KR101589026B1

KR101589026B1 - 바이오제닉 아민은 생산하지 않고, 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있는 바실러스 서틸리스 scj1 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101589026B1
Application number: KR1020140129530A
Authority: KR
Inventors: 정수지; 양희종; 정성엽; 정도연; 허주희
Original assignee: 재단법인 발효미생물산업진흥원
Priority date: 2014-09-26
Filing date: 2014-09-26
Publication date: 2016-01-28

Abstract

본 발명은 전통발효식품으로부터 분리된, 유해 미생물에 대한 항균 활성 및 항산화 활성이 있고, 바이오제닉 아민(biogenic amine)을 생산하지 않으면서, 프로테아제 효소를 분비하는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCJ1 균주(KCCM11568P), 상기 균주를 포함하는 식품, 상기 균주 또는 이의 배양액을 스타터 균주로 이용하여 장류를 제조하는 방법, 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 장류 제조용 미생물 제제, 상기 균주 또는 이의 배양액을 장류에 처리하는 단계를 포함하는 장류 유해 미생물 제어 방법 및 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 유해미생물에 대한 항균용 조성물에 관한 것이다.

Description

바이오제닉 아민은 생산하지 않고, 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있는 바실러스 서틸리스 SCJ1 균주 및 이의 용도{Bacillus subtilis SCJ1 strain not producing biogenic amine and having antimicrobial activity against pathogenic microorganism and uses thereof}

본 발명은 바이오제닉 아민은 생산하지 않고, 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있는 바실러스 서틸리스 SCJ1 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 전통발효식품으로부터 분리된, 유해 미생물에 대한 항균 활성 및 항산화 활성이 있고, 바이오제닉 아민(biogenic amine)을 생산하지 않으면서, 프로테아제 효소를 분비하는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCJ1 균주(KCCM11568P), 상기 균주를 포함하는 식품, 상기 균주 또는 이의 배양액을 스타터 균주로 이용하여 장류를 제조하는 방법, 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 장류 제조용 미생물 제제, 상기 균주 또는 이의 배양액을 장류에 처리하는 단계를 포함하는 장류 유해 미생물 제어 방법 및 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 유해미생물에 대한 항균용 조성물에 관한 것이다.

한국의 장류 식품인 청국장, 된장 및 간장은 우리 조상으로부터 수백년 동안 섭취해온 음식으로서 특별한 부작용이 없는 식품이며, 항산화 효과, 혈전용해 효과, 혈압강하 효과 등을 유발하는 각종 유익한 생리활성 물질들이 포함된 것으로 알려져 있다.

전통 방식에 의해 제조하는 장류는 필연적으로 자연 환경에 노출되는 상태로 발효가 이루어지기 때문에 발효나 숙성과정 동안 토양이나 대기의 유해 미생물들에 의해 독소들이 생성될 가능성이 높다. 장의 발효에 관여하는 주된 미생물 중의 하나는 바실러스(Bacillus) 속이다. 세균으로서 바실러스 서브그룹(Bacillus subgroup) 1에 속하는 바실러스 마이코이드(B. mycoides ), 바실러스 튜린지엔시스(B. thuringiensis), 바실러스 안트라시스(B. anthracis) 또는 바실러스 세레우스(B. cereus)는 유해균으로 알려져 있다. 특히 바실러스 세레우스는 HBL(haemolysin BL), NHE(non-hemolytic enterotoxin) 또는 cytK(cytotoxin K)와 같은 설사나 장염을 일으키는 단백질을 생산할 수 있다. 또한, 식품에 오염된 바실러스 세레우스 균이 증식하여 생산한 독소(cereulide) 및 구토를 일으키는 펩티드 형태의 안트락스(anthrax)와 유사한 호흡 질환을 유발하는 세트락스(certhrax)를 생산한다.

바이오제닉 아민(biogenic amine)은 아미노산의 탈탄산 작용, 아미노기 전이작용 등의 화학적 작용에 의해 주로 생성되는 질소화합물로서, 단백질 함유 식품 내에서 미생물 또는 생화학적 활성에 의해 발생된다.

대표적인 바이오제닉 아민으로는 퓨트레신(putrescine), 히스타민(histamine), 티라민(tyramine), 카다베린(cadaverine), 스퍼미딘(spermidine) 및 세로토닌(serotonin) 등이 있다. 바이오제닉 아민은 체내에서 신경전달 물질로 직·간접적으로 작용하고 혈압조절 및 혈류 등의 심혈관계 질환에도 영향을 미치므로, 바이오제닉 아민 함유 식품의 섭취로 여러가지 약리적인 현상이 나타날 수 있다. 이들 중 인체의 분해 한도를 넘어서는 히스타민(histamine) 및 티라민(tyramine)을 식품에서 섭취하는 경우에는 발진, 국소적 피부염증, 알레르기, 구토, 오심, 설사 등의 증상을 유발한다. 또한, 바이오제닉 아민에 의해 혈관 수축 및 심박 활동이 증가되어 혈압 상승을 유발하고, 동공과 눈꺼풀 조직을 확장시켜 눈물의 분비를 촉진하고, 타액의 과다분비, 호흡 증가 및 혈당 상승을 가져오며 편두통을 유발하기도 하는 것으로 보고되었다.

