담즙산 분해능 및 간 세포 내 HMG-CoA 환원효소 활성 저해능이 우수한 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) LLP5273(기탁번호 KCCM11696P) 균주, 상기 균주의 균체 파쇄물, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 및 상기 배양액의 건조물로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 한 가지 이상을 유효성분으로 포함하는 HMG-CoA 환원효소 활성 억제용 조성물을 제공한다.
여기서 "배양액"이란, 액체 배지에 균주를 접종하여 배양한 것을 의미하며 액체상의 배양액으로부터 균주를 제거한 상등액을 일컫는 "배양여액"을 포함하는 개념이다. 상기 "배양액의 농축액" 이란, 상기 배양액을 농축한 것을 말하고, "배양액의 건조물"이란, 상기 배양액에서 물기를 제거한 것을 말한다. 또한 "균체 파쇄물"이란 상기 배양액을 하기에 서술한 최적 파쇄조건에 따라 처리하여 균체의 세포벽을 파쇄시킨 것을 말한다.
본 발명에서 식품이란 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며 그 예로는 과일, 야채, 과일이나 야채의 건조제품이나 절단제품, 과일쥬스, 야채쥬스, 이들의 혼합쥬스 이거나 칩류, 면류, 축산가공식품, 수산가공식품, 유가공식품, 발효식품, 두류식품, 곡류식품, 미생물발효식품, 제과제빵, 양념류, 육가공류, 산성음료수, 감초류, 허브류 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 식품은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 균주를 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 식품과 같이 여러 가지 향미제 또는 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
1:
락토바실러스
플랜타럼
LLP5273
의 선별
(1) 시료 채취 및 유산균 분리
이하의 [표 1]과 같이 전국 각지의 전통재래시장에서 약 150종의 김치 시료를 채취하였다.
| 분리지역 | 서울 | 경기도 | 충청남도 | 충청북도 | 전라남도 |
| 채취시료(김치) | 29 | 46 | 18 | 26 | 31 |
채취한 시료에 멸균 증류수를 첨가하여 희석액을 만든 뒤, 분쇄균질기(Stomacher, Pro-Media SH-001, ELMEX)로 시료 내부를 균질화하였다.
상기 희석액을 멸균 식염수로 단계별로 희석한 뒤 0.1 ml를 취하였다. 이를 0.002 중량%의 BCP(Bromocresol purple)와 1.5 중량%의 한천(Agar)이 첨가된 MRS 고체배지에 도말하여 37℃가 유지되는 배양기에서 48 시간 배양하였다.
배양 후 노란색의 환이 나타나는 콜로니(Colony)를 선별하여 개체 별로 동일한 배지에 2 ~ 3회 계대배양함으로써 각 균주를 순수 분리하였다.
상기 균주를 개체 별로 MRS 액체배지에 접종하여 37℃에서 48 시간 동안 재배양한 뒤 4℃로 냉장 보관하면서 사용하였다.
(2) 담즙산 분해능이 우수 유산균 선별
담즙산이 첨가된 고체배지를 이용하여 상기 균주 중 담즙산 분해능이 우수한 균주를 선별하였다.
상기에서 순수 분리된 균주는 MRS 고체배지에 접종하여 37℃에서 24 시간 동안 활성화한 다음, 활성화된 콜로니를 채취하여 MRS 액상배지(MRS broth, Difco, USA) 10 ml이 첨가된 15 ml 멸균 튜브에 접종하고 동일한 조건으로 종균배양하였다.
담즙산 첨가 배지는 복합담즙산에 속하는 글라이코콜린산(Glycocholic acid, Sigma, USA) 0.5 중량%와 타우로콜린산(Taurocholic acid, Sigma, USA) 0.5 중량%가 첨가된 MRS 고체배지 (Man Rogosa and Sharpe, MRS agar, Difco, USA)를 제조하여 1회용 디쉬 플레이트(Dish plate)에 20 ml씩 분주한 다음 상온에 4 시간 동안 방치하여 굳혀 주었다.
