KR101811241B1 - 내산성, 내담즙성, 항산화 활성, 리파아제 저해활성 및 항균 활성이 있고, 바이오제닉 아민을 생산하지 않으면서, 프로테아제 및 아밀라제 효소를 분비하는 바실러스 서틸리스 scgb 180 균주 및 이의 용도 - Google Patents

내산성, 내담즙성, 항산화 활성, 리파아제 저해활성 및 항균 활성이 있고, 바이오제닉 아민을 생산하지 않으면서, 프로테아제 및 아밀라제 효소를 분비하는 바실러스 서틸리스 scgb 180 균주 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명의 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 180 균주는 내산성, 내담즙성, 항산화 활성, 췌장 리파아제 저해활성 및 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있고, 바이오제닉 아민을 생산하지 않으면서, 프로테아제 및 아밀라제 효소를 분비하므로, 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 유해미생물에 대한 항균용, 비만 예방 및 개선용 및 프로바이오틱 조성물은 식품, 식품 첨가제, 사료 첨가제 또는 의약품으로 매우 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 바실러스 서틸리스 SCGB 180 균주는 장류의 발효 과정 동안 바이오제닉 아민을 분비하지 않으면서, 유해 미생물의 증식을 억제할 수 있으므로, 상기 균주를 이용하여 독성이 없는 안전한 장류 식품 생산 효과를 가져올 수 있으므로, 산업적으로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.

Description

내산성, 내담즙성, 항산화 활성, 리파아제 저해활성 및 항균 활성이 있고, 바이오제닉 아민을 생산하지 않으면서, 프로테아제 및 아밀라제 효소를 분비하는 바실러스 서틸리스 SCGB 180 균주 및 이의 용도{Bacillus subtilis SCGB 180 strain having acid-resistance activity, bile acid-resistance activity, antioxidant activity and lipase inhibition activity and antimicrobial activity and not producing biogenic amine and secreting protease and amylase and uses thereof}
본 발명은 장류로부터 분리된, 내산성, 내담즙성, 항산화 활성, 췌장 리파아제 저해활성 및 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있고, 바이오제닉 아민을 생산하지 않으면서, 프로테아제 및 아밀라제 효소를 분비하는 바실러스 서틸리스 SCGB 180 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
바이오제닉 아민(biogenic amine)은 아미노산의 탈탄산 작용, 아미노기 전이작용 등의 화학적 작용에 의해 주로 생성되는 질소화합물로서, 단백질 함유 식품 내에서 미생물 또는 생화학적 활성에 의해 발생된다.
대표적인 바이오제닉 아민으로는 퓨트레신(putrescine), 히스타민(histamine), 티라민(tyramine), 카다베린(cadaverine), 스퍼미딘(spermidine) 및 세로토닌(serotonin) 등이 있다. 바이오제닉 아민은 체내에서 신경전달 물질로 직·간접적으로 작용하고 혈압조절 및 혈류 등의 심혈관계 질환에도 영향을 미치므로, 바이오제닉 아민 함유 식품의 섭취로 여러가지 약리적인 현상이 나타날 수 있다. 이들 중 인체의 분해 한도를 넘어서는 히스타민(histamine) 및 티라민(tyramine)을 식품에서 섭취하는 경우에는 발진, 국소적 피부염증, 알레르기, 구토, 오심, 설사 등의 증상을 유발한다. 또한, 바이오제닉 아민에 의해 혈관 수축 및 심박 활동이 증가되어 혈압 상승을 유발하고, 동공과 눈꺼풀 조직을 확장시켜 눈물의 분비를 촉진하고, 타액의 과다분비, 호흡 증가 및 혈당 상승을 가져오며 편두통을 유발하기도 하는 것으로 보고되었다.
한편, 장의 발효에 관여하는 주된 미생물 중의 하나는 바실러스(Bacillus) 속이다. 세균으로서 바실러스 서브그룹(Bacillus subgroup) 1에 속하는 바실러스 마이코이드(B. mycoides ), 바실러스 튜린지엔시스(B. thuringiensis), 바실러스 안트라시스(B. anthracis) 또는 바실러스 세레우스(B. cereus)는 유해균으로 알려져 있다. 특히 바실러스 세레우스는 HBL(haemolysin BL), NHE(non-hemolytic enterotoxin) 또는 cytK(cytotoxin K)와 같은 설사나 장염을 일으키는 단백질을 생산할 수 있다. 또한, 식품에 오염된 바실러스 세레우스 균이 증식하여 생산한 독소(cereulide) 및 구토를 일으키는 펩티드 형태의 안트락스(anthrax)와 유사한 호흡 질환을 유발하는 세트락스(certhrax)를 생산한다.
따라서, 앞으로 전통 장류의 지향점은 전통적인 장류의 맛과 풍미는 유지하되 발효 미생물 제어를 통한 식품 위생상의 안전성을 동시에 확보할 수 있어야 한다. 이를 위해 발효 동안 유해 균주들의 증식을 억제하며, 바이오제닉 아민을 생산하지 않고 동시에 분해도 가능한 발효 균주의 선발은 필수적이다.