앞으로 전통 장류의 지향점은 전통적인 장류의 맛과 풍미는 유지하되 발효 미생물 제어를 통한 식품 위생상의 안전성을 동시에 확보할 수 있어야 한다. 이를 위해 발효 동안 유해 균주들의 증식을 억제하며, 바이오제닉 아민을 생산하지 않고 동시에 분해도 가능한 발효 균주의 선발은 필수적이다.

한편, 한국등록특허 제0506721호에는 '바실러스 리케니포미스 N1 및 이를 포함하는 식물병원성 진균 방제용 미생물 제제'가 개시되어 있으나, 본 발명의 '바이오제닉 아민은 생산하지 않고, 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있는 바실러스 서틸리스 SCJ1 균주 및 이의 용도'에 대해서는 개시된 바가 전혀 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 전통 장류에서 유해 미생물에 대해 항균 활성을 지니고, 바이오제닉 아민을 생산하지 않는 새로운 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCJ1 균주를 분리하였다. 또한, 상기 균주는 프로테아제 효소를 분비하고, 항산화활성이 우수하므로, 품질 좋은 장류 제조를 위한 스타터 균주로 기존의 균주보다 훨씬 효과적임을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 전통발효식품으로부터 분리된, 유해 미생물에 대한 항균 활성 및 항산화 활성이 있고, 바이오제닉 아민(biogenic amine)을 생산하지 않으면서, 프로테아제 효소를 분비하는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCJ1 균주(KCCM11568P)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주를 포함하는 식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 스타터 균주로 이용하여 장류를 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 장류 제조용 미생물 제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 균주 또는 이의 배양액을 장류에 처리하는 단계를 포함하는 장류 유해 미생물 제어 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 유해미생물에 대한 항균용 조성물을 제공한다.

본 발명의 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCJ1 균주는 유해 미생물에 대한 항균 활성 및 항산화 활성이 있고, 바이오제닉 아민을 생산하지 않으면서, 프로테아제 효소를 분비하므로, 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 유해미생물에 대한 항균용 조성물은 식품, 식품 첨가제, 사료 첨가제 또는 의약품으로 매우 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 바실러스 서틸리스 SCJ1 균주는 장류의 발효 과정 동안 바이오제닉 아민을 분비하지 않으면서, 유해 미생물의 증식을 억제할 수 있으므로, 상기 균주를 이용하여 독성이 없는 안전한 장류 식품 생산 효과를 가져올 수 있으므로, 산업적으로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.

도 1은 본 발명에 이용된 균주들의 바이오제닉 아민 생성여부를 확인한 결과이다. J1은 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCJ1을 나타낸다.
도 2는 본 발명에 이용된 균주들의 항산화 활성 분석 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명에서 선별된 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCJ1 균주의 균체 성장 및 항산화 활성을 배양 시간별로 조사한 결과이다(●, O.D 값; ○, 세포 건중량; ▲, 항산화 활성).

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 전통발효식품으로부터 분리된, 유해 미생물에 대한 항균 활성 및 항산화 활성이 있고, 바이오제닉 아민(biogenic amine)을 생산하지 않으면서, 프로테아제 효소를 분비하는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCJ1 균주(KCCM11568P)를 제공한다.

"항균 (antimicrobial)"의 의미는 어떤 농도에서 미생물의 성장 또는 생존을 감소, 방지, 억제, 또는 제거하는 능력을 의미한다.

본 발명의 "포함하는 (comprising)" 용어는 함유하는 것에 한정되지 않으며, 일예로 다른 첨가제, 성분, 지수 또는 단계와 같은 것을 제외하지 않는다.

본 발명에서 메주, 된장 및 고추장의 장류로부터 균주를 분리하였고, 그 중 유해미생물인 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) 및 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대해 항균 활성이 뛰어난 균주 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) 균주를 확인하였으며, 이를 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCJ1 균주(KCCM11568P)로 동정하였다.

