KR101810862B1

KR101810862B1 - 신규한 락토바실러스 카제이 wk3 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101810862B1
Application number: KR1020160049543A
Authority: KR
Inventors: 이완규
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2015-07-17
Filing date: 2016-04-22
Publication date: 2017-12-26
Also published as: KR20170009709A

Abstract

본 발명은 인간의 장관에서 분리한 신규한 균주인 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) WK3 균주 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 락토바실러스 카제이 WK3 균주는 생균제로서의 특성 이외에도 콜레스테롤 저하기능, 면역 활성기능 및 내장지방 개선능을 가지고 있다. 따라서 본 발명의 락토바실러스 카제이 WK3 균주 또는 이의 배양액은 콜레스테롤 저하용, 면역기능 개선용 및 내장지방 개선기능용 생균제 또는 이를 포함하는 다양한 조성물로 이용될 수 있다.

Description

신규한 락토바실러스 카제이 WK3 균주 및 이의 용도{Novel Latobacillus casei WK3 Strain and Uses Thereof}

본 발명은 콜레스테롤 저하기능, 면역 활성기능 및 내장지방 개선기능을 갖는 신규한 락토바실러스 카제이 WK3 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.

생균제(probiotics)는 일반적으로 건강에 유익한 생균 식품 첨가제로 정의되었으나(Lilly and Stillwell, Science 147:747-748, 1965), 최근 들어 Salminen 등(Int. J. Food Microbiol. 44:93-106, 1998)에 의해 인체나 동물의 건강을 증진시키기 위하여 고안된 식품 및 사료 또는 식이 첨가제에 들어있는 살아있는 미생물 제제라고 정의되고 있다. 생균제로 가장 많이 이용되고 있는 미생물에는 유산균(Lactic acid bacteria)이 있으며, 락토바실러스(Lactobacillus), 엔테로코쿠스(Enterococcus), 비피도박테리움(Bifidobacterium) 등이 대표적인 유산균에 해당된다.

유산균은 전통적으로 인류가 오랫동안 안전하게 사용해온 미생물로서, 사람이나 동물의 장내뿐만이 아니라 다양한 식품, 환경에 정상적으로 서식하고 있는 대표적인 유용미생물이다. 유산균은 발효 유제품은 물론 각종 발효 식품, 장류, 김치 등에 폭넓게 활용되고 있으며, 최근에는 사람의 의약품이나 가축의 사료 첨가제에 이르기까지 매우 다양하게 이용되고 있다.

생균제로 사용하는 유산균이 숙주체내에 유익한 기능을 발휘하기 위해서는, 먼저 섭취시 위산에 저항하여 사멸하지 않는 내산성, 알칼리성에 저항하여 사멸하지 않는 내담즙성, 제품가공처리 등에 사멸하지 않는 내열성, 장관세포 등에 부착할 수 있는 장정착성, 병원성세균에 대한 길항성이 있는 항균활성 등 다양한 특성을 갖추는 것이 바람직하다.

비만은 체지방의 과잉 축적으로 정의할 수 있는데, 보통 에너지 섭취와 소비의 불균형으로 유발되는 대사성질환으로서, 현대인의 비만은 주로 고칼로리 및 고지방 섭취로 인한 서구화된 식습관 때문에 나타나게 되고, 지속적으로 체내에 지질함량이 증가되어 혈중에 중성지방, LDL 콜레스테롤, 총콜레스테롤이 증가되는 이상 지질혈증이 나타나게 되며 동맥경화, 당뇨병, 고혈압 및 심혈관계 질환 등을 일으키게 된다.

현재 보통의 사람들은 비만 개선을 위한 다이어트에 많은 관심을 갖고 있지만, 의학적으로 심한 경우는 일반적으로 합성약품을 사용한 비만개선, 콜레스테롤 저하를 시도하고 있다. 그러나 비만개선을 위해 개발된 sibutramine, orlistat와 같은 합성의약품들은 두통, 변비, 현기증, 불면증, 간 손상과 같은 부작용 사례가 보고되어 있으며, 또한 고지혈증은 statin계(simvastatin, rosuvastatin, atorvastatin 등), fibrate계(clofibrate, bezafibrate등) 약물 등이 사용되고 있지만, 근육손상, 담석, 소화장애 등의 부작용을 가지는 것으로 알려져 있다.

따라서 최근에는 항비만, 콜레스테롤 저하 의약품에 의한 부작용을 최소화하면서, 안전한 기능성 식품에 대한 기대가 소비자로부터 증가하고 있기 때문에 기능성을 갖는 항비만, 콜레스테롤 저하 식품소재의 개발이 사회적으로 매우 절실히 요구되고 있는 상황이다. 따라서 혈중 콜레스테롤을 저하시키는 효과가 인정된 식품들이 각광받고 있는데, 그 중에서도 발효유와 유산균이 혈중의 콜레스테롤 함량을 저하시킨다는 사실이 확인되고 있어서 예방수단으로의 활용가능성이 높아지고 있다(Giliand 1990).

면역시스템에서, 대식세포(macrophage)는 면역학적 항상성의 유지 및 감염에 대한 선천적, 후천적 면역반응 체계에 있어서 중요한 역할을 하고 있다. 활성화된 대식세포는 일산화질소(NO) 및 인터류킨-6, TNF-α와 같은 염증성 사이토카인을 분비하여 면역성을 조절한다. 한편, 유산균은 건강한 사람의 장내 미생물 균총의 일부로 존재하고 있으며, 특이 및 비특이적 면역체계 증강에 의해 숙주에게 유익한 효과를 주는 것으로 알려져 있어 유산균에 대한 면역증강 효과에 관한 연구가 많이 진행되어 왔다. 유산균은 숙주의 면역반응을 유도하여 대식세포와 같은 면역세포를 활성화시켜 숙주의 면역력을 증가시켜주는 것으로 알려지고 있다.

따라서 혈청 내 콜레스테롤 저하 기능과 내장지방 개선기능을 갖고 있으면서, 면역 활성도 증가시킬 수 있는 유산균을 이용할 수 있다면, 심혈관 질환 예방, 항비만 및 면역기능 개선에 유용하게 활용할 수 있을 것이다. Lactobacillus casei 균주의 경우, 동물실험을 통해 콜레스테롤을 저하시키는 균주가 보고된 바는 있으나, 아직까지 Lactobacillus casei 균주 가운데 콜레스테롤 저하기능, 내장지방 개선기능 및 면역 활성기능을 모두 가지고 있는 유산균이 보고된 바는 없다.