한국등록특허 제1516588호에서는 '바이오제닉 아민 분해 활성이 있는 바실러스 속 균주 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이, '내산성, 내담즙성, 항산화 활성, 리파아제 저해활성 및 항균 활성이 있고, 바이오제닉 아민을 생산하지 않으면서, 프로테아제 및 아밀라제 효소를 분비하는 바실러스 서틸리스 SCGB 180 균주 및 이의 용도'에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 장류로부터 내산성, 내담즙성, 항산화 활성, 췌장 리파아제 저해활성 및 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있고, 바이오제닉 아민을 생산하지 않으면서, 프로테아제 및 아밀라제 효소를 분비하는 바실러스 서틸리스 SCGB 180 균주를 분리하였다.
본 발명의 바실러스 서틸리스 SCGB 180 균주는 항산화 활성, 췌장 리파아제 저해활성 및 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있고, 바이오제닉 아민을 생산하지 않으면서, 프로테아제 및 아밀라제 효소를 분비하는 특징을 모두 가지므로, 품질 좋은 장류 제조를 위한 스타터 균주로 기존의 균주보다 훨씬 효과적이며, 또한, 내산성 및 내담즙성을 가지고 있어 프로바이오틱 균주로도 매우 유용함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 장류로부터 분리된, 내산성, 내담즙성, 항산화 활성, 췌장 리파아제 저해활성 및 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있고, 바이오제닉 아민(biogenic amine)을 생산하지 않으면서, 프로테아제 및 아밀라제 효소를 분비하는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 180 균주(KCCM11901P)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 180 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 장류 제조용 스타터(starter) 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 180 균주 또는 이의 배양액을 장류에 처리하는 단계를 포함하는 장류 유해 미생물 제어 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 180 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 유해미생물에 대한 항균용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 180 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 180 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 프로바이오틱 조성물을 제공한다.
본 발명의 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 180 균주는 내산성, 내담즙성, 항산화 활성, 췌장 리파아제 저해활성 및 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있고, 바이오제닉 아민을 생산하지 않으면서, 프로테아제 및 아밀라제 효소를 분비하므로, 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 유해미생물에 대한 항균용, 비만 예방 및 개선용 및 프로바이오틱 조성물은 식품, 식품 첨가제, 사료 첨가제 또는 의약품으로 매우 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 바실러스 서틸리스 SCGB 180 균주는 장류의 발효 과정 동안 바이오제닉 아민을 분비하지 않으면서, 유해 미생물의 증식을 억제할 수 있으므로, 상기 균주를 이용하여 독성이 없는 안전한 장류 식품 생산 효과를 가져올 수 있으므로, 산업적으로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.
도 1은 본 발명에 이용된 균주들의 바이오제닉 아민 생성여부를 확인한 결과이다. SCGB 180은 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 180을 나타낸다.
도 2는 본 발명에서 분리한 SCGB 180 균주의 16S rRNA 염기서열을 토대로 하여 계통수(phylogenetic tree)를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에서 분리한 SCGB 180 균주의 16S rRNA 염기서열(서열번호 1)을 나타낸다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 장류로부터 분리된, 내산성, 내담즙성, 항산화 활성, 췌장 리파아제 저해활성 및 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있고, 바이오제닉 아민(biogenic amine)을 생산하지 않으면서, 프로테아제 및 아밀라제 효소를 분비하는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 180 균주(KCCM11901P)를 제공한다.
본 발명에서 고추장의 장류로부터 균주를 분리하였고, 그 중 유해미생물인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대해 항균 활성이 뛰어난 균주 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) 균주를 확인하였으며, 이를 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 180 균주로 동정하여 한국미생물보존센터(KCCM)에 2016년 9월 23일에 기탁하였다(기탁번호: KCCM11901P).
본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 바이오제닉 아민은 히스타민(histamine) 또는 티라민(tyramine)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
"항균 (antimicrobial)"의 의미는 어떤 농도에서 미생물의 성장 또는 생존을 감소, 방지, 억제, 또는 제거하는 능력을 의미한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 유해미생물은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 180 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 장류 제조용 스타터(starter) 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 장류 제조용 스타터(starter)란 장류 제조를 위해 발효에 관여하는 미생물을 포함하는 제제 또는 조성물을 의미한다. 장류 제조 시에 첨가함으로써 발효된 장류에서 생장할 수 있는 미생물 또는 우점종으로 생장할 수 있는 미생물을 제공하기 위하여 사용된다. 상기 장류 발효용 스타터를 사용하여 장류를 제조하는 경우, 상기 장류 발효용 스타터에 포함된 미생물에 의하여, 장류의 품질을 일정하게 조절하거나, 특정한 목적, 일 예로 장류에서 이취를 발생시키지 않거나, 감소시키는 목적 또는 장류에서 구수한 맛이나 단맛을 강화시키기 위한 목적을 달성할 수 있다. 본 발명에서는 바실러스 서틸리스 SCGB 180 균주 또는 이의 배양액을 스타터 균주로 이용함으로써, 바이오제닉 아민은 포함하지 않고, 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있으며, 더욱이 항산화 활성 및 췌장 리파아제 저해 활성이 있고, 프로테아제 및 아밀라제를 포함하는 장류를 제조할 수 있다.
