KR101549611B1

KR101549611B1 - 아밀라제 효소를 분비하고, 유해미생물에 대해 항균 활성을 갖는 바실러스 서틸리스 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101549611B1
Application number: KR1020130159231A
Authority: KR
Inventors: 정희경; 홍주헌; 최미옥; 정유석; 양수진; 이대훈
Original assignee: 대구가톨릭대학교산학협력단
Priority date: 2013-12-19
Filing date: 2013-12-19
Publication date: 2015-09-02
Also published as: KR20150072015A

Abstract

본 발명은 전통발효식품으로부터 분리된 아밀라제 효소를 분비하고, 유해미생물에 대해 항균 활성을 가지는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) CBD2 균주(기탁번호 KACC91904P) 또는 바실러스 서틸리스 KMKW4 균주(기탁번호 KACC91905P), 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 유해미생물에 대한 항균용 조성물, 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 프로바이오틱 조성물, 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 유해미생물에 대한 항균용 미생물 제제를 제조하는 방법 및 상기 균주 또는 이의 배양액을 유해미생물에 처리하여 유해미생물을 방제하는 방법을 제공한다.

Description

아밀라제 효소를 분비하고, 유해미생물에 대해 항균 활성을 갖는 바실러스 서틸리스 균주 및 이의 용도{Bacillus subtilis strain secreating amylase and having antimicrobial activity against harmful microorganism and uses thereof}

본 발명은 아밀라제 효소를 분비하고, 유해미생물에 대해 항균 활성을 갖는 바실러스 서틸리스 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 본 발명은 전통발효식품으로부터 분리된 아밀라제 효소를 분비하고, 유해미생물에 대해 항균 활성을 가지는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) CBD2 균주(기탁번호 KACC91904P) 또는 바실러스 서틸리스 KMKW4 균주(기탁번호 KACC91905P), 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 유해미생물에 대한 항균용 조성물, 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 프로바이오틱 조성물, 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 유해미생물에 대한 항균용 미생물 제제를 제조하는 방법 및 상기 균주 또는 이의 배양액을 유해미생물에 처리하여 유해미생물을 방제하는 방법을 제공한다.

삶이 윤택해지고 경제적으로 안정감을 얻으면서 건강 증진을 위하여 체내 자연 균총을 새롭게 형성하거나 면역계 활성 등을 위하여 프로바이오틱스(probiotics)라는 미생물 식품 보충제가 널리 사용되고 있다. 프로바이오틱 산업에 적용을 위한 미생물은 체내 산성에서 중성 및 염기성으로 pH 변화와 담낭 및 췌장액 등의 소화액에 대한 내성을 지녀야하며 장내 상피세포에 응집하여 체내의 점착성이 높아야 하고, 병원성 미생물에 대한 항균활성이 우수한 점 등 다양한 조건을 지니고 있어야 한다. 최근에는 김치, 메주, 간장, 젓갈 등 다양한 국내 발효식품에서 분리된 미생물을 프로바이오틱스로 적용하기 위한 다양한 연구가 이루어지고 있다.

우리나라 전통발효식품인 김치, 된장, 청국장 등에는 락토코커스 속, 락토바실러스 속, 바실러스 속 등 다양한 미생물이 존재하고 있다. 이들 중 바실러스 속은 알칼리나 중성의 환경 등에 따라 증식하는 종이 다르며, 오랜 기