본 발명자는 인간의 장관으로부터 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) 균주를 분리하고, 이중에서 콜레스테롤 저하기능, 내장지방 개선 효과 및 면역활성 기능을 가지고 있는 균주를 발굴하고자 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자는 인간의 장관에서 분리한 신규한 균주인 락토바실러스 카제이 WK3 균주가 콜레스테롤 저하기능 및 면역조절 활성을 증가시키고 내장지방을 감소시키는 효과를 나타낸다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 콜레스테롤 저하용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 콜레스테롤 저하용 식품 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 콜레스테롤 저하용 사료첨가용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 면역기능 개선용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 면역기능 개선용 식품 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 면역기능 개선용 사료첨가용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 내장지방 개선용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 내장지방 개선용 식품 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) WK3 균주(KCTC18395P) 또는 이의 배양액의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 콜레스테롤 저하용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 락토바실러스 카제이 WK3 균주(KCTC18395P) 또는 이의 배양액의 식품학적 유효량; 및 (b) 식품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 콜레스테롤 저하용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 락토바실러스 카제이 WK3 균주(KCTC18395P) 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 콜레스테롤 저하용 사료첨가용 조성물을 제공한다.

본 발명자는 인간의 장관으로부터 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) 균주를 분리하고, 이중에서 콜레스테롤 저하기능, 면역조절 활성 및 내장지방 개선 효과를 가지고 있는 균주를 발굴하고자 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자는 인간의 장관에서 분리한 신규한 균주인 락토바실러스 카제이 WK3 균주가 콜레스테롤 저하기능 및 면역조절 활성을 증가시키고 내장지방을 감소시키는 효과를 나타낸다는 것을 확인하였다.

본 발명은 신규한 락토바실러스 카제이 WK3 균주를 유효성분으로 포함하는 콜레스테롤 저하용 조성물, 면역기능 개선용 조성물 및 내장지방 개선용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 용어 “콜레스테롤”은 총 콜레스테롤(total cholesterol; T-CHO) 또는 저밀도지단백질 콜레스테롤(low density lipoprotein cholesterol; LDL-CHO)을 의미한다.

본 명세서에서 용어 “콜레스테롤 저하능”은 혈중 상기 총 콜레스테롤 또는 저밀지단백질 콜레스테롤의 양을 감소시키는 효과를 의미한다. 본 발명의 WK-3 균주는 담즙염이 존재하는 장관 내 환경에서 콜레스테롤 저하능이 있음을 나타내었다.

본 명세서에서 용어 “면역기능 개선”은 면역조절작용이 활성화되는 것을 의미한다. 본 발명의 WK-3 균주는 면역 활성기능의 지표가 되는 산화질소(NO), NF-kB, IL-1β 및 TNF-α의 활성을 촉진 또는 증가시킨다는 것을 확인하였으며, 상업용 균주인 LGG 균주에 비해 뛰어난 면역 활성기능을 나타내었다.

본 명세서에서 용어 “내장지방 개선”은 복막 안의 내장 주위에 축적된 내장지방을 감소시키는 효과를 의미한다. 본 발명의 WK-3 균주는 간 내 지질 축적 완화 및 부고환지방조직 내 지방세포 감소 효과를 나타내었다.

본 발명에서 “이의 배양액”이란, 균주를 액체배지에서 배양한 경우, 균주를 포함하고 있는 배양액을 의미한다.

상기 신규한 락토바실러스 카제이 WK3 균주를 유효성분으로 포함하는 콜레스테롤 저하용 조성물 및 내장지방 개선용 조성물은 유산균을 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 엔테로코커스 패시엄 WK5(Enterococcus faecium WK5), 비피도박테리엄 롱검 WK9(Bifidobacterium longum WK9), 락토바실러스 플란타럼 K-1(Lactobacillus plantarum K-1) 및 이의 배양액으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 균주 또는 배양액을 추가적으로 포함한다.

하기 실시예에 입증된 바와 같이, 락토바실러스 카제이 WK3, 엔테로코커스 패시엄 WK5, 비피도박테리엄 롱검 WK9 및 락토바실러스 플란타럼 K-1의 혼합균주는 락토바실러스 카제이 WK3 단독 군과 비교하여 우수한 콜레스테롤 저하능 및 내장지방 감소 효과를 나타내었다.

본 발명의 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 락토바실러스 카제이 WK3 균주(KCTC18395P) 또는 이의 배양액의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 락토바실러스 카제이WK3 균주(KCTC18395P) 또는 이의 배양액의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여 방식으로 적용된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 0.0001-100 ㎎/kg 범위 내이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 식품 조성물로 제공될 수 있다. 본 발명의 락토바실러스 카제이 WK3 균주(KCTC18395P) 또는 이의 배양액을 유효성분 포함하는 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 락토바실러스 카제이 WK3 균주(KCTC18395P) 또는 이의 배양액뿐 만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 락토바실러스 카제이 또는 이의 배양액 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명의 락토바실러스 카제이 WK3 균주(KCTC18395P) 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 Th2-매개 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물은 건강기능식품으로 제조될 수 있다. 상기 건강기능식품은 특별히 이에 제한되지 않으나, 건강 기능성 식품, 영양 보조제, 영양제, 파머푸드(pharmafood), 건강보조식품, 뉴트라슈티칼(nutraceutical), 디자이너 푸드, 식품 첨가제 등의 모든 형태의 식품이 될 수 있는데, 바람직하게는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 될 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 식품제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 상기 외에 본 발명의 식품은 여러 가지 영양제, 비타민류, 광물(전해질), 식이성분, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 사료 첨가용 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명의 락토바실러스 카제이 WK3 주는 강한 내산성 및 내답즙성을 가지고 있으므로 위산과 담즙산에 저항성이 있어 생존한 상태로 장에 도달할 수 있다. 또한 높은 프로바이오틱스 활성을 가지고 있으므로 가축 사료 첨가용 조성물에 유효성분으로 포함될 수 있다.