본 발명의 균주를 배양하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법에 따라 배양할 수 있으며, 특별한 방법에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 균주를 배양하는 단계에서 얻어지는 상기 균주 또는 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 첨가제로 사용할 경우, 상기 균주 또는 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 그대로 첨가하거나 다른 첨가제를 함께 사용할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 180 또는 이의 배양액을 장류에 처리하는 단계를 포함하는 장류 유해 미생물 제어 방법을 제공한다. 상기 장류 유해 미생물 제어는 본 발명의 바실러스 서틸리스 SCGB 180 균주를 장류에 처리함으로써, 유해 미생물의 성장을 지연시키거나 저해시키는 것을 의미한다. 본 발명의 상기 유해미생물은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 균주를 배양하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법에 따라 배양할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 유해미생물에 대한 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 항균용 조성물에서, 상기 유해미생물은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 항균용 조성물에서, 상기 조성물은 바람직하게는 식품, 식품 첨가제, 사료 첨가제 또는 의약품 형태일 수 있고, 상기 식품은 유제품(우유, 두유, 가공우유), 발효유(액상 요구르트, 호상 요구르트), 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 180 균주를 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 균주를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 균주는 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 바람직하게는 식품은 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 180 균주를 함유하는 형태일 수 있으며, 또한 다른 식품의 첨가물로서도 이용될 수 있다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 식품은 기능성 식품을 포함할 수 있는데, 본 발명의 기능성 식품에는 상기 유효성분 외에도 필요에 따라 다양한 보조성분을 추가로 함유할 수 있다. 본 발명의 기능성 식품의 경우, 비타민 A, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B6, 비타민 B12, 엽산 (folic acid), 비타민 C, 비타민 D3, 비타민 E 등의 비타민류와, 구리, 칼슘, 철, 마그네슘, 칼륨, 아연 등의 미네랄 또는 유산균 등을 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 기능성 식품 중, 건강음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 향미제로는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 들 수 있다. 천연 탄수화물로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토스, 수크로오스 등의 이당류, 덱스트린, 사이클로덱스트린 등의 다당류, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올류 등을 들 수 있다.
본 발명의 사료 첨가제는 기초사료에 일정 비율로 첨가하는 것이다. 상기 기초사료는 주성분이 옥수수, 대두박, 유청, 어분, 당밀, 소금, 비타민 프리믹스 및 미네랄 프리믹스 등으로 이루어질 수 있다. 비타민 프리믹스는 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 리보프라빈 및 나이아신으로 구성될 수 있으며, 미네랄 프리믹스는 망간, 철, 아연, 칼슘, 구리, 코발트 및 셀레니늄 등으로 구성될 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 의약품을 제공한다. 상기 의약품은 항균물질을 함유하고 있으므로 유해 세균에 의한 질환을 예방 또는 치료할 수 있다. 상기 균주는 바람직하게는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 180 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 180 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 180 균주는 췌장 리파아제 저해활성을 가지는 것을 확인하였으므로, 상기 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 식품 섭취시 궁극적으로 항비만 효과를 가질 수 있게 한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 180 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 프로바이오틱 조성물을 제공한다.
본 발명의 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 180 또는 이의 배양액은 내산성 및 내담즙성이 우수한 효과를 나타내므로, 생균제로서 갖추어야 할 상기 조건을 모두 유의적으로 만족하므로, 생균제 조성물로 유용하게 사용될 수 있 다.
본 발명의 조성물은 통상적인 생균제 조성물 제조방법에 따라 제조될 수 있으며, 일반적으로, 동결건조되거나 캡슐화된 형태 또는 배양현탁액이거나 건조분말 형태일 수 있다. 또한, 주성분인 상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 180 균주 또는 이의 배양액의 유효량에 1종 또는 2종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 통상적인 담체 또는 1종 또는 2종 이상의 첨가제를 선택하여 통상적인 제형의 조성물로 제조할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
균주 분리 및 배양 조건
전라북도 순창군에서 전통적인 방법으로 제조한 고추장 시료를 수거하여 실험에 사용하였다. 수거한 고추장 1 g의 시료를 9 mL의 멸균 생리식염수(0.85% NaCl)에 넣어 십진법으로 희석한 후 LB (트립톤 1%, 효모추출물 0.5%, 염화나트륨 0.5%) 배지에 도말하여 30℃에서 24시간 배양하였다. 순수한 바실러스 서틸리스 균주를 분리하기 위해 단일 콜로니를 분리하였고, LB 액체배지에서 30℃, 24시간 배양하였다. 선별한 균주를 대상으로 20%의 글리세롤을 포함한 LB 액체배지에 혼합하여 4℃에서 보관하였다. 보관 후 세포의 활성화는 LB 액체배지에서 30℃, 24시간 배양하여 활성화하여 사용하였다. 효소의 활성도 측정은 균체 배양액을 12,000 rpm, 4℃, 30분 원심분리 후 상등액을 회수한 후 0.45 μm 맴브레인 필터(Sartorius, Frankfurt, Germany)로 제균하여 측정하였다.