담즙산 첨가 배지 제조 후 멸균된 8 mm 크기의 페이퍼디스크(Paperdisc, Advantec, USA)를 올린 다음 순수 분리된 유산균의 종균 배양액을 각각 10 ㎕씩 첨가하고 37℃에서 24 시간 배양하여 주었다. 배양 종료 후 페이퍼디스크 주변으로 짙은 색의 할로(halo)가 형성되는지 육안으로 확인하였고, 이는 첨가된 담즙산이 분해되어 형성되는 것으로 추정되었으며 할로가 형성된 균주를 1차 선별하였다.
(3) 선별 균주의 담즙산 분해능 측정
1차 선별된 균주들의 실제 담즙산 분해력을 정량 측정하여 담즙산 분해능이 가장 우수한 유산균을 선별하고자 하였다. 이를 위해 1차 선별된 균주들을 상기와 동일한 방법으로 종균 배양한 다음 배양액을 회수하여 원심분리(4,000 rpm, 5 분) 하고 상등액 100 ㎕를 취해 50 % 메탄올을 이용하여 10 ml로 희석한 다음 UPLC-MS/MS(Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometer) 시스템으로 분석하였다. 상세한 분석조건은 하기 [표 2]에 기재하였다. 담즙산 표준용액은 메탄올에 희석하여 100 mg/L 농도로 제조하였으며 표준곡선 제조를 위해 50 % 메탄올을 이용하여 각 0.5, 1.0, 5.0, 10.0 mg/L로 희석하여 준비하였다.
| 항목 | 분석조건 |
| 기기 및 시스템 | UPLC/MS/MS system (ACQUITY UPLC-Xevo TQ, Waters Ltd., USA) |
| 컬럼 (Column) | ACQUITY BEH C18 1.7 um (2.1 x 100 mm) |
| 이동상 (Mobile phase) | A : Water + 0.05% ammonium hydroxide B : Methanol + 0.05% ammonium hydroxide |
| 유속 (Flow rate) | 0.3 ml/min |
| 분석량 (Injection volume) | 1μL |
| MS 조건 | Ion mode : Negative ion mode (ESI-) Capillary voltage : 3.0 kV Cone vlotage : 55 V Source temperature : 150 ℃ Desolvation temperature : 300 ℃ |
| MRM 조건 | Cholic acid : 407.2 -> 407.2 Glycocholic acid : 464.2 -> 464.2 Taurocholic acid : 514.2 -> 514.2 (Collision 15V) |
초기 담즙산 농도 대비하여 배양 후 담즙산 농도가 가장 낮게 나타나는 균주를 담즙산 분해력이 가장 우수한 균주로서 최종 선별하였다.
최종 선별된 균주는 MRS 액체배지에 접종하여 37℃에서 48 시간 동안 배양하여 증식시키고, 원심분리(10,000 g, 10 분)하여 균체를 획득하였다. 상기 균체를 MRS 액체배지 : 글리세롤(Glycerol)이 4 : 1 비율로 포함된 냉동보관용액(Freezing solution)에 1 ml 첨가한 뒤, 크라이오튜브(Cryo-tube)에 넣어 -70℃에서 냉동 보관 하였다. 냉동된 균주를 이 후의 테스트를 위한 스타터로 사용하였다.
실시예
2: 균주의 특징 분석 및 동정
(1) 특징 분석
선별된 균주의 형태학적 및 생화학적 특징을 분석하였다. 이하 [표 3]을 참조하면, 상기 균주는 그람 양성, 간균으로 포자형성능 및 카탈라아제(Catalase) 음성으로 확인되었다.
| 특징 | 결과분석 |
| 콜로니 형태(Colony shape) | 소형의 둥근 형태 |
| 콜로니 색(Colony color) | 밝은 아이보리 |
| 세포형태(shape) | 간균(Rod) |
| 그람염색(Gram staining) | 그람 양성 |
| 호기조건 | 통성 혐기성 |
| 포자 형성능(Endospore) | 음성 |
| 포자 형태(Spore shape) | 음성 |
| 카탈라아제 테스트(Catalase test) | 음성 |
(2) 균주 동정
상기 균주의 당이용성을 API 50 CHL 키트(Biomerieux® France)를 이용하여 분석하였다. 이하 [표 4] 및 도 1을 참조하면, 락토바실러스 플랜타럼 표준 균주(Lactobacillus plantarum 1)와 99.6 % 일치하지만, 젠티오비오스(Gentiobiose)에 대한 이용성은 98 % 다른 것으로 확인되었다.