본 발명의 사료 첨가용 조성물에는 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나 폴리페놀, 카테킨(catechin), 알파-토코페롤, 로즈메리 추출물(rosemary extract), 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상이 추가로 포함될 수 있다.

본 발명의 사료 첨가용 조성물에는 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이 효소, 다른 생균 형태의 미생물 제제 등과 같은 보조제 성분, 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제 또는 질병예방제와 같은 첨가제가 포함될 수 있다.

본 발명의 사료 첨가용 조성물은 건조 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 사료 첨가용 부형제를 포함할 수 있다. 사료 첨가용 부형제로는 제올라이트, 옥분 또는 미강 등이 있으나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 가축 사료 첨가용 조성물은 동물에게 단독으로 투여되거나 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합되어 투여될 수 있으며, 통상적으로, 당업계에 잘 알려진 바와 같이 단독 일일 섭취량 또는 분할 일일 섭취량을 사용할 수 있다.

본 발명의 사료 첨가용 조성물을 사용할 수 있는 동물에는 식용우, 젖소, 송아지, 돼지, 돼지새끼, 양, 염소, 말, 토끼, 개, 고양이 등과 같은 가축, 병아리, 알닭, 가정용 닭, 수탉, 오리, 거위, 칠면조, 메추라기, 작은새 등과 같은 가금류 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 콜레스테롤 저하기능, 면역활성 기능 및 내장지방 개선 효과를 가지는 신규한 균주를 제공한다.

(b) 본 발명의 신규한 균주 또는 이의 배양액은 콜레스테롤 저하용 조성물로 이용될 수 있다.

(c) 본 발명의 신규한 균주 또는 이의 배양액은 면역기능 개선용 조성물로 이용될 수 있다.

(d) 본 발명의 신규한 균주 또는 이의 배양액은 내장지방 개선용 조성물로 이용될 수 있다.

도 1은 WK-3 균주의 내산성시험 결과를 분석한 도표이다.
도 2는 WK-3 균주의 내답즙성시험 결과를 분석한 도표이다.
도 3은 WK-3 균주의 내열성시험 결과를 분석한 도표이다.
도 4는 WK-3 균주의 NO 생성시험 결과를 분석한 도표이다.
도 5는 WK-3 균주의 NF-κB 생성시험 결과를 분석한 도표이다.
도 6은 WK-3 균주의 IL-6 생성시험 결과를 분석한 도표이다.
도 7은 WK-3 균주의 TNF-α 생성시험 결과를 분석한 도표이다.
도 8은 고지방식이-유도 비만 C57BL/6J 마우스의 간 조직을 H&E 염색한 현미경 이미지를 나타낸다(400 배율). 'NC'는 정상식이의 음성대조군, 'PC'는 고지방식이의 양성대조군, 'WK3'은 락토바실러스 카세이 WK3 균주, 'WK5'는 엔테로코커스 패시엄(Enterococcus faecium) WK5, 'WK9'는 비피도박테리엄 롱검(Bifidobacterium longum) WK9, 'K-1'은 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) K-1을 나타낸다. 화살표는 간세포의 지방 소립(lipid droplets)을 가리킨다.
도 9는 고지방식이-유도 C57BL/6J 마우스의 백색지방 조직 내 지방세포의 크기를 나타낸다. 부고환지방조직의 절편을 H&E 염색하여 나타낸다(100 배율).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 락토바실러스 카제이 WK3 균주의 분리 및 동정

인간의 장관으로부터 락토바실러스 카제이 균주를 분리하기 위하여 7명의 건강한 사람의 장관에서 채취한 신선한 분변 1g을 희석액 A(KH₂PO₄ 4.5 g, Na₂HPO₄ 6.0 g, L-cysteinㆍHCl 0.5 g, Tween 80 0.5 g, Agar 1.0 g, 증류수 1000 ㎖) 9 ㎖을 사용하여 10배 단계 희석한 다음, 유산균 분리용 배지인 TATAC, LBS, BL 배지를 사용하여 37℃에서 24시간 동안 Steel wool methods를 사용한 혐기배양을 통해 유산균주들을 분리하였다.

분리된 유산균주들을 대상으로 생균제로서의 특성조사(실시예 2참조), 콜레스테롤 저하 특성조사(실시예 3참조), 면역활성 특성조사(실시예 4참조)를 실시하였으며, 그 중에서 생균제로서의 특성은 물론, 콜레스테롤 저하기능과 면역활성 기능이 가장 우수한 균주를 WK3 균주로 명명하였다.

WK3 균주를 미생물학적으로 동정하기 위하여 Bergey's Manual of Determinative bacteriology의 방법에 따라 형태학적 특성 및 생화학적 특성을 조사하였으며, API 50 CHL kit(BiomeLyan, France)를 사용하여, 탄수화물 이용성 등을 분석하였다. WK3 균주의 미생물학적 특성을 표 1에 정리하였다.

특징					결과
생리학적 특징
형태					Rod
그람 염색					+
스포어 형성					-
운동성					-
호기성 생장					+
혐기성 생장					+
생화학적 특징
Control	-	Galactose	+	Mannoside		-	Melibiose	-	Turanose	+
Glycerol	-	Glucose	+	Glucoside		-	Sucrose	+	Lyxose	-
Erythritol	-	Fructose	+	Glucosamine		+	Trehalose	+	Tagatose	+
D-Arabinose	-	Mannose	+	Amygdalin		+	Inulin	-	D-Fucose	-
L-Arabinose	+	Sorbose	+	Arbutin		+	Melezitose	-	L-Fucose	-
Ribose	+	Rhamnose	-	Esculin		+	Raffinose	-	D-Arabitol	-
D-xylose	-	Dulcitol	-	Salicin		+	Starch	-	L-Arabitol	-
L-xylose	-	Inositol	-	Cellobiose		+	Glycogen	-	Gluconate	-
Adonitol	+	Mannitol	+	Maltose		+	Xylitol	-	2-keto Gluconate	-
Xylopyranosicle	-	Sorbitol	+	Lactose		+	Gentiobiose	+	5-keto Gluconate	-

최종적으로 WK3의 균주의 분자생물학적 동정을 위하여, WK3 균주의 16S rRNA 염기서열을 분석하였다. 분석한 16S rRNA 유전자 염기서열을 NCBI의 BLAST program을 이용하여 기존에 알려진 미생물과의 상동성을 분석하였다. 분석결과, WK-3 균주는 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei)와 99%의 상동성을 나타내었으며 기존에 존재하지 않는 신규한 균주임을 확인하였다. 따라서 생균제로서의 특성은 물론, 콜레스테롤 저하기능과 면역활성 기능이 가장 우수한 WK3 균주를 최종적으로 Lactobacillus casei WK-3로 명명하여 2015년 6월 23일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁하였다(기탁번호 KCTC18395P).