바이오제닉 아민 생성여부 확인 (정성분석)
바이오제닉 아민 생성여부의 정성분석은 다음과 같이 수행하였다. 순수한 바실러스 균주 콜로니를 1백금 취하여 바이오제닉 아민 생성 배지에 획선 도말하였다. 바이오제닉 아민 생성을 확인하기 위한 배지로는 LB 배지(1% 트립톤, 0.5% 효모추출물, 1% 염화나트륨, pH 5.0)에 1.5% 한천과 0.25% 글리세롤, 0.006% 브로모크레졸 퍼플(bromocresol purple), 0.1%의 히스티딘 또는 티로신을 첨가한 후 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 발색여부를 확인하였다. 대조구로 상기 배지에서 아미노산만을 첨가하지 않은 배지에서 동일하게 실험한 후 대조구로 사용하였다.
바이오제닉 아민 생성여부 확인 (정량분석)
티라민, 히스타민의 정량 분석은 HPLC를 이용하여 분석하였다. 분석에 사용한 티라민, 히스타민, 티로신, 히스티딘 댄실염화물 및 1,7-디아미노헵탄은 시그마 알드리치(sigma aldrich)사 제품을 구입하여 사용하였고, 프롤린, 에테르 및 염산은 삼천 화학 제품을 사용하였다. 아세토나이트릴과 물은 J.T. Baker 사 제품을 구입해 사용하였다. 표준용액은 0.1 노르말 염산에 녹여 약 1 g/L 되도록 제조한 후 0.1에서 100 mg/L의 농도로 2종의 표준 용액을 희석해 준비하였고, 분석을 통하여 검량곡선을 작성하였다. 바이오제닉 아민 분석의 생성여부를 확인하기 위해 선별 균주를 티라민, 히스타민의 전구체인 티로신, 히스티딘이 각각 200 ppm이 함유된 LB 액체배지에 접종한 후 30℃에서 24시간 배양하였고, 배양액을 분석에 활용하였다. 배양액과 표준용액을 각각 시험관에 0.5 mL씩 취한 후 1,7-디아미노헵탄 (0.1g/L) 0.25 mL씩 첨가하였다. 포화탄산나트륨용액 0.25 ml와 1% 댄실염화물 아세톤 용액 0.4 mL를 추가하여 혼합한 후 마개를 하여 45℃에서 1시간 동안 유도체화 하였다. 유도체화 후 10% 프롤린 용액 0.25 mL를 가하여 과잉의 댄실염화물을 제거하고, 시험관에 에테르 2.5 mL를 가하여 3분간 진탕한 후 상등액을 취하여 이를 질소농축기에서 완전히 증발시킨 후 잔사를 아세토나이트릴 0.5 mL에 녹이고 0.45 ㎕ 필터로 여과한 후 HPLC를 이용하여 분석하였다. 분석조건은 아래 표와 같다.
바이오제닉 아민, 알코올, 당 분석을 위한 HPLC 기기 분석 조건
바이오제닉 아민 분석을 위한 HPLC 분석 조건
Instrument Agilent 1200 series
(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)
Column CapcellPak C18 Column
Detector DAD detector (254 μm)
Mobile phase A: 0.1% formic acid in H2O
B: 0.1% formic acid in ACN
Gradient condition A:B = 45:55, 0~10 min
A:B = 35:65, 10~15 min
A:B = 20:80, 15~20 min
A:B = 10:90, 20~30 min
A:B = 10:90, 40 min over
Flow rate 1.0 mL/min
Temperature 40℃
Injection volume 20 μL
세포외 효소의 활성측정(정성분석)
선별 균주가 균체 외로 방출하는 세포외 효소들 중 단백질, 섬유소, 전분 분해효소의 활성을 측정하기 위하여 각 효소와 특이적으로 반응할 기질 성분이 포함된 고체 평판배지를 각각 제조하였다. 분리한 미생물의 각 배양 상등액을 0.45 μm 맴브레인 필터(Sartorius, Frankfurt, Germany)로 제균한 뒤 100 ㎕씩을 8 mm의 준비한 웰에 접종하여 25℃에서 24시간 반응시킨 후 저지원의 크기를 측정하였다. 단백질 분해효소(protease)의 분비능은 2% 스킴 밀크 (DifcoTM, MI, USA)에 1.5% 한천(Junsei Chemical Co. Ltd., Tokyo, Japan)을 첨가하여 분리균의 배양 상등액을 접종한 후 저지환의 크기를 관찰하였고, 섬유소 분해효소(cellulase)의 활성은 1% CMC(carboxylmethyl cellulose, Junsei Chemical Co. Ltd., Tokyo, Japan)에 1.5% 한천을 첨가하여 분리균의 배양 상등액을 접종하고 0.1% 콩고레드 (Sigma-aldrich, MO, USA)로 염색하고, 1M NaCl로 세척한 뒤 저지원의 크기를 관찰하였다. 또한 전분분해효소(amylase)의 활성은 전분(starch)을 기질로 사용하여 1%의 가용성 전분 (Junsei chemical Co. Ltd., Tokyo, Japan)를 함유한 전분 배지에 각 선별한 균주의 배양 상등액을 상기 방법과 동일하게 제균하고 100 ㎕씩을 준비한 웰에 분주하고 25℃에서 24시간 반응시킨 후 Lugol solution (Sigma-aldrich, MO, USA)으로 염색한 뒤 분해능을 저지원의 직경의 크기를 관찰하여 측정하였다.