| 스트립(Strip) 0-19 튜브/기질 |
+/- | 스트립(Strip) 20-39 튜브/기질 |
+/- | 스트립(Strip) 40-49 튜브/기질 |
+/- |
| 0 대조군 | - | 20 α-메틸-D-만노시드 (Mannoside) |
- | 40 D-투라노스 (TURanose) |
+ |
| 1 글리세롤 | - | 21 α-메틸-D-글루코시드 | - | 41 D-리로스 (LYXose) |
- |
| 2 에리트리톨 (ERYthritol) |
- | 22 N-아세틸-글루코사민 | + | 42 D-타가토스 (TAGatose) |
- |
| 3 D-아라비노즈 (Arabinose) |
- | 23 아미그달린 (AMYgdalin) |
+ | 43 D-푸코스 (FUCose) |
- |
| 4 L-아라비노즈 | + | 24 알부틴 (ARButin) | + | 44 L-푸코스 | - |
| 5 리보스 (Ribose) | + | 25 에스쿨린 (Esculin) | + | 45 D-아라비톨 (ArabitoL) |
- |
| 6 D-자일로스 (XYLose) |
- | 26 살리신 (SALicin) | + | 46 L-알비톨 | - |
| 7 L-자일로스 | - | 27 셀로비오스 (CELobiose) |
+ | 47 굴루코나테 (GlucoNaTe) |
+ |
| 8 아도니톨 (ADOnitol) |
- | 28 말토스 (MALtose) | + | 48 2-게톤-글루코네이트 | - |
| 9 β-메틸-D-자일로스 | - | 29 락토스 (LACtose) | + | 49 5-게토-글루코네이트 | - |
| 10 갈락토스 (GALactose) |
+ | 30 멜리비오스 (MELibiose) |
+ | ||
| 11 글루코스 (GLUcose) |
+ | 31 수크로스 (Sucrose) |
+ | ||
| 12 프럭토스 (FRUctose) |
+ | 32 트레할로스 (TREhalose) |
+ | ||
| 13 만노스 (MANose) | + | 33 이눌린 (INUline) | - | ||
| 14 스로보스 (SroBose) |
- | 34 멜리지토스 (MeLeZitose) |
+ | ||
| 15 람노스 (RHAmnose) |
- | 35 라프피노스 (RAFfinose) |
+ | ||
| 16 둘시톨(DULcitol) | - | 36 전분 | - | ||
| 17 이노시톨 (INOsitol) |
- | 37 글리코겐 (GLYcoGen) |
- | ||
| 18 만니톨(MANitol) | + | 38 자일리톨 (XyLiTol) |
- | ||
| 19 솔비톨(SORbitol) | + | 39 젠티오비오스 (GENtiobiose) |
+ |
아울러, 상기 균주의 16s rRNA 유전자 염기서열은 서열번호 1과 같다. 염기서열 분석 결과 상기 균주는 락토바실러스 속 균주와 최대 99 % 상동성을 가진다. 이는 도 2에서 확인할 수 있다.
이에 본 발명자는 상기 균주를 새로운 락토바실러스 플랜타럼 균주로 동정하였고, 락토바실러스 플랜타럼 LLP5273으로 명명하여 한국미생물보존센터에 2015년 5월 7일자로 기탁하였다(기탁번호 KCCM11696P).