실시예 2: WK3 균주의 생균제로서의 특성 조사

1. 내산성

분리균주가 산성 환경에서 생존할 수 있는지를 알아보기 위하여, 분변에서 분리된 유산균을 BHI배지에 접종 후 37℃에서 17시간 혐기배양하고, 0.05M 인산나트륨 버퍼를 HCl로 보정하여 만든 pH 7.0, 6.0, 5.0, 4.0, 3.0 및 2.0 완충용액 속에 각각 10⁷ cfu/㎖ 농도로 접종하였다. 각각의 완충용액을 37℃에서 2시간 동안 정치배양한 후, 각 농도별로 1 ㎖ 희석액을 BHI에 도말 후 37℃에서 48시간 동안 혐기배양하였다. 배양 후 성장된 집락수를 계수함으로써 각각의 산성 pH에 대한 내산성 특성을 확인하였다.

확인결과, WK-3 균주는 pH 3 및 pH 4에서도 우수한 내산성의 특성을 나타내었다(도 1).

2. 내담즙성

담즙산(bile acid)에 대한 분리균주의 내성여부를 확인하기 위하여, 분리된 유산균을 BHI 배지에 접종하고, 37℃에서 17시간 동안 혐기배양한 후, 10진 단계희석을 하여 생균수를 측정하였다. 그 다음, 담즙산인 oxgall이 0%, 0.3%씩 첨가된 BHI 한천배지에 도말하여 37℃에서 48시간 동안 혐기배양하고, 생존한 집락을 계수하여 내담즙성을 측정하였다.

확인결과, 0.3%의 oxgall에서도 우수한 내담즙성 특성을 나타내었다(도 2).

3. 내열성

유산균을 BHI 배지에 접종하여 37℃에서 17시간 혐기배양 한 후 10진 단계희석을 하여 생균수를 측정하고, 배양액을 70 및 80℃에서 각각 5, 10, 15 및 20분 동안 노출시킨 후 BHI배지에 도말하고 37℃에서 48시간 동안 혐기배양하였다. 초기 생균수와 열처리 후 형성된 집락 수의 차이를 분석하여 내열성 균주 여부를 확인하였다.

확인결과, WK-3균주는 70℃, 80℃에서 5분, 10분간 열처리 후에도 높은 생존율을 나타내어 우수한 내열성을 가지고 있다는 것을 확인할 수 있었다(도 3).

4. 병원성 억제능 검사

콜레스테롤 저하 및 면역활성 특성균주가 잘 알려진 병원성 세균의 성장을 억제할 수 있는지 알아보기 위하여, Agar spot assay를 변형하여 병원성 억제능을 검사하였다. 병원성억제능 실험에 사용한 공시병원균은 KCTC(The Korean Collection for Type Cultures)와 KCCM(Korean Culture Center of Microorganisms)에서 분양 받아 사용하였다. E. coli KCTC 1682, Salmonella Enteritidis KCCM 12021, Staphylococcus aureus KCTC 1621, Listeria monocytogenes KCTC 3569는 BHI medium(brain heart infusion, Difco, USA)를 이용하여 37℃에서 배양하였다.

각 지시균을 10 ㎖ Brain heart infusion broth(BBL, USA)에 접종한 후, 37℃에서 24시간 호기 배양하였다. 유산균주들은 BHI broth에서 37℃, 17시간 혐기배양하였다. BHI agar에 배양된 유산균을 20㎕ 점적하고, 37℃에서 24시간 혐기배양하였다. 배양된 유산균을 함유한 평판배지에, 7ml BHI 배지(0.7%)에 혼합된 병원균을 pouring 하여 37℃에서 24시간 혐기배양 한 후 억제환을 측정하였다. Spot 주위의 형성된 억제환의 직경을 ㎜ 단위로 측정하여 병원균의 억제정도를 평가하였다.

유산균의 병원성세균 억제능력을 조사한 결과, 표 2에서와 같이 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) KCTC 3569 균주에 대해 높은 억제능력을 나타내었으며, 이스케리치아 콜라이(Escherichia coli) KCTC 1682, 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) KCTC 1621, 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis) KCCM 12021 균주에 대해서도 억제능력을 나타내었다.

균주	지시균
균주	이스케리치아 콜라이 KCTC 1682	살모넬라 엔테리티디스 KCCM 12021	스태필로코커스 아우레우스 KCTC 1621	리스테리아 모노사이토제네스 KCTC 3569
WK-3	+ (29 mm)	+ (26 mm)	+ (32 mm)	+ (27 mm)

따라서 이상의 결과로부터 본 발명의 WK3 균주는 생균제용 균주로서 매우 적합한 균주임을 확인할 수 있었다.

실시예 3: WK3 균주의 콜레스테롤 저하기능 조사

1. BSH(Bile salt hydrolysis) 활성 조사

담즙은 담즙염(Bile salt), 콜레스테롤, 레시틴과 같은 여러 가지 구성 물질 및 이자의 NaHCO₃와 유사한 수용성 알칼리성 액체로 구성되어 있다. 담즙염은 콜레스테롤의 유도체이며, 지방의 흡수를 활성화시키고 세정효과를 통해 지방의 소화를 돕는 기능을 한다. BSH(Bile salt hydrolase)는 지방의 소화 및 흡수를 돕는 담즙염을 분해하는 효소로서, BSH 활성이 높아지면 체내 항상성 반응에 의해 부족해진 담즙을 합성하기 위해 콜레스테롤을 사용하게 되어, 결국 혈중 콜레스테롤이 감소하게 된다. 따라서 BSH 활성은 혈중의 콜레스테롤 조절에 중요한 역할을 하게 된다.