또한, 본 발명은 상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCJ1 균주를 포함하는 식품을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식품에서, 상기 식품은 장류일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 구현 예에 따른 식품에서, 상기 장류는 메주, 한식된장, 된장, 조미된장, 고추장, 조미고추장, 춘장, 청국장, 혼합장, 한식간장, 양조간장 및 혼합간장으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCJ1 균주 또는 이의 배양액을 스타터(starter) 균주로 이용하여 장류를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 장류 제조용 스타터(starter)란 장류 제조를 위해 발효에 관여하는 미생물을 포함하는 제제 또는 조성물을 의미한다. 장류 제조 시에 첨가함으로써 발효된 장류에서 생장할 수 있는 미생물 또는 우점종으로 생장할 수 있는 미생물을 제공하기 위하여 사용된다. 상기 장류 발효용 스타터를 사용하여 장류를 제조하는 경우, 상기 장류 발효용 스타터에 포함된 미생물에 의하여, 장류의 품질을 일정하게 조절하거나, 특정한 목적, 일 예로 장류에서 이취를 발생시키지 않거나, 감소시키는 목적 또는 장류에서 구수한 맛이나 단맛을 강화시키기 위한 목적을 달성할 수 있다. 본 발명에서는 바실러스 서틸리스 SCJ1 균주 또는 이의 배양액을 스타터 균주로 이용함으로써, 바이오제닉 아민은 포함하지 않고, 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있으며, 더욱이 항산화 활성이 있고, 프로테아제를 포함하는 장류를 제조할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCJ1 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 장류 제조용 미생물 제제를 제공한다.

본 발명에 따른 장류 제조용 미생물 제제는 용액, 분말, 현탁액, 분산액, 에멀젼, 유성 분산액, 페이스트, 분진, 흩뿌림 물질 또는 과립제로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

또한, 본 발명은 상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCJ1 또는 이의 배양액을 장류에 처리하는 단계를 포함하는 장류 유해 미생물 제어 방법을 제공한다. 상기 장류 유해 미생물 제어는 본 발명의 바실러스 서틸리스 SCJ1 균주를 장류에 처리함으로써, 유해 미생물의 성장을 지연시키거나 저해시키는 것을 의미한다.

본 발명의 균주를 배양하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법에 따라 배양할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 항균용 조성물에서, 상기 유해미생물은 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) 또는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 항균용 조성물에서, 상기 조성물은 바람직하게는 식품, 식품 첨가제, 사료 첨가제 또는 의약품 형태일 수 있고, 상기 식품은 유제품(우유, 두유, 가공우유), 발효유(액상 요구르트, 호상 요구르트), 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCJ1 균주를 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 균주를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 균주는 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 바람직하게는 식품은 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCJ1 균주 균주를 함유하는 형태일 수 있으며, 또한 다른 식품의 첨가물로서도 이용될 수 있다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 식품은 기능성 식품을 포함할 수 있는데, 본 발명의 기능성 식품에는 상기 유효성분 외에도 필요에 따라 다양한 보조성분을 추가로 함유할 수 있다. 본 발명의 기능성 식품의 경우, 비타민 A, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B6, 비타민 B12, 엽산 (folic acid), 비타민 C, 비타민 D3, 비타민 E 등의 비타민류와, 구리, 칼슘, 철, 마그네슘, 칼륨, 아연 등의 미네랄 또는 유산균 등을 포함할 수 있다.

또한 본 발명의 기능성 식품 중, 건강음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 향미제로는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 들 수 있다. 천연 탄수화물로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토스, 수크로오스 등의 이당류, 덱스트린, 사이클로덱스트린 등의 다당류, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올류 등을 들 수 있다.

본 발명의 사료 첨가제는 기초사료에 일정 비율로 첨가하는 것이다. 상기 기초사료는 주성분이 옥수수, 대두박, 유청, 어분, 당밀, 소금, 비타민 프리믹스 및 미네랄 프리믹스 등으로 이루어질 수 있다. 비타민 프리믹스는 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 리보프라빈 및 나이아신으로 구성될 수 있으며, 미네랄 프리믹스는 망간, 철, 아연, 칼슘, 구리, 코발트 및 셀레니늄 등으로 구성될 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 의약품을 제공한다. 상기 의약품은 항균물질을 함유하고 있으므로 유해 세균에 의한 질환을 예방 또는 치료할 수 있다. 상기 균주는 바람직하게는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCJ1 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험 재료 및 방법

균주 분리 및 배양 조건

다양한 균주를 분리하기 위해 전라북도 순창군에서 전통적인 방법으로 제조한 메주, 된장, 고추장을 수거하여 실험에 사용하였다. 수거한 장류 1 g의 시료를 9 ㎖의 0.85% 멸균 생리식염수에 넣어 십진법으로 희석한 후 LB (트립톤 1%, 효모추출물 0.5%, 염화나트륨 0.5%) 고체 배지에 도말하여 30℃에서 24시간 배양하였다. 순수한 바실러스 서브틸리스 균주를 분리하기 위해 단일 콜로니를 분리하였고, LB 액체배지에서 30℃, 24시간 배양하였다. 선별한 균주를 대상으로 20%의 글리세롤을 포함한 LB 액체배지에 혼합하여 4℃에서 보관하였다. 보관 후 세포의 활성화는 LB 액체배지에서 30℃, 24시간 배양하여 활성화하여 사용하였다. 효소의 활성도 측정은 균체 배양액을 회수하여 12000 rpm, 4℃, 30분 원심분리 후 상등액을 회수한 후 0.45 ㎛ 막 필터(Sartorius, Frankfurt, Germany)로 제균하여 측정하였다.