실시예
3:
락토바실러스
플랜타럼
LLP5273
의
담즙산
분해력 및
분해산물
신규한 유산균 락토바실러스 플랜타럼 LLP5273이 가진 담즙산 분해력과 분해 후 산물에 대한 분석을 진행하였다. 상기 실시예 1에서와 동일한 방법에 따라 LLP5273 유산균을 종균 배양하였고, 복합담즙산이 첨가된 배지 (타우로콜린산 0.5 %, 글라이코콜린산 0.5 %, MRS broth)에 종균 배양액 1 중량%를 접종한 다음 37℃에서 48 시간 동안 배양하였다. 배양 종료 후 실시예 1에서와 마찬가지로 UPLC-MS/MS를 이용하여 대사산물을 분석하였으며, 이 때 표준시약으로는 콜린산(Cholic acid, Sigma, USA), 글리신(Glycine, Sigma, USA), 타우린(Taurine, Sigma, USA)을 사용하였다. 이는 복합담즙산에 속하는 글리코콜린산과 타우로콜린산이 유산균이 분비하는 담즙산 분해효소(BSH, Bile Salt Hydrolase)에 의해 분해되면 콜린산과 글리신 혹은 콜린산과 타우린으로 분해되는 것을 참조하였다.
배양 전후의 담즙산 및 분해산물을 측정한 결과는 [표 5]와 도 3에 나타내었으며, 중량 기준으로 측정된 모든 결과는 몰 농도(mM) 기준으로 환산하여 표시하였다. [표 5]와 도 3에 나타낸 바와 같이, 배양 전의 글리코콜린산과 타우로콜린산이 각각 7.73 mM, 7.50 mM 첨가된 반면, 배양 후 글리코콜린산은 모두 소모되었으며, 타우로콜린산은 2.61 mM로 감소한 것으로 나타났다. 반면 분해산물의 경우, 배양 후 콜린산 1.52 mM, 글리신과 타우린은 각각 4.58 mM, 1.81 mM 증가한 것으로 확인되었다.
따라서 본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 LLP5273 균주의 경우, 복합담즙산인 글리코콜린산과 타우로콜린산에 대한 분해능을 보유한 것으로 확인되었으며, 타우로콜린산에 대한 분해율은 65.2 %, 글리코콜린산에 대한 분해율은 99.9 % 이상인 것으로 나타나 글리코콜린산에 대한 분해력이 더 높은 것으로 나타났다. 따라서 두 종류의 복합담즙산에 대한 총 분해율은 82.9 %인 것으로 확인되었다. 또한 복합담즙산의 경우, 글리신 혹은 타우린 등과 콜린산과 결합된 상태로 존재하는 것으로 알려져 있으며, 분해되었을 때 1차 담즙산인 콜린산과 글리신 혹은 타우린 등의 아미노산으로 분리된다. [표 5]와 도 3의 결과에 따르면, 글리신과 타우린은 높은 농도로 존재하는 반면, 콜린산의 농도는 다소 낮게 나타나는 것으로 보아, 1차 담즙산인 콜린산을 다시 분해하여 다른 담즙산 형태로 전환된 것으로 추정된다.
| 시료 | 복합담즙산(mM) | 분해산물(mM) | |||
| 글리코콜린산 | 타우로콜린산 | 콜린산 | 글리신 | 타우린 | |
| 대조군 | 7.73 | 7.50 | 0 | 0 | 0 |
| 락토바실러스 플랜타럼 LLP5273 배양 후 |
0 | 2.61 | 1.52 | 4.58 | 1.81 |
실시예
4:
락토바실러스
플랜타럼
LLP5273
의
내산성
및
내담즙성
측정
구강으로 유산균을 섭취하면 위산과 담즙에 의해 상당수가 사멸한다. 따라서 소장 및 대장까지 전달되는 유산균의 수를 높이려면 우수한 내산성 및 내담즙성이 필요하다.
락토바실러스 플랜타럼 LLP5273을 MRS 평판배지에 접종하여 37℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양된 콜로니를 채취하여 MRS 액상배지에서 37℃에서 24 시간 동안 정치배양하여 종균 배양액을 제조하였다.
(1) 내산성 시험
종균 배양액 1 %를 MRS 액체배지에 접종하여 37℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 수득한 배양액에 10 % H2SO4를 첨가하여 pH 3.0의 강산성 조건으로 만들고 2 시간 동안 방치하였다. 이 후 시료를 다단희석한 희석액을 MRS 평판배지에 도말하고 37℃에서 24 시간 동안 배양하여, 초기 생균수와 pH 3.0 처리 후의 생균수를 측정하였다. 본 발명에서 내산성은 (초기 생균수 / pH 처리 후 생균수)의 비율로 나타낸다.