WK3 균주의 BSH 활성을 조사하기 위하여 0.5%의 TDCA와 0.37 g/L의 CaCl₂가 첨가된 MRS 한천배지에 멸균된 페이퍼 디스크(paper disc)를 떨어뜨린 후, 그 위에 균주를 침투시켰다. 혐기상태로 37℃에서 72시간 동안 배양한 다음, 디스크 주위의 지름을 측정하여 BSH 활성을 분석한 결과, WK-3균주의 콜로니 주위에 직경 24mm의 투명 침전대를 형성하는 것으로 확인되어 WK-3균주는 BSH활성이 있음을 알 수 있었다. 따라서 이를 통해 WK3균주는 혈중의 콜레스테롤 감소효과를 가지고 있을 것으로 추정할 수 있었다.

2. In vitro 상에서 콜레스테롤 저하기능 검사

WK3 균주의 in vitro 상에서 담즙염의 유무에 따른 콜레스테롤 저하기능을 알아보기 위하여 0% 또는 0.3%의 oxgall(황소유래 담즙염)이 첨가된 L-cysteine·monohydrochloride·monohydrate MRS broth(pH 7.0)에 용해성 콜레스테롤(polyoxyethanyl-cholesterol sebacate, Sigma, USA)을 첨가한 다음, 0.45 ㎛ millepore를 통해 여과멸균시켜 콜레스테롤-MRS broth에 미리 배양한 유산균주(WK3 및 LGG)를 15 ㎕씩 처리하고 혐기상태로 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 비교균주인 LGG균주는 상업용균주인 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) GG균주를 사용하였다. 음성대조군으로서 세균배양액 없이 MRS 배지만을 37℃에서 24시간 동안 배양한 것을 사용하였다. 콜레스테롤-MRS 배양액을 3000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후, 10 ㎕의 상층액을 수집하였다. 콜레스테롤의 양을 분석하기 위하여 555nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 음성 대조군 대비 남아있는 콜레스테롤의 양을 콜레스테롤 감소율(reduction rates of cholesterol, %)로 표시하였다.

분석결과 WK-3균주는 0.3% oxgall이 첨가된 배지에서 비접종군 대비 26.2%의 콜레스테롤 감소율을 나타내었으며, 상업용 균주인 LGG는 7.1%의 콜레스테롤 감소율을 나타내었다. 이를 통해 WK-3균주가 담즙염이 존재하는 장관 내 환경에서 콜레스테롤 저하기능을 가지고 있음을 알 수 있었다.

균주	잔여 콜레스테롤[mg/dl] (콜레스테롤 감소율[%])
균주	oxgall 0 %	oxgall 0.3 %
대조군	96.5 (0%)	57.6 (0%)
WK3	89.7 (7.1%)	42.5 (26.2%)
LGG	90.4 (6.3%)	53.5 (7.1%)

실시예 4: WK3 균주의 면역 활성기능 조사

실험방법

1. 면역활성 실험을 위한 세포 배양 및 시료 처리

WK3 균주의 면역활성을 측정하기 위하여, 한국세포주은행으로부터 분양 받은 대식세포(RAW 264.7 macrophage cell)를 10% FBS(Gibco Laboratories)와, 100 unit/㎖의 스트렙토마이신, 페니실린(Gibco Laboratories)이 첨가된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium, Gibco Laboratories) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂조건에서 배양하였다. WK3 균주의 대식세포의 사이토카인 분비 및 일산화질소(NO) 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 세포를 12 well 플레이트에 각 well 당 5.0× 10⁵cells/㎖가 되도록 분주하고 2시간 동안 안정화 시킨 다음, 새 배지로 교체하여 주었다. 그 다음, 1.0× 10 cfu/㎖ 농도로 맞춘 유산균 시료를 100 ㎕ 첨가하여 최종 1.0× 10⁷cfu/㎖ 농도로 48시간 동안 배양하였다. 염증 반응 모델의 경우, 각 well 당 1 ㎍/㎖ LPS(lipopolysaccharide, Sigma, USA)를 처리하였으며, 음성대조군으로 PBS(pH 7.2)를 처리하였다. 양성대조군으로서 면역활성을 가지고 있는 상업용균주인 Lactobacillus rhamnosus GG를 사용하였다.

NF-κB 측정을 위한 RAW BLUE cell은 10% FBS(Gibco Laboratories) 및 100 unit/㎖의 스트렙토마이신, 페니실린(Gibco Laboratories)이 첨가된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium, Gibco Laboratories) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂조건에서 배양하였다. 4 내지 5회 계대 배양한 다음, 제오신(Zeocin, invivogen, USA) 100 mg/㎖)을 처리하여 배양하였다.

염증 반응 모델의 경우, 각 well 당 100 ng/㎖ LPS(lipopolysaccharide, Sigma, USA)를 처리하였으며, 양성대조군으로서 Lactobacillus rhamnosus GG를 사용하였다.

2. Nitric oxide(NO) 측정

RAW 264.7 cell을 5.0× 10⁵cells/㎖로 분주한 다음, WK3 균주, 양성대조군인 LPS, 음성대조군인 PBS를 처리한 배양액을 각각 회수하여 Griess reagent system(Promega, USA)을 사용하여 NO를 측정하였다. 96-well 플레이트에 배양액 50 ㎕를 넣고 Griess reagentⅠ(NED solution)과 Griess reagentⅡ (Sulfanilamide solution)을 동량으로 섞어 넣은 다음, 10분 동안 반응시킨 후 30분 이내에 마이크로플레이트 리더기(Molecular Devices, USA)를 이용하여 OD 540nm에서 측정하였다. 산화질소(NO)의 농도를 아질산나트륨의 표준곡선 0-100 μM)을 이용하여 계산하였다.

3. NFκB 측정

WK3 균주가 대식세포의 NF-κB 생성에 미치는 영향을 분석하기 위하여 세포를 96 well 플레이트의 각 well당 5.0× 10⁴cell/㎖로 분주한 다음, 2시간 동안 안정화 시킨 후, 새 배지로 교체하여 주었다. 그 다음, 1.0× 10⁷cfu/㎖ 농도로 맞춘 유산균 시료를 100 ㎕ 첨가하여 최종 1.0× 10⁶ cfu/㎖ 농도로 24시간 동안 배양하였다. 양성대조군의 경우, well 당 100 ng/㎖의 LPS를 처리하였다.