바이오제닉 아민 생성여부 확인(정성분석)

바이오제닉 아민 생성여부의 정성분석은 다음과 같이 수행하였다. 하나의 순수한 바실러스 균주 콜로니를 1백금 취하여 바이오제닉 아민 생성 배지에 획선도말하였다. 바이오제닉 아민 생성을 확인하기 위한 배지로는 LB 배지에(1% 트립톤, 0.5% 효모추출물, 1% 염화나트륨, pH 5.0) 1.5% 한천과 0.25% 글리세롤, 0.006% 브로모크레솔퍼플, 0.1%의 히스티딘 또는 티라민을 첨가한 후 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 발색여부를 확인하였다. 대조구로 상기 배지에서 아미노산만을 첨가하지 않은 배지에서 동일하게 실험한 후 대조구로 사용하였다.

바이오제닉 아민 생성여부 확인(정량분석)

티라민, 히스타민은 HPLC를 이용하여 분석하였다. 분석을 위한 티라민, 히스타민, 티로신, 히스티딘 댄실염화물 및 1,7-디아미노헵탄은 시그마 알드리치(Sigma aldrich)사 제품을 구입하여 사용하였고, 프롤린, 에테르 및 염산은 삼천 화학 제품을 사용하였다. 아세토나이트릴과 물은 J.T. Baker 사 제품을 구입해 사용하였다. 표준용액은 0.1 노르말 염산에 녹여 약 1 g/L 되도록 제조한 후 0.1에서 100 mg/L의 농도로 2종의 표준 용액을 희석해 준비하였고, 분석을 통하여 검량곡선을 작성하였다. 바이오제닉 아민 분석의 생성 여부를 확인하기 위해 선별 균주를 티라민, 히스타민의 전구체인 티로신, 히스티딘이 각각 200 ppm이 함유된 LB 액체배지에 접종한 후 30℃에서 24시간 배양하였고, 배양액을 분석에 활용하였다. 배양액과 표준용액을 각각 시험관에 0.5 ㎖씩 취한 후 1,7 디아미노헵탄 (0.1g/L) 0.25 ㎖씩 첨가하였다. 포화탄산나트륨용액 0.25 ㎖와 1% 댄실염화물 아세톤 용액 0.4 ㎖를 추가하여 혼합한 후 마개를 하여 45℃에서 1시간 동안 유도체화하였다. 유도체화 후 10% 프롤린 용액 0.25 ㎖를 가하여 과잉의 댄실염화물을 제거하고, 시험관에 에테르 2.5 ㎖를 가하여 3분간 진탕한 후 상등액을 취하여 이를 질소농축기에서 완전히 증발시킨 후 잔사를 아세토나이트릴 0.5 ㎖에 녹이고 0.45 ㎕ 필터로 여과한 후 HPLC를 이용하여 분석하였다. 분석조건은 표 1과 같다.

본 발명의 균주를 대상으로 수행한 바이오제닉 아민, 알코올, 당 분석을 위한 HPLC 기기 분석 조건

바이오제닉 아민 분석을 위한 HPLC 분석 조건
Instrument	Agilent 1200 series (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)
Column	CapcellPak C18 Column
Detector	DAD detector (254 nm)
Mobile phase	A: 0.1% formic acid in H₂O
	B: 0.1% formic acid in ACN
Gradient condition	A:B = 45:55, 0~10 min
	A:B = 35:65, 10~15 min
	A:B = 20:80, 15~20 min
	A:B = 10:90, 20~30 min
	A:B = 10:90, 40 min over
Flow rate	1.0 ㎖/min
Temperature	40℃
Injection volume	20 μL

세포외 효소의 활성 측정

선별 균주가 균체 외로 방출하는 세포외 효소들 중 셀룰라제와 프로테아제의 활성을 균주별로 선별하기 위하여 각 효소와 특이적으로 반응할 기질 성분이 포함된 고체평판 배지를 각각 제조하였다.