(2) 내담즙성 시험
담즙(bile)을 0.1, 0.3, 0.5, 0.7, 1.0 중량%로 첨가하여 제조한 MRS 평판배지를 준비하였다. 각 MRS 평판배지에 종균 배양액을 접종한 뒤 37℃에서 24 시간 동안 배양하여 생장여부를 확인하였다.
(3) 시험 결과
각 실험의 비교군으로 락토바실러스 플랜타럼 표준균주(Lactobacillus plantarum KCTC21004, Lactobacillus plantarum ATCC14917)를 사용하였다. 내산성 시험 및 내담즙성 시험의 결과는 이하의 [표 6]과 같다.
| 시료 | 내산성(%) | 내담즙성 |
| 락토바실러스 플랜타럼 LLP5273 | 99.9 | >1.0 % 생존 |
| 락토바실러스 플랜타럼 표준균주(ATCC14917) | 49.3 | >0.5 % 생존 |
| 락토바실러스 플랜타럼 표준균주(KCTC21004) | 0.02 | >0.3 % 생존 |
락토바실러스 플랜타럼 LLP5273은 pH 3.0의 강산성으로 약 2 시간 처리하여도 99.9 %의 생존율을 보였다. 또한 다른 표준 유산균들이 1.0 중량% 이상의 담즙이 첨가되었을 땐 모두 생육이 불가능하였던 것에 비해 락토바실러스 플랜타럼 LLP5273은 0.7 중량%가 첨가된 배지에서 생육이 가능함을 확인하였다.
따라서 락토바실러스 플랜타럼 LLP5273은 우수한 내산성 및 내담즙성을 가지므로 장까지 도달할 확률이 높기 때문에, 식품 또는 건강기능식품으로 섭취할 경우 유산균의 다양한 효능을 효과적으로 발휘할 수 있다.
실시예
5:
락토바실러스
플랜타럼
LLP5273
의
HMG
-
CoA
환원효소
억제능
측정
본 발명의 신규한 유산균 락토바실러스 플랜타럼 LLP5273이 동물세포 수준에서 HMG-CoA 환원효소 억제능을 가지는지 확인하였다. 이를 위해 균체 내 유용물질을 용출시키기 위해 유산균 균체를 파쇄하는 최적 조건을 확립하고자 하였으며, 이렇게 용출시킨 유용물질을 실제 간 세포에 처리하여 간 세포 내에서 HMG-CoA 환원효소의 발현량을 측정하고자 하였다.
(1) 최적 균체 파쇄조건 확립
본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 LLP5273의 최적 균체 파쇄조건을 확립하기 위해, 초고압으로 처리한 실험군과 초고압처리 및 초음파 처리를 병행 처리한 군을 비교하기로 하였다. LLP5273 균주의 경우 상기 실시예 1에서와 동일한 방법으로 종균배양액을 제조하였다. 배양 종료 후 배양액을 일부 채취하여 660 nm에서 흡광도를 측정한 다음 멸균된 인산완충액(Phosphate buffer, pH 6.8)을 첨가하여 흡광도를 O.D 1.0으로 보정한 후 새로운 MRS broth에 0.5 중량% 투여하여 37℃에서 4 시간 동안 배양하였다. 4 시간 경과 후 배양액을 진공 팩에 포장 후 초고압기(QUINTUS® QFP35L-600, Avure Technologys AB, Sweden)를 이용하여 초고압 처리(50,000 psi, 5 분)를 2 회 반복하여 주었다. 초고압처리 및 초음파 병행 처리 군의 경우 동일한 방법으로 초고압처리를 한 다음 초음파기를 이용하여 초음파 처리(Amplitude 30 %, Pulse 5s/1s, 5분)를 2회 반복하여 주었다. 각각의 처리를 통해 세포 외로 용출된 단백질은 알려져 있는 정량법인 브래드포드 정량법(Bradford assay)을 이용하여 측정하였다.