4. IL-6 및 TNF-α 측정

RAW 264.7 cell을 5.0× 10⁵cells/㎖로 분주한 다음, 세포가 안정되면 유산균과 LPS를 처리하고 48시간 후에 배양액을 회수하였다. IL-6 및 TNF-α 생산량을 IL-6, TNF-α ELISA kit(eBioscience, San Diego)를 이용하여 측정하였다. Sandwich ELISA 방법으로 측정하였으며, 각 시료를 3회 반복하여 측정하였다. 측정 대상에 따라 각 1차 항체 원액을 코팅 완충용액에 해당 농도가 되도록 희석하여, 96-well 마이크로플레이트에 well당 100 ㎕씩 분주 한 다음, 4℃에서 하루 밤 동안 반응시켰다. 5회 세척한 다음, Assay Diluent를 200 ㎕씩 넣고 1시간 동안 상온에 두어 블록킹하였다. 각 well을 세척용 완충용액으로 5회 세척한 후 시료 및 스탠다드를 적당량 희석하여 100 ㎕씩 분주하였다. 4℃에서 하루 밤 동안 반응 시킨 다음, 세척용 완충용액으로 5회 세척하고 Avidin이 결합된 2차 항체를 Assay Diluent에 희석하여 well당 100 ㎕씩 처리하여 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 5회 세척한 다음, Avidin-HRP 용액을 100 ㎕씩 분주하여 30분 동안 상온에서 반응시킨 후 7회 세척하였다. TMB 용액을 well당 100 ㎕씩 처리 한 후 15분 동안 상온에서 반응시킨 다음, 2N H₂SO₄용액을 well당 50 ㎕씩 첨가하여 반응을 정지시켰으며, 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

실험결과

WK3 유산균주의 면역활성 기능을 분석하기 위하여, 일반적인 지표로 사용되는 Nitric oxide(NO), NFκB, IL-6 및 TNF-α의 생성량을 분석하였다. 분석결과, WK3 균주는 저농도(1.0× 10⁷ CFU/㎖)에서 양성대조군 균주인 Lactobacillus rhamnosus GG(LGG) 균주보다 높은 NO생성량을 나타내었고, 고농도(5.0× 10⁷ CFU/㎖)에서도 LGG균주보다 2배정도 높은 NO생성을 유도하였다(도 4). NF-κB생성량 또한 저농도, 고농도에서 WK3균주가 각각 LGG보다 유의적으로 증가하였다(도 5). 또한, 고농도의 WK3 균주의 IL-6 생성량(91.28 pg/㎖)이 고농도의 LGG 균주보다(62.80 pg/㎖) 유의적으로 증가하였다(도 6). TNF-α 분석결과에서도 WK-3균주(5973.78 pg/㎖)는 양성대조군 균주인 LGG 균주(3198.50 pg/㎖)보다 고농도에서 2배정도 높은 생성량을 나타내었다(도 7).

이러한 결과는 WK3 균주가 면역활성 기능이 우수한 균주로 알려진 LGG 상업용 균주보다 더 우수한 면역활성 기능을 가지고 있다는 것을 보여주는 것이다.

실시예 5: 콜레스테롤 저하균주의 동물실험을 통한 효능 검증

1. 균주 및 배양

본 연구에 사용한 유산균은 건강한 사람의 장관에서 분리한 유산균 락토바실러스 카세이 WK3(Lactobacillus casei WK3), 엔테로코커스 패시엄 WK5(Enterococcus faecium WK5), 비피도박테리엄 롱검 WK9(Bifidobacterium longum WK9) 및 김치에서 유래된 유산균 락토바실러스 플란타럼 K-1(Lactobacillus plantarum K-1)균주로 MRS(Lim HJ, Kim SY, Lee WK. Isolation and identification of cholesterol lowering lactic acid bacteria from human intestine for probiotic use. J Vet Sci 2005, 5, 391-395.) 또는 BHI(brain heart infusion, Mitsuoka T. The World Anaerobic Bacteria. Sobun Press. Tokyo, 1980 pp. 13-65.) 배지를 사용하여 배양하였다. 상기 엔테로코커스 패시엄 WK5 및 비피도박테리엄 롱검 WK9은 본 연구실 보유균주이고, 락토바실러스 플란타럼 K-1은 참여기업보유 균주이다(2015 International scientific conference probiotics and prebiotics, 78 및 Se-Eun Jang et al. Inhibitory Effect of Lactobacillus plantarum K-1 on Passive Cutaneous Anaphylaxis Reaction and Scratching Behavior in Mice, Arch Pharm Res 2001, 34, 2117-2123).

각 균주들을 MRS 또는 BHI 배지에 전 배양액의 1%를 접종한 후 37℃에서 17시간 배양한 후 배양액 전체를 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 균체를 회수하였다. 회수한 균체를 멸균된 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS; pH 7.2)로 2회 세척 후, 단독으로 사용할 WK3 균주는 2.0×10⁹ CFU/마우스의 균수로, 복합투여군에 사용할 WK3, WK5, WK9 및 K-1균주는 5.0×10⁸CFU/마우스의 균수로 조정하기 위하여 각각 PBS로 희석하여 실험동물인 마우스에 경구투여하였다.

2. 6주간 마우스의 체중변화

실험동물은 웅성 5주령의 C57BL/6J(중앙실험동물, Korea)를 사용하였고, 실내온도 20±5℃. 습도 55-60%, 12시간 광-암 주기의 조건에서 표준 식이와 물을 충분히 공급하면서 1주간 환경에 적응시켰다. 음성대조군 NC군은 기본식이(No. EEGJ36060, Furina INC., Korea)를 급여하고, 양성대조군 및 시험군은 기본식이에 라드(lard, 20%), 콜레스테롤(1.97%)을 첨가한 고지방 식이(Research diets Inc., Korea)를 6주 동안 급여하여 비만을 유도하였고, 각 군별로 농도에 맞게 제조한 PBS, 유산균들을 6주간 투여하였다(표 4). 표 4의 'NC'는 정상식이의 음성대조군, 'PC'는 고지방식이의 양성대조군, 'WK3'은 락토바실러스 카세이 WK3 균주, 'WK5'는 엔테로코커스 패시엄(Enterococcus faecium) WK5, 'WK9'는 비피도박테리엄 롱검(Bifidobacterium longum) WK9, 'K-1'은 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) K-1을 나타낸다.