단백질 분해효소(protease)의 활성을 조사하기 위해 스킴 밀크(skim milk)를 기질로 선택하였다. 2%의 스킴 밀크(Becton Dickinson & Co., Franklin Lakes, NJ.)에 1.5%의 한천을 첨가하여 121℃에서 15분 멸균 후 페트리디쉬(90×15 mm, SPL Life science, Korea)에 20 ㎖씩 분주하여 스킴 밀크 아가를 제조하였다. 각 균주의 상등액을 0.45 ㎛ 막 필터(Sartorius, Frankfurt, Germany)로 제균한 뒤 100 ㎕를 직경 8 mm의 준비한 웰에 가하였다. 효소의 활성이 검증되는 25℃에서 12시간 활성화한 후 스킴 밀크의 분해능을 저지원(clear zone)의 직경으로 조사하였다.

섬유소 분해효소(cellulase)의 활성을 조사하기 위해CMC(carboxymethylcellulose)를 기질로 선택하였다. 증류수 1L에 1% CMC에 1.5%의 한천을 첨가하여 121℃에서 15분 멸균 후 페트리디쉬(90×15 mm, SPL Life science, Korea)에 20 ㎖씩 분주하여 CMC 아가 플레이트를 제조하였다. 각 균주의 상등액을 0.45 ㎛ 막 필터(Sartorius, Frankfurt, Germany)로 제균한 뒤 100 ㎕를 직경 8 mm의 준비한 웰에 가하였다. 효소의 활성이 검증되는 25℃에서 12시간 활성화한 후 1M 염화나트륨 용액으로 콩고 레드 용액을 세척한 뒤 활성을 저지원(clear zone)의 직경으로 조사하였다. 활성 검증을 위한 시료로는 바실러스 서틸리스 SCJ1 균주를 LB와 TSB 배지에서 각각 배양한 후 제균한 상등액을 이용하여 실시하여 각 배지에서의 활성 정도 차이를 비교하였다.

항균활성

선별한 균주의 항균활성을 평가하기 위해 그람 음성균으로 에스케리키아 콜라이 KCCM11596, 에스케리키아 콜라이 KCTC2443, 살모넬라 티피뮤리움 KCTC1926, 살모넬라 엔테리티디스 KCCM40763, 쉬겔라 플렉스네리 KCCM40948, 쉬겔라 손네이 KCTC2518, 그람 양성균으로 바실러스 세레우스 KCTC1661, 바실러스 세레우스 KCTC3624, 마이크로코커스 루테우스 KCTC1056, 스타필로코커스 아우레우스 KCCM41446, 리스테리아 모노시토게네스 KCCM40307, 리스테리아 모노시토게네스 KCTC3710, 리스테리아 이바노비 KCTC3444를 사용하였다. 먼저 항세균 활성의 평가를 위하여 NB(Becton Dickinson & Co., Franklin Lakes, NJ.) 배지에서, BHI(Becton Dickinson & Co., Franklin Lakes, NJ.) 배지에서, TSA(Oxoid CM0129, UK.) 배지에서 37℃에서 24시간 배양한 후, 각 균주를 각 배지를 포함하는 멸균 페트리디쉬 (90×15 mm, SPL Life science, Korea)에 100 ㎕를 0.7% 부드러운 아가에 접종하여 중층한 후 구멍을 뚫어 웰을 준비하였다. 분리 균주의 배양액은 0.45 ㎛ 막 필터(Sartorius, Frankfurt, Germany)로 제균한 뒤 100 ㎕를 준비한 웰에 가하였다. 30℃에서 24시간 배양하여 생육 저지환의 생성을 확인하였으며 항균활성의 정도는 배양 후 생성된 저지환의 크기를 측정하여 나타내었다.

본 발명에 이용된 균주들의 항균활성

균주명	배양 배지	균주 번호
1. Micrococcus luteus	NB	KCTC 1056
2. Escherichia coli	NB	KCCM 11596
3. Escherichia coli	NB	KCTC 2443
4. Salmonella choleraesuis subsp. choleraesuis	NB	KCCM 40763
5. Salmonella typhimurium	NB	KCTC 1926
6. Listeria monocytogenes	BHI	KCCM 40307
7. Listeria monocytogenes	BHI	KCTC 3710
8. Listeria ivanovii subsp. ivanovii	BHI	KCTC 3444
9. Shigella flexneri	NB	KCCM 40948
10. Shigella sonnei	NB	KCTC 2518
11. Staphyloccus aureus subsp. aureus	TSB	KCCM 41446
12. Bacillus cereus	NB	KCTC 1661
13. Bacillus cereus	TSB	KCTC 3624

항산화 활성

선별한 균주에 대한 항산화 활성의 측정은 다음과 같이 수행하였다. 100 uM DPPH 에탄올 용액 1 ㎖에 200 ㎕의 배양 상등액을 가한다. 대조구로 배양 배지만을 첨가한 실험구를 사용하며, 반응 산물은 30분 동안 실온에서 반응 후 528㎚에서 자외선/가시광선 분광광도계(UV/VIS spectrophotometer, SPECORD 200, Analytic jeca)로 흡광도를 측정하여 아래 식에 따라 항산화 활성의 정도를 측정하였다.