식중독 관련 유해병원성 미생물에 대한 항균력 확인
식품을 부패 또는 오염시켜 식중독을 유발하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)와 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대한 항균 활성을 측정하였다. 항균 활성의 측정을 위해 바실러스 세레우스 KCTC3624는 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)로부터, 바실러스 세레우스 KCCM 40935 및 스타필로코커스 아우레우스 KCCM 11593은 한국미생물보존센터(KCCM)으로부터 분양받아 지시균주로 사용하였다. 측정 방법은 웰 확산 방법을 이용하였으며, 각 지시균주의 배양액(3.0×105)을 0.8% 한천을 함유한 enriched nutrient broth (NB) soft 배지에 첨가하여 평판배지를 제작한 후 선별 균주의 배양 상등액 100 ㎕을 well에 분주하여 배양 상등액이 시험 평판배지에 확산되게 한 후 지시균주의 생육 최적 온도에서 18시간 이상 배양하여 저해환의 크기를 측정하여 항균력을 측정하였다.
항산화 활성
선별한 균주의 DPPH법에 의한 전자 공여능의 측정은 DPPH(2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl)의 방법을 따라 실험하였다. 100 μM DPPH 에탄올 용액 1mL에 200 μL의 배양 상등액을 가한다. 대조구로 배양 배지만을 첨가한 실험구를 사용하며, 반응 산물은 30분 동안 실온에서 반응 후 528㎚에서 자외선/가시광선 분광광도계(UV/VIS spectrophotometer, SPECORD 200, Analytic jeca)로 흡광도를 측정하여 아래 식에 따라 항산화 활성의 정도를 측정하였다.
Antioxidant activity (%) = [1-(Abs528 nm of sample)/(Abs528 nm of control)]×100
항비만 활성 측정
분리주의 항비만 활성 분석을 위해 췌장 리파아제(pancreatic lipase)　저해 활성 분석을 측정하였다. 35g의　spirit blue agar 배지(Difco)를 1L 증류수에 녹여 멸균시킨 후, 배지의 온도가 약　55℃가 되었을 때, 30㎖의　리파아제 시약을 혼합하였고,　배지　25㎖씩　플레이트에 분주하여 평판배지를 제조하였다.　상기 평판배지에 균주 배양 상등액　100㎕를 접종하여　37℃에서　72시간 동안 배양한 후 리파아제 저해 활성을 확인하였다.
내산성 및 내담즙성 분석
pH 및 담즙산염에 대한 내성 효과를 알아보기 위하여 균주를 LB 액체배지에서 37℃에서 18시간 배양하여 실험을 진행하였다. 내산성 분석을 위해 LB 액체배지에서 37℃에서 18시간 배양액을 HCl과 NaOH를 이용하여 각각 pH 2.0과 7.0으로 조절한 후 37℃에서 3시간 진탕배양하였다. 배양액을 0.85% 멸균 생리식염수로 연속 희석하여 100㎕씩 LB 고체배지에 도말하고 37℃에서 18시간 배양하여 생균수를 측정하였다. pH 조절 전 생균수를 대조구로 생존률을 확인하여 내산성 정도를 확인하였다. 내답즙성 분석은 LB 액체배지에서 37℃에서 18시간 배양액에 oxgall을 0, 0.3, 0.6% 첨가하여 37℃에서 3시간 진탕배양 후 배양액을 0.85% 멸균 생리식염수로 연속 희석하여 LB 고체배지에 도말하고 37℃에서 18시간 배양하여 생균수를 측정하였다. Oxgall 첨가 전 생균수를 대조구로 생존률을 확인하여 내답즙성 정도를 확인하였다.
최종 선별 균주의 동정
최종 선별 균주의 동정을 위해 균체는 한천 평판배지로부터 회수하였으며, 이들의 DNA는 ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep kit를 사용하여 추출하였다. 16S rRNA 유전자는 두 개의 알려진 유니버셜 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 두 유니버셜 프라이머의 염기서열은 다음과 같다. 먼저 정방향 프라이머는(27F) 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'(서열번호 2), 역방향 프라이머(1492R) 5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'(서열번호 3). PCR을 위한 각 반응의 조건은 다음과 같다. DNA의 변성 95℃ 1분, 어닐링 60℃ 1분, DNA 가닥의 합성 72℃에서 1분 또는 2분의 과정을 35회 반복하는 조건을 사용하였으며, 반응이 끝난 PCR 산물은 1% 아가로스 겔 (5 ㎕, X-gal 30 mg/ml)에서 전기영동 한 후 밴드를 확인한 후 증폭이 확인된 PCR 산물은 코스모진텍(주)에 의뢰하여 동정을 실시하였다.