본 발명의 LLP5273 균주를 첨가하지 않은 배지 상태에서와 첨가하여 배양한 배양액 그리고 2 가지 방법으로 균체를 파쇄한 다음 용출된 단백질량을 측정하여 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타낸 것처럼, 유산균을 배양하고 어떠한 처리도 하지 않은 배양액 상태에서는 균주를 배양하지 않은 배지 상태에서와 비슷한 수준의 단백질량이 측정되었다. 이는 균체 밖으로 단백질이 전혀 용출되어 있지 않은 상태인 것으로 추정되며 배지 내에 영양성분으로 넣어주는 단백질들만이 측정되는 것으로 여겨진다. 반면, 초고압 처리와 초고압 처리 및 초음파 처리를 통하여 균체를 파쇄할 경우, 배양액 대비하여 높은 농도의 단백질량이 측정되었으며 이는 균체가 파쇄되면서 균체 내 단백질이 용출된 것으로 여겨진다. 그러나 초음파 처리를 추가로 진행한 군의 경우, 초고압 처리만 진행한 군에 비해 단백질 농도가 유의적인 차이가 없는 것으로 확인되어 이후의 실험에서는 초고압처리만을 통하여 균체를 파쇄하기로 결정하였다.
(2) 균체 파쇄액의 최적 투여 농도 확립
상기의 최적 균체 파쇄조건으로 확보한 락토바실러스 플랜타럼 LLP5273 균주의 균체 파쇄액을 간 세포에 처리 시 최적 투여농도를 결정하고자 하였다. 이를 위해 미국생물자원센터(American Type Culture Collection)로부터 간 세포인 HepG-2 ATCC HB-8065 세포주를 분양 받아 실험에 사용하였다. 분양 받은 HepG-2 세포는 소태아혈청(Fetal bovine serum) 10 중량%를 첨가한 Eagle's MEM broth (Minimum Essential Medium)를 사용하여 전배양한 다음, 96-well 플레이트에 well 당 1.0 x 104 세포수가 (1.0 x 104 cells/well) 되게 희석, 접종하고 이산화탄소 농도가 5 %로 유지되는 항온배양기에서 37℃로 24 시간 동안 배양하여 주었다.
본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 LLP5273 균체 파쇄액의 경우, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 종균 배양액을 제조한 다음 초고압 처리를 통해 균주 파쇄를 진행하였다(50,000 psi, 5분, 2회 반복). 제조한 균체 파쇄물은 96-well 플레이트에 배양된 HepG-2 세포 배양액의 부피 대비하여 0, 5, 10, 20, 30, 40 부피% 되게 첨가하고 24 시간 경과시킨 다음, MTT assay를 이용하여 세포생존율을 측정하였다. 균체 파쇄액 투여 농도에 따른 HepG-2 간 세포의 세포생존율은 도 5에 나타내었다. 결과에 나타낸 것처럼, 균체 파쇄물을 첨가하지 않은 군에 비해 균체 파쇄물을 20 부피% 첨가하였을 경우, 세포생존율에 거의 영향을 주지 않는 것으로 나타났다. 균체 파쇄물을 5 부피% 및 10 부피% 첨가할 경우, 전혀 첨가하지 않은 군에 비해 세포생존율을 증진시키는 것으로 나타났는데 이는 락토바실러스 플랜타럼 LLP5273 균주 배양액 내 밝혀지지 않은 미지의 물질에 의한 영향으로 추정된다. 반면 30 부피% 이상의 균체 파쇄물을 첨가할 경우, 세포생존율이 급격하게 감소하는 것으로 나타났다. 따라서 균체 파쇄물 처리 시 세포생존율에 주는 영향을 배제하기 위해서는 20 부피% 이하로 투여하는 것이 유리할 것으로 결정하였다.