항산화 활성 (%) = [1-(샘플 흡광도(528 nm))/(대조구 흡광도(528 nm))]×100

균주의 동정

최종적으로 선별된 균주를 동정하기 위해 API 50 CHB (Biomerieux Co., France) 세균 확인 키트를 이용하여 생화학적 특성을 분석하였고, 16S rRNA 염기서열 분석을 통해 최종 동정하였다.

선별 균주의 균체 성장 조사

건조 균체량 조사를 위해 10 ㎖의 배양액은 13,000 rpm에서 30분간 원심분리 한 후 증류수에 3회 세척하여 80℃에서 항량에 도달할 때까지 건조한 무게를 측정하였다. 또한 흡광도의 조사를 위하여 배양액 1 ㎖을 회수하여 13,000 rpm에서 30분간 원심분리한 후 증류수에 3회 세척하고 멸균 증류수 1 ㎖에 재부유하여 600 nm에서 자외선/가시광선 분광광도계(UV/VIS spectrophotometer, SPECORD 200, Analytic Jena) 흡광도를 측정하여 기록하였다.

실시예 1. 전통 장류로부터 균주의 분리

다양한 효소활성 및 항균활성과 항산화 활성을 갖는 바실러스를 선별하기 위하여 전라북도 순창군에서 전통적인 방법으로 제조한 메주, 된장, 고추장을 수거하여 실험에 사용하였다. 메주, 된장, 고추장 시료 약 200종으로부터 약 600종의 분리주를 확보하였으며, 이를 대상으로 하여 분리한 균주는 4℃에서 보관한 뒤 다음 실험에 이용하였다.

실시예 2. 바이오제닉 아민 생성여부 확인(정성분석)

선별한 분리주를 대상으로 하여 정성분석을 통한 바이오제닉 아민 생성 여부를 조사하였다. 그 결과 선별한 분리주 600종 중 약 200종의 분리주가 바이오제닉 아민을 생성하지 않음을 확인하였으며, 특히, 도 1에서 보이는 바와 같이 J1 균주가 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 것을 확인할 수 있었다. 바이오제닉 아민 비생성 분리주를 대상으로 하여 세포외 효소의 활성 및 항균활성과 항산화 활성을 조사하였다.

실시예 3. 바이오제닉 아민 생성여부 확인(정량분석)

식품에 바이오제닉 아민이 존재할 경우 바이오제닉 아민은 매스꺼움, 구토, 고혈압, 두통과 같은 증상을 발생할 수 있다고 연구결과가 보고되기도 하였다. 바이오제닉 아민의 분포도 조사를 한 결과 한국인의 주된 식재료인 간장에서 히스타민은 158 mg/kg, 티라민은 172 mg/kg 검출되었고, 된장에서는 히스타민은 260.1-952 (평균 569.4) mg/kg, 티라민은 284.4-1430.7 (평균 669.5) mg/kg으로 한국인들이 주로 섭취하는 34종의 식품 가운데 평균적으로 가장 높았다. 그러므로 본 발명자는 분리한 균주의 바이오제닉 아민의 생성 여부를 확인하고, 분리한 균주를 스타터로 장류에 재사용할 수 있는 균주를 분리하는데 목표를 두고 조사를 실시하였다.

그러므로 앞서 조사한 정성분석을 기반으로 하여 선별된 분리주를 대상으로 정량 분석을 실시한 결과 대부분의 분리주에서 정성분석과 동일한 결과값을 확인하였고, 일부 분리주에서 정성에서는 측정되지 않았던 티라민이나 히스타민이 일부 검출되었지만 정량을 할 수 있는 정도의 수치는 나타내지 않아 다음 실험을 실시하였다.

실시예 4. 세포외 효소의 활성측정

각종 유기물 분해능의 검정을 위하여 프로테아제, 셀룰라아제, 아밀라제를 대상으로 효소활성을 측정하였다. 각각의 스킴밀크, CMC(carboxymethyl cellulose), 녹말(starch) 배지를 살균한 후, 배지가 완전히 굳은 다음 바실러스 서틸리스 SCJ1를 배양한 배양액을 웰 확산 방법을 이용하여 실시하였다. 각종 효소의 활성이 검증되는 25℃에서 12시간 활성화한 후 스킴밀크, CMC, 녹말의 분해능을 저지원(clear zone)의 직경으로 조사하였다.