최종 선별 균주의 바실러스 세레우스 ( Bacillus cereus ) 독소 유전자 분석을 통한 안전성 분석
최종 선별 균주의 식품내 안전성 여부를 확인하기 위해 바실러스 세레우스가 생성하는 6개의 설사형 독소와 구토형 독소 유전자를 보유하고 있는지를 확인하기 위해 PCR 방법을 이용하여 동정하였다. PCR (Veriti 96-well Thermal Cycler, Life technologies)은 코젠 바이오텍의 PowerChekTM Bacillus cereus Toxin 60 plex Detection kit을 사용하여 조사하였으며, CER, hblC, bceT, entFM, nheA, cytK 등 6개 독소 유전자를 대상으로 유전자 보유 여부를 조사하였다. 먼저 PCR 반응을 위한 혼합물은 코젠 바이오텍의 매뉴얼에 따라 실시하였으며, PCR 반응 조건은 1회 95℃ 10분, 35회(95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 30초)로 실시하였고, 72℃에서 10분간 post-extension을 실시하였다. 증폭을 통해 확보한 PCR 산물은 0.5% TAE 버퍼에 0.5 μg/mL SYBR green가 포함된 1.0% 아가로스겔로 전기영동한 후 UV transilluminator (Gel documentation, Bio-Rad)에서 밴드를 확인하여 독소 유전자의 보유 여부를 확인하였다.
실시예 1. 전통 고추장으로부터 미생물의 분리
전라북도 순창군에서 전통적으로 제조한 고추장 100 여종에서 바이오제닉 아민(BAs)을 생산하지 않으며 프로바이오틱스 활성을 가지는 바실러스 서틸리스를 분리하기 위하여 400종의 균주들을 순수 분리하였다. 분리된 균주들은 -80℃에서 보관하였으며, 이하 실험은 보관균주를 LB 액체배지에서 30℃, 24시간 배양하여 균주 활성화시켜 진행하였다.
실시예 2. 바이오제닉 아민 생성 여부 확인
바이오제닉 아민 비생산하는 균주를 선발하기 위하여 바이오제닉 아민 생성여부를 확인하였으며, 고체배지를 이용한 정성적인 방법과 HPLC 분석을 이용한 정량적인 방법을 사용하였다. 바이오제닉 아민 생성시 pH가 높아지는 점을 이용하여 전구체가 첨가되어 있지 않은 배지보다 각각의 전구체가 첨가되어 있는 LB-GLH 아가와 LB-GLT 아가에서 더 진한 보라색으로 확인되는 것을 바이오제닉 아민 생성균주라 정하고 대조구보다 더 진한 보라색이 아닌 210개 균주를 바이오제닉 아민 비생산 균주로 선발하였다. 정량적인 바이오제닉 아민 생성 여부를 확인하기 위하여 선발균주를 히스티딘과 티로신이 각 200ppm 함유된 액체배지에서 배양한 후 HPLC로 바이오제닉 아민 함량을 측정하였다. 바이오제닉 아민 함량을 확인한 결과 대부분의 균주가 정성적 분석의 결과와 동일하게 바이오제닉 아민이 검출되지 않는 것으로 확인되었고, SCGB 180 균주는 정성분석과 정량분석 결과 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 것으로 확인되었다(도 1).
실시예 2. 식중독 관련 유해병원성 미생물에 대한 길항 능력 확인
201개의 선발균주를 대상으로 식중독을 유발하는 유해병원성 미생물 바실러스 세레우스(B. cereus) 2종과 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus) 1종에 대해 웰 확산 방법을 이용하여 항균활성 능력을 확인하였다. 바실러스 세레우스 2종과 스타필로코커스 아우레우스 1종에서 3종 이상에 대해 항균활성을 보이는 97개 균주를 선발하였으며, SCGB 180 균주는 바실러스 세레우스 KCTC 3624, KCCM 40935, 스타필로코커스 아우레우스 KCCM 11593에 대해 높은 길항능력을 가짐을 확인하였다. SCGB 180 균주는 타 균주에 비하여 바실러스 세레우스 및 스타필로코커스 아우레우스 균주를 높은 수치로 억제하여 식중독 관련 유해병원성 미생물에 대한 길항능력이 우수함을 확인하였다.