-	군	투여물질	식이	투여물질 농도/투여량
G1	NC	PBS	정상 펠렛 식이	PBS/200 ㎕
G2	PC	PBS	고지방식이 (D12451, Research diets Inc)	PBS/200 ㎕
G3	유산균 단독투여군	WK3^a)		2.0 x 10⁹/200 ㎕
G4	유산균 복합투여군	WK3+WK5+WK9+K1^b)		각 5.0×10⁸/200 ㎕

6주간의 투여기간동안 마우스의 무게를 측정하여 각 군의 무게변화를 관찰하였다. 식이효율은 아래의 공식에 대입시켜 최종 체중증가량을 사료섭취량으로 나누어 산출하여 통계를 분석하였다.

식이효율(Feeding efficiency ratio; FER) = 체중증가량 (g/6 weeks)/사료섭취량(g/day)

6주간의 마우스들의 체중변화를 살펴본 결과, NC를 제외한 투여군들은 1주차부터 비만이 유도되었으며, 6주동안 투여군간의 체중의 유의적인 변화는 관찰할 수 없었다(표 5). 표 5의 'a)' 및 'b)'의 윗첨자는 ANOVA(p<0.05)로 검정한 통계적 차이를 의미한다.

Week Group¹⁾	평균 체중(g) (n=6)
Week Group¹⁾	0	1	2	3	4	5	6
NC	20.73^a2) ±0.78	20.66^a ±0.84	20.76^a ±1.03	21.48^a ±1.05	22.13^a ±1.15	22.40^a ±1.05	22.88^a ±1.00
PC	20.80^a ±0.67	21.90^b ±0.66	22.47^b ±0.72	23.67^b ±0.83	24.34^b ±1.01	25.67^b ±1.15	26.08^b ±1.23
WK3	20.88^a ±0.67	21.38^ab ±0.45	21.87^b ±0.17	22.97^b ±0.29	23.84^b ±0.90	24.79^b ±1.00	25.07^b ±1.03
WK3+WK5 +WK9+K-1	20.44^a ±0.14	21.34^ab ±0.47	21.98^b ±0.67	23.60^b ±1.02	24.53^b ±1.49	25.85^b ±2.11	26.15^b ±2.10

식이효율의 결과를 살펴보았을 때, PC군의 결과인 0.27에 비해 유산균 단독 및 복합투여군이 각각 0.22, 0.25로 감소한 것을 볼 수 있으나 유의적인 감소차이는 나타나지 않은 것을 알 수 있다(표 6).

Group¹⁾ Week (n=6)	체중 증가량 (g/6weeks)	사료섭취량 (g/day)	식이효율비²⁾
NC	1.90±1.18^a	22.68±2.06^b	0.08±0.05^a
PC	5.29±0.74^b	19.54±1.24^a	0.27±0.04^b
WK3	4.60±1.21^b	20.66±2.42^ab	0.22±0.05^b
WK3+WK5+ WK9+K-1	4.86±1.15^b	19.38±1.29^a	0.25±0.05^b

2. 마우스 혈청 내 생화학적 및 지질농도 검사 결과

6주간의 투여가 끝난 후 마우스의 복대정맥에서 채혈 후 4℃에서 3000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 혈장을 분리하였다. 분리된 혈장은 지질농도로서 TG(triglyceride), TC(total cholesterol), LDL(low-density lipoprotein cholesterol) 및 HDL(high-density lipoprotein cholesterol)를 측정하고 혈액생화학적지표인 ALT(alanine aminotransferase) 및 AST(aspartate aminotransferase), ALP(Alkaline phosphatase)를 자동혈액생화학분석기를 이용하여 측정하였다.

간 기능 지표 효소인 ALP, AST 및 ALT는 고지방 식이, 고 콜레스테롤 식이, 알코올 등으로 지방간 등이 유발되어지고, 간 독성 물질에 의하여 간 조직이 손상되어지면 혈중으로 이들 효소가 다량 유출되어 활성도가 높아지게 된다고 알려져 있다. 본 실험에서는 유산균을 투여함으로써 PC군의 효소 활성보다 유의적으로 감소하는 효과를 보지 못하였다.

혈장 내 LDL-콜레스테롤 농도가 증가하고, HDL-콜레스테롤 농도가 감소하게 되면 사람에서 동맥경화증, 고혈압 및 심혈관계 질환을 유발하게 된다고 알려져 있다. 본 실험에서는 유산균을 복합으로 투여한 군의 혈중 내 LDL-콜레스테롤이 PC군보다 유의적으로 감소하였다. 또한 유산균 복합군은 총콜레스테롤의 양도 PC군에 비해 유의적으로 감소시켰다(표 7). 이러한 결과를 통해서 유산균을 복합으로 투여하였을 때 혈중 총콜레스테롤 농도 저하는 물론 LDL-콜레스테롤 효과도 있는 것으로 사료된다.

군¹⁾ (n=6)	ALP (IU/L)	AST (IU/L)	ALT (IU/L)	HDL-C (mg/dL)	LDL-C (mg/dL)	T-CHO (mg/dL)	TG (mg/dL)
NC	453.45^b3) ±28.51	43.05^a ±11.86	25.57^b ±2.93	60.85^a ±11.45	26.19^a ±0.25	97.75^a ±15.52	53.55^b ±20.38
PC	321.77^a ±32.95	42.77^a ±3.68	20.13^ab ±2.76	83.05^b ±5.96	64.06^b ±0.73	154.30^b ±15.60	35.95^ab ±7.33
WK3	340.03^a ±43.12	45.98^a ±11.67	21.48^ab ±5.75	82.70^b ±13.21	60.97^b ±0.87	151.52^b ±25.52	39.25^ab ±11.12
WK3+WK5 +WK9+K-1	320.48^a ±22.13	42.68^a ±4.04	19.18^a ±5.02	78.55^b ±7.66	50.25^a ±0.97	135.22^a ±19.18	33.10^a ±11.13

3. 마우스 장기중량 측정결과

혈액을 채취한 후 육안 검사를 통하여 내부 장기의 이상유무를 확인하고 주요장기(부고환 지방조직 및 간)들을 적출하여 생리식염수로 세척하고 여과지로 수분을 제거한 후 전자저울로 절대 중량을 측정하였다. 적출한 해당 장기는 부검 전 절식된 체중에 대한 각각의 상대중량을 산출하였다.