아래 표 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 바실러스 서틸리스 SCJ1 균주는 프로테아제 활성도에서는 두 종류의 배지에서 큰 차이를 보이지 않았으나 셀룰라아제의 경우 LB에서 더 좋은 활성도를 보였으며, 단백질분해효소가 가장 우수한 균주임을 확인하였다.

본 발명의 균주를 대상으로 측정한 세포외 효소의 활성

효소 활성	활성정도(LB 배지)	활성정도(TSB 배지)
Protease	15 mm	13 mm
Cellulase	8 mm	weak
Amylase	-	weak

실시예 5. 바실러스 서틸리스 SCJ1 균주의 항균활성

리스테리아 모노시토게네스 (Listeria monocytogenes, 한국미생물보존센터, KCCM 40307), 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium, 한국생명공학연구원 생물자원센터, KCTC 1926) 등 다양한 병원성 균이 접종된 준비해 놓은 고체 배지의 구멍(hole) 안에 상기 바실러스 서틸리스 SCJ1의 배양 상등액을 100 ㎕씩 분주하여 지시 균주의 최적 배양 온도에서 배양하여 NB 플레이트 상에 억제환 생성 여부를 관찰함으로써 항균 활성을 확인하였다. 그 결과 아래 표 4에서처럼 바실러스 서틸리스 SCJ1은 살모넬라 티피뮤리움에서 가장 큰 활성을 보였으며, 바실러스 세레우스에서도 항균활성을 보였고, 그 외 병원성 균에서는 활성을 보이지 않았다.

바실러스 서틸리스 SCJ1 균주의 항균활성

지시균주	바실러스 서틸리스 SCJ1 (억제환 지름, mm)
Salmonella typhimurium KCTC 1926	15
Bacillus cereus KCTC 3624	11

실시예 6. 바실러스 서틸리스 SCJ1 균주의 항산화 활성

본 발명의 전통 발효 식품으로부터 분리한 분리주 중 바이오제닉 아민 비생성 및 항균과 효소활성을 갖는 선별된 분리주의 항산화 효과 측정은 DPPH에 의한 자유 라디칼 제거(free radical scavenging) 효과를 측정하여 확인하였다. DPPH를 이용하여 선별주의 항산화 효과를 측정한 결과는 도 2와 같으며, 다양한 식품 및 사료 등 발효에 관여하는 바실러스 서틸리스들이 항산화 활성을 지님으로써 이러한 응용분야 특히 발효식품의 항산화 및 항노화 효과를 더욱더 증진시킬 수 있는 중요한 자료로 활용될 수 있을 것으로 분석되었다. 선별한 분리주 중 SCJ1는 다른 분리주와 비교하여 23.49%의 항산화 활성을 갖고 있어 항산화 활성이 가장 우수한 분리주로 사용가능하다.

실시예 7. 균주의 동정

선별균주 SCJ1의 동정을 위해 API 50 CHB (Biomerieux Co., France) 세균 확인 키트를 이용하여 생화학적 특성을 분석한 결과는 표 5와 같았고, 이를 표준 균주와 비교, 조사하여 동정하였다. API 키트을 이용하여 측정한 SCJ1는 바실러스 서틸리스로 분석되었다.

API 50 CHB 키트를 이용한 SCJ1의 동정 결과

Items	Result	Items	Result
Glycerol	+	Salicin	+
Erythritol	-	D-Cellobiose	+
D-Arabinose	-	D-Maltose	+
L-Arabinose	+	D-Lactose	-
D-Ribose	+	D-Melibiose	+
D-Xylose	-	D-Saccharose	+
L-Xylose	-	D-Trehalose	+
D-Adonitol	-	Inulin	+
Methyl-βD-xylopyranoside	+	D-Melezitose	-
D-Galactose	-	D-Raffinose	+
D-Glucose	+	Starch	+
D-Fructose	+	Glycogen	+
D-Mannose	+	Xylitol	-
L-Sorbose	-	Gentiobiose	+
L-Rhamnose	-	D-Turanose	-
Dulcitol	-	D-Lyxose	-
Inositol	+	D-Tagatose	-
D-Mannitol	+	D-Fucose	-
D-Sorbitol	+	L-Fucose	-
Methyl-αD-mannopyranoside	-	D-Arabitol	-
Methyl-αD-glucopyranoside	+	L-Arabitol	-
N-Acetyl glucosamine	-	Potassium gulconate	-
Amygdalin	+	Potassium 2-ketogluconate	-
Arbutin	+	Potassium 5-ketogluconate	-
Esculin	+

또한 16S rRNA 염기서열 분석을 통해 얻어진 서열번호 1의 염기서열을 이용하여 동정한 결과 API 50 CHB (Biomerieux Co., France) 세균 확인 키트와 동일한 바실러스 서틸리스로 동정되었다. 따라서, 앞서 정성 및 정량 분석을 실시한 결과 바이오제닉 아민을 생성하지 않으며 효소 활성 및 항균활성이 우수하고 항산화능이 우수한 상기 바실러스 서틸리스 SCJ1 균주를 2014. 09. 03자 한국미생물보존센터에 기탁번호 KCCM11568P로 기탁하였다.