(3) 균체 파쇄액 처리에 따른 간 세포 내 유전자 발현 측정
상기에서 확인된 방법에 따라 96-well 플레이트에 HepG-2 세포를 배양한 다음 역시 상기에서의 방법으로 제조한 락토바실러스 플랜타럼 LLP5273 균주의 균체 파쇄액을 20 부피% 첨가하여 24 시간 동안 처리한 다음, well 내의 배양액을 제거하고 멸균된 인산완충액을 이용하여 2회 세척하였다. RNA 추출키트(iNtron, Easy-BLUE total RNA extraction, 한국)를 이용하여 총 RNA를 추출한 다음 나노드랍을 이용하여 총 RNA의 농도를 측정하였다. 측정된 RNA 농도에 따라 DEPC 처리수를 이용하여 총 RNA 농도를 100 ng/μl로 희석한 다음, cDNA 합성 키트(cDNA reverse transcription kit, Thermo Scientific, USA)를 이용하여 cDNA 합성을 수행하고 합성된 cDNA를 실시간PCR기기를 이용하여 qPCR 분석(quantitative PCR assay)를 진행하였다. 타겟 유전자의 프라이머는 알려져 있는 HMG-CoA 환원효소의 염기서열을 참조하여 제작하였으며 본 발명의 LLP5273 유산균과의 비교를 위해 대조군으로는 균체 파쇄물을 처리하지 않은 군과 표준균주군으로서 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei ) ATCC SD5275와 락토바실러스 애시도필러스 (Lactobacillus acidophilus) DSM13241, 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) ATCC14917, 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) KCTC21004 등을 동일한 조건으로 배양 및 파쇄한 균체 파쇄액을 이용하였다.
본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 LLP5273 균주 및 표준균주들의 배양액을 파쇄한 균체 파쇄액을 처리하였을 때의 간 세포 HepG-2 내 HMG-CoA 환원효소 mMRA 활성은 도 6에 나타내었다. 결과에 나타낸 것처럼, 비교군들의 HMG-CoA 환원효소 발현량은 대조군에 대비하여 유의적으로 감소하는 것이 거의 나타나지 않았으며 ATCC14917만이 다소 감소하는 것으로 나타났다. 반면 본 발명의 LLP5273의 경우, 대조군 대비하여 약 30 % 정도가 감소한 것으로 확인되었으며, 이는 결국 LLP5273이 HMG-CoA 환원효소를 억제할 수 있는 유용물질을 분비한다는 것으로 추정할 수 있을 것이다.
제제예
1: 식품의 제조- 발효유
락토바실러스 플랜타럼 LLP5273(기탁번호 KCCM11696P)를 MRS 고체(agar) 배지에 접종한 뒤 37℃에서 24 시간 동안 배양하여 활성화였다. 활성화한 락토바실러스 플랜타럼 LLP5273의 콜로니를 회수하여 우유 100 ㎖에 탈지분유를 5 중량% 첨가한 배지에 접종하여 커드(curd)가 만들어질 때까지 37℃에서 약 12 시간 배양하였다. 종균 배양물 1 중량%를 탈지분유가 5 중량% 첨가된 우유 1 L와 혼합한 뒤 커드(curd)가 형성될 때까지 37℃에서 약 12 시간 배양하여 건강 증진용 발효유를 제조하였다. 제조한 발효유의 최종 pH는 4.2였으며, 생균수는 4.7 x 108 CFU/ml로 확인되었다.
제제예
2: 의약품의 제조
(1) 산제의 제조
락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) LLP5273(기탁번호 KCCM11696P) 균주의 균체 파쇄물 2 g
유당 1 g
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
(2) 정제의 제조
락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) LLP5273(기탁번호 KCCM11696P) 균주의 균체 파쇄물 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아르산 마그네슘 2㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
(3) 캡슐제의 제조
락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) LLP5273(기탁번호 KCCM11696P) 균주의 균체 파쇄물 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아르산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
(4) 주사제의 제조
락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) LLP5273(기탁번호 KCCM11696P) 균주의 균체 파쇄물 100 ㎎
만니톨 180 mg
Na2HPO4·2H2O 26 mg
증류수 2974 mg
통상적인 주사제의 제조 방법에 따라, 상기 성분들을 제시된 함량으로 함유시켜 주사제를 제조하였다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명에 따른 락토바실러스 플랜타럼 LLP5273 균주는 김치로부터 분리되어 섭취에 안전한다.
또한, 본 발명에 따른 락토바실러스 플랜타럼 LLP5273 균주는 담즙산 분해력이 우수하며 복합담즙산에 대한 총 분해력이 82 % 이상이다.