상대장기중량(%) = 장기무게(g)/ 부검 전 절식 체중(g) × 100

마우스 간장의 상대중량(%) 측정결과 표 8에서와 같이 유산균 복합투여군의 경우, 지방간 유발로 비대해진 PC군에 비해 장기중량을 유의적으로 감소시킨 것을 알 수 있었다. 부고환지방조직의 중량은 PC군에 비해 유산균 투여군에서 유의적인 무게감소가 나타나지 않았으나, 유산균단독, 복합투여군이 각각 PC군의 부고한 지방조직 2.80%에 비해 2.66, 2.63%로 무게를 감소시켰다.

군¹⁾ (n=6)	장기 중량(%)²⁾
군¹⁾ (n=6)	간	부고환 지방조직
NC	3.13 ± 0.14^a	1.28 ± 0.12^a
PC	3.76 ± 0.41^c	2.80 ± 0.61^b
WK3	3.46 ± 0.16^bc	2.66 ± 0.43^b
WK3+WK5 +WK9+K-1	3.42 ± 0.19^ab	2.63 ± 0.53^b

4. 간 조직의 병리학적 관찰

마우스에서 적출한 간 및 부고환지방조직을 10% 중화 포르말린(neutral buffered formalin) 용액에 1일 이상 고정시킨 후, 파라핀으로 포매(embedding)하고 마이크로톰(microtome)으로 파라핀 블록을 4 ㎛ 두께로 박절하였다. 자일렌(Xylene)을 이용하여 파라핀을 제거시킨 후, 100%, 95%, 90%, 80% 및 70% 알코올로 친수화시켜 hematoxylin-eosin(H&E) 염색 후 400배의 배율에서 광학현미경으로 관찰하였다. 또한 부고환 지방조직은 지방세포 크기를 측정하기 위하여 디지탈 이미지 분석기(Saramsoft Co., Ltd., Korea)의 이미지 파트너 소프트웨어를 이용하여 실험군별 평균 지방구 크기를 산출하였다.

부검 시 채취한 간장 조직을 H&E 염색한 후, 400배율에서 관찰한 조직병리학적 관찰 결과는 도 8에 나타내었다. 고지방사료만을 섭취한 PC군은 NC군에 비해 세포크기의 다양성을 동반하는 간세포의 팽윤과 세포질내의 공포화(cytoplasmic vacuolation)을 동반하는 지방변성(fatty degeneration)이 관찰되었다. 그러나 이와 같은 지방성 변성결과는 유산균 투여군에서 현저히 감소되어, 간장 내 지질 축적이 완화되었음을 확인할 수 있었다.

5. 부고환지방조직 크기

부고환지방조직을 H&E 염색하여 현미경으로 관찰한 결과 도 9에 나타내었으며, 실험군의 지방세포 크기 측정 결과는 표 9에 제시하였다. 도 9에서와 같이, PC군의 지방세포크기는 NC군에 비교하여 매우 현저한 증가를 보였으며, 이와 같은 지방세포크기의 증가는 유산균 투여에 의하여 감소하고 있음을 확인할 수 있었다.

이미지 분석 시스템을 사용하여 측정한 실험군별 지방세포크기는 PC군에서 19.3±2.65 ㎛로서 가장 큰 결과를 보였지만, 유산균 단독투여군 및 혼합투여군에서는 각각 15.0±2.36 ㎛ 및 13.8 ±2.50 ㎛를 나타내어 유의적인 감소결과를 나타내었다.

군¹⁾	지방세포 크기(㎛) (n=6)
NC	8.6 ± 2.17^a2)
PC	19.3 ± 2.65^c
WK3	15.0 ± 2.36^b
WK3+WK5+WK9+K-1	13.8 ± 2.50^b

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 통상의 기술자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 구체적인 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국생명공학연구원

KCTC18395P

20150623

Claims

(a) 내산성; (b) 내담즙성; (c) 내열성; (d) 이스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 리스테리아 모노시토제네스(Listeria monocytogenes)에 대한 항균성; (e) 콜레스테롤 개선; (f) 면역기능 개선; 및 (g) 내장지방 개선의 특징을 갖는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) WK3 균주(KCTC18395P).
제 1 항의 락토바실러스 카제이 WK3 균주(KCTC18395P) 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 이스케리치아 콜라이, 살모넬라 엔테리티디스, 스태필로코커스 아우레우스 또는 리스테리아 모노시토제네스에 대한 항균용 조성물.
(a) 제 1 항의 락토바실러스 카제이 WK3 균주(KCTC18395P) 또는 이의 배양액의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 유효성분으로 포함하는 혈중 콜레스테롤 개선용 약제학적 조성물.
(a) 제 1 항의 락토바실러스 카제이 WK3 균주(KCTC18395P) 또는 이의 배양액의 식품학적 유효량; 및 (b) 식품학적으로 허용되는 담체를 유효성분으로 포함하는 혈중 콜레스테롤 개선용 식품 조성물.
제 1 항의 락토바실러스 카제이 WK3 균주(KCTC18395P) 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 혈중 콜레스테롤 개선을 위한 사료 첨가용 조성물.
삭제
(a) 제 1 항의 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) WK3 균주(KCTC18395P) 또는 이의 배양액의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 면역기능 개선용 약제학적 조성물.
(a) 제 1 항의 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) WK3 균주(KCTC18395P) 또는 이의 배양액의 식품학적 유효량; 및 (b) 식품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 면역기능 개선용 식품 조성물.
제 1 항의 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) WK3 균주(KCTC18395P) 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 면역기능 개선을 위한 사료첨가용 조성물.
(a) 제 1 항의 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) WK3 균주(KCTC18395P) 또는 이의 배양액의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 내장지방 개선용 약제학적 조성물.
삭제
(a) 제 1 항의 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) WK3 균주(KCTC18395P) 또는 이의 배양액의 식품학적 유효량; 및 (b) 식품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 내장지방 개선용 식품 조성물.
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