분리주의 항균활성 측정 결과
Strains No. Antibacterial activity (diameter, mm)
Bacillus cereus KCTC 3624 Bacillus cereus
KCCM 40935		 Staphylococcus aureus
KCCM 11593
SCGB 175 13 10 -
SCGB 178 13 12 -
SCGB 180 17 16 15
-, 반응 없음
실시예 3. 세포 외 효소의 활성 측정
선발균주의 세포 외로 방출하는 프로테아제(protease), 셀룰라아제(cellulase) 및 아밀라제(amylase)에 대하여 고체배지를 이용한 정성적 방법으로 각각의 효소 활성을 측정하였다. 각각 스킴밀크, CMC, 전분이 첨가된 배지에 웰 확산 방법으로 배양 상층액을 처리하여 반응 후 각각의 유기물 분해하여 생기는 투명한 환의 직경을 측정함으로써 각각의 효소 활성을 확인하였다. SCGB 180 균주는 셀룰라아제 활성이 약하였으며, 프로테아제와 아밀라제 활성은 16mm 및 12mm로 높은 활성을 가지고 있는 것으로 확인되어 최적 배양조건과 배지조성을 맞춰준다면 식품제조 및 응용분야에서 단백질 분해와 전분 분해에 우수하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
프로테아제, 셀룰라아제 및 아밀라제 세포 외 효소 활성 측정
Strain no. 프로테아제
(mm, halo size)		 셀룰라아제
(mm, halo size)		 아밀라제
(mm, halo size)
SCGB 180 16 w 12
w, 약한 반응
실시예 4. 항산화 활성 측정
선발 균주의 항산화 활성을 확인하기 위하여 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 자유 라디컬 소거능을 측정하였다. 그 결과, SCGB 180 균주는 27.30%로 높은 자유 라디컬 소거능을 보여, 배양조건 및 배지조성의 최적화를 통하여 더 높은 항산화 활성을 가지는 균주로 사용할 수 있음을 확인하였다.
분리주의 항산화 활성(DPPH) 측정 결과
Strains No. Identification DPPH (%)
SCGB 180 Bacillus subtilis 27.30±0.56
실시예 5. 항비만 활성 측정
선발 균주의 항비만 능력을 확인하기 위해 췌장 리파아제 억제 활성을 확인한 결과,　SCGB 180　균주는　100%　췌장 리파아제를 억제하는 것으로 확인되어 항비만에 우수한 효과를 가지는 균주로 식품 및 응용분야에서 사용할 수 있을 것으로 확인하였다.
분리주의 항비만 활성 측정 결과
Strain no. Identification Pancreatic lipase inhibition (%)
SCGB 180 Bacillus subtilis 100
실시예 6. 내산성 및 내담즙성 확인
위액과 담즙에 대한 내성을 가지는 균주를 선발하기 위하여 선발 균주를 대상으로 내산성, 내담즙성 실험을 진행하였다. 위액의 낮은 pH에 의해 미생물이 사멸하므로 선발균주의 내산성 확인을 위하여 선발균주 배양 후 pH 7.0과 pH 2.0로 조절하여 pH 조절 전 생균 수 대비 선발 균주의 생존율을 확인하였다.
그 결과, 일부 균주는 pH 2.0에서 생존하지 못하였으며, SCGB 180 균주는 pH 2.0의 조건에서 3시간 동안 약 1.68%의 생존률로 일부 균주가 살아서 장으로 이동할 수 있을 것으로 확인되었다. 담즙산은 미생물의 세포막에 영향을 주어 미생물이 사멸하므로 내담즙성을 확인하기 위하여 선발균주 배양 후 0.3, 0.6% 담즙을 첨가하여 담즙 첨가 전 대비 선발균주의 생존율을 확인하였다. SCGB 180의 경우 0.3% 담즙 첨가 3시간 후 74%로 높은 생존률을 보였으며, 0.6% 담즙 첨가에도 27% 생존으로 내담즙성이 우수한 것으로 확인되었다. 97개 선발 균주 중 pH 2.0에서 생존률이 1% 이상이며, 0.6% 담즙 첨가시 생존률이 20% 이상인 우수한 내산성과 내담즙성을 가지는 균주 14개 균주를 선발하였다.
분리주의 내산성 및 내담즙성 측정 결과
No. Strains No. Survival rate (%)
pH 7.0 pH 2.0 담즙 0% 담즙 0.3% 담즙 0.6%
1 SCGB 1 100 0 100 46 16
2 SCGB 180 100 1.68 100 74 27
3 SCGB 574 100 1.56 100 9 4
실시예 7. 바실러스 세레우스 ( B. cereus ) 독소 유전자 보유 여부를 통한 안전성 확인
선발된 균주를 대상으로 식품 유해균주인 바실러스 세레우스의 설사형 독소 및 구토형 독소 유전자 보유 여부를 확인하여 식품 내 안전성을 확인하였다. PCR 분석을 통하여 바실러스 세레우스 독소 유전자 6개 보유 여부를 확인한 결과, 14개 균주 중 10개의 균주가 독소유전자를 전혀 가지고 있지 않은 것으로 확인되어 선발하였고 SCGB 180 균주 또한 6개 바실러스 세레우스 독소 유전자를 보유하지 않은 것으로 확인되어 식중독에 대한 안전성을 가짐을 확인할 수 있었다.