아울러 본 발명에 따른 락토바실러스 플랜타럼은 LLP5273 균주를 파쇄한 균체파쇄액으로 제조하여 간 세포에 처리할 경우 HMG-CoA 환원효소 억제능이 뛰어나며 대조군에 비해 30 % 이상 억제할 수 있는 효과를 갖는다.
또한 본 발명에 따른 균주는 음료, 식품, 의약품 등에 널리 이용될 수 있다.
이상으로 본 발명에 대해 상세히 설명하였다. 다만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되지 않고, 이하의 특허청구범위에 의해 정해진다.
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<212> DNA
<213> Lactobacillus plantarum LLP5273
<400> 1
aaaaggttac cccaccgact ttgggtgtta caaactctca tggtgtgacg ggcggtgtgt 60
acaaggcccg ggaacgtatt caccgcggca tgctgatccg cgattactag cgattccgac 120
ttcatgtagg cgagttgcag cctacaatcc gaactgagaa tggctttaag agattagctt 180
actctcgcga gttcgcaact cgttgtacca tccattgtag cacgtgtgta gcccaggtca 240
taaggggcat gatgatttga cgtcatcccc accttcctcc ggtttgtcac cggcagtctc 300
accagagtgc ccaacttaat gctggcaact gataataagg gttgcgctcg ttgcgggact 360
taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg acaaccatgc accacctgta tccatgtccc 420
cgaagggaac gtctaatctc ttagatttgc atagtatgtc aagacctggt aaggttcttc 480
gcgtagcttc gaattaaacc acatgctcca ccgcttgtgc gggcccccgt caattccttt 540
gagtttcagc cttgcggccg tactccccag gcggaatgct taatgcgtta gctgcagcac 600
tgaagggcgg aaaccctcca acacttagca ttcatcgttt acggtatgga ctaccagggt 660
atctaatcct gtttgctacc catactttcg agcctcagcg tcagttacag accagacagc 720
cgccttcgcc actggtgttc ttccatatat ctacgcattt caccgctaca catggagttc 780
cactgtcctc ttctgcactc aagtttccca gtttccgatg cacttcttcg gttgagccga 840
aggctttcac atcagactta aaaaaccgcc tgcgctcgct ttacgcccaa taaatccgga 900
caacgcttgc cacctacgta ttaccgcggc tgctggcacg tagttagccg tggctttctg 960
gttaaatacc gtcaatacct gaacagttac tctcagatat gttcttcttt aacaacagag 1020
ttttacgagc cgaaaccctt cttcactcac gcggcgttgc tccatcagac tttcgtccat 1080
tgtggaagat tccctactgc tgcctcccgt aggagtttgg gccgtgtctc agtcccaatg 1140
tggccgatta ccctctcagg tcggctacgt atcattgcca tggtgagccg ttaccccacc 1200
atctagctaa tacgccgcgg gaccatccaa aagtgatagc cgaagccatc tttcaagctc 1260
ggaccatgcg gtccaagttg ttatgcggta ttagcatctg tttccaggtg ttatcccccg 1320
cttctgggca ggtttcccac gtgttactca ccagttcgcc actcactcaa atgtaaatca 1380
tgatgcaagc accaatcaat accagagttc gttcgactgc at 1422
Claims (5)
- 담즙산 분해능 및 간 세포 내 HMG-CoA 환원효소 활성 저해능이 우수한 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) LLP5273(기탁번호 KCCM11696P) 균주.
- 제1항에 있어서, 상기 균주는 김치로부터 분리된 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) LLP5273(기탁번호 KCCM11696P) 균주.
- 제1항 또는 제2항의 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) LLP5273(기탁번호 KCCM11696P) 균주, 상기 균주의 균체 파쇄물, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 및 상기 배양액의 건조물로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 한 가지 이상을 유효성분으로 포함하는 HMG-CoA 환원효소 활성 억제용 조성물.
- 제3항의 HMG-CoA 환원효소 활성 억제용 조성물을 유효성분으로 포함하는 식품.
- 제3항의 HMG-CoA 환원효소 활성 억제용 조성물을 유효성분으로 포함하는 의약품.
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