실시예 8. 선별 균주의 균체 성장 조사

바실러스 서틸리스 SCJ1의 생장곡선을 알아보기 위하여 TSB 액체 배지에 접종하여 30℃에서 진탕 배양하여 4시간 간격으로 흡광도를 측정한 결과 4시간에서 24시간까지 대수기를 나타내었고, 28시간 이후 증식이 점차 느려서 28시간부터 정지기에 들어갔다. 또한 흡광도는 36시간에 가장 높은 1.4076 (O.D₆₀₀)을 나타냈지만 이미 정지기에 들어간 것과 건조균체량이 28시간에 1.5 g/L의 세포 성장을 보였으므로 이러한 결과를 바탕으로 최적 배양 시간을 대수기에서 정지기로 들어가는 28시간으로 정하였다.

또한 항산화 효과를 시간대별 조사한 결과 초기부터 배양 12시간까지 급격히 증가하여 12시간에 가장 높은 31.6435%의 항산화능을 나타내었고, 이후 감소하여 40시간 이후에는 약 4%의 항산화 효과를 유지하였다. 따라서 세포의 이용을 위한 경우 세포성장이 가장 우수한 28시간 배양하는 것이 효율적이며, 항산화 효과를 위한 목적의 경우 12시간 배양 후 종료하는 것이 가장 좋으며, 두 가지 모두 목적일 경우에는 24시간 이내에 배양을 종료하는 것이 효율적이다(도 3).

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11568P

20140903

<110> Microbial Institute for Fermentation Industry <120> Bacillus subtilis SCJ1 strain not producing biogenic amine and having antimicrobial activity against pathogenic microorganism and uses thereof <130> PN14273 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1262 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 1 gggtaacctg cctgtaagac tgggataact ccgggaaacc ggggctaata ccggatggtt 60 gtctgaaccg catggttcag acataaaagg tggcttcggc taccacttac agatggaccc 120 gcggcgcatt agctagttgg tgaggtaacg gctcaccaag gcgacgatgc gtagccgacc 180 tgagagggtg atcggccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc 240 agtagggaat cttccgcaat ggacgaaagt ctgacggagc aacgccgcgt gagtgatgaa 300 ggttttcgga tcgtaaagct ctgttgttag ggaagaacaa gtgccgttca aatagggcgg 360 caccttgacg gtacctaacc agaaagccac ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat 420 acgtaggtgg caagcgttgt ccggaattat tgggcgtaaa gggctcgcag gcggtttctt 480 aagtctgatg tgaaagcccc cggctcaacc ggggagggtc attggaaact ggggaacttg 540 agtgcagaag aggagagtgg aattccacgt gtagcggtga aatgcgtaga gatgtggagg 600 aacaccagtg gcgaaggcga ctctctggtc tgtaactgac gctgaggagc gaaagcgtgg 660 ggagcgaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgagt gctaagtgtt 720 agggggtttc cgccccttag tgctgcagct aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac 780 ggtcgcaaga ctgaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg 840 gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta ccaggtcttg acatcctctg acaatcctag 900 agataggacg tccccttcgg gggcagagtg acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt 960 gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgatctta gttgccagca 1020 ttcagttggg cactctaagg tgactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt 1080 caaatcatca tgccccttat gacctgggct acacacgtgc tacaatggac agaacaaagg 1140 gcagcgaaac cgcgaggtta agccaatccc acaaatctgt tctcagttcg gatcgcagtc 1200 tgcaactcga ctgcgtgaag ctggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga 1260 at 1262

Claims

장류로부터 분리된, 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) 또는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 항균 활성 및 항산화 활성이 있고, 히스타민(histamine) 또는 티라민(tyramine)을 생산하지 않으면서, 프로테아제 효소를 분비하는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCJ1 균주(KCCM11568P).
제1항의 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCJ1 균주 또는 이의 배양액을 스타터(starter) 균주로 이용하여 장류를 제조하는 방법.
제1항의 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCJ1 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 장류 제조용 미생물 제제.
제1항의 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCJ1 균주 또는 이의 배양액을 장류에 처리하는 단계를 포함하는 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) 또는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 제어 방법.
제1항의 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCJ1 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) 또는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 항균용 조성물.