SCGB 180의 바실러스 세레우스 독소 유전자 분석 결과
Strain No. Identification
(16s rRNA seq ) 		PowerChek TM Bacillus cereus Toxin 6- plex Detection Kit
CytK nheA ent FM bceT hblC CER
SCGB 180 Bacillus subtilis ND ND ND ND ND ND
ND : 미검출(not detected)
실시예 8. 선발 균주의 동정
선발 균주의 동정을 위해 16S rRNA 유전자 염기서열을 해독하여 바실러스 타입 균주 16S rRNA 유전자 염기서열 비교분석 및 계통수를 통하여 확인한 결과, 식품의약품안전처 고시에 따라 식품에 사용할 수 있는 바실러스 서틸리스 균주로 4종이 확인되었으며, 바이오제닉 아민을 비생산하며 우수한 잠재적 프로바이틱스 특성과 식품 내 안전성을 가지는 SCGB 180 균주를 최종 선발하였다. SCGB 180 균주는 바실러스 서틸리스 DSM 10과 가장 유사성이 높게 나타났으며, 이를 최종적으로 바실러스 서틸리스 SCGB 180이라 명명하였고 한국미생물보존센터(KCCM, Korean Culture Center of Microorgaisms)에 KCCM 11901P(Bacillus subtilis SCGB 180)으로 기탁하였다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM11901P 20160923
<110> Microbial Institute for Fermentation Industry <120> Bacillus subtilis SCGB 180 strain having acid-resistance activity, bile acid-resistance activity, antioxidant activity and lipase inhibition activity and antimicrobial activity and not producing biogenic amine and secreting protease and amylase and uses thereof <130> PN16418 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1485 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 1 caggacgaac gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg agcggacaga tgggagcttg 60 ctccctgatg ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctgcct gtaagactgg 120 gataactccg ggaaaccggg gctaataccg gatggttgtt tgaaccgcat ggttcaaaca 180 taaaaggtgg cttcggctac cacttacaga tggacccgcg gcgcattagc tagttggtga 240 ggtaacggct caccaaggca acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg 300 ggactgagac acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga 360 cgaaagtctg acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggt tttcggatcg taaagctctg 420 ttgttaggga agaacaagta ccgttcgaat agggcggtac cttgacggta cctaaccaga 480 aagccacggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg 540 gaattattgg gcgtaaaggg ctcgcaggcg gtttcttaag tctgatgtga aagcccccgg 600 ctcaaccggg gagggtcatt ggaaactggg gaacttgagt gcagaagagg agagtggaat 660 tccacgtgta gcggtgaaat gcgtagagat gtggaggaac accagtggcg aaggcgactc 720 tctggtctgt aactgacgct gaggagcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc 780 tggtagtcca cgccgtaaac gatgagtgct aagtgttagg gggtttccgc cccttagtgc 840 tgcagctaac gcattaagca ctccgcctgg ggagtacggt cgcaagactg aaactcaaag 900 gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag 960 aaccttacca ggtcttgaca tcctctgaca atcctagaga taggacgtcc ccttcggggg 1020 cagagtgaca ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc 1080 ccgcaacgag cgcaaccctt gatcttagtt gccagcattc agttgggcac tctaaggtga 1140 ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac 1200 ctgggctaca cacgtgctac aatggacaga acaaagggca gcgaaaccgc gaggttaagc 1260 caatcccaca aatctgttct cagttcggat cgcagtctgc aactcgactg cgtgaagctg 1320 gaatcgctag taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac 1380 accgcccgtc acaccacgag agtttgtaac acccgaagtc ggtgaggtaa ccttttagga 1440 gccagccgcc gaaggtggga cagatgattg gggtgaagtc gtaag 1485 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tacggytacc ttgttacgac tt 22

Claims (6)

  1. 장류로부터 분리된, pH2~7에서 내산성, 0.3~0.6% 담즙에서 내담즙성, 항산화 활성, 췌장 리파아제 저해활성 및 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대한 항균 활성이 있고, 티라민 및 히스타민을 생산하지 않으면서, 프로테아제 및 아밀라제 효소를 분비하는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 180 균주(KCCM11901P).
  2. 제1항의 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 180 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 장류 제조용 스타터(starter) 조성물.
  3. 제1항의 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 180 균주 또는 이의 배양액을 장류에 처리하는 단계를 포함하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 제어 방법.
  4. 제1항의 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 180 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대한 항균용 조성물.
  5. 제1항의 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 180 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  6. 제1항의 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 180 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 프로바이오틱 조성물.
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KR102044365B1 (ko) * 2018-11-09 2019-11-13 재단법인 발효미생물산업진흥원 장 부착능이 우수하고, 항균 물질을 합성하는 유전자를 보유하며, 프로바이오틱스 특성을 가지는 바실러스 서틸리스 scdb 291 균주 및 이의 용도

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KR101201184B1 (ko) 2010-06-29 2012-11-13 몽고식품 주식회사 신규한 바실러스 서브틸리스 균주 및 이를 이용한 생균제제와 저 생물생성 아민-함유 식품
KR101516588B1 (ko) 2013-08-14 2015-05-04 재단법인 발효미생물산업진흥원 바이오제닉 아민 분해 활성이 있는 바실러스 속 균주 및 이의 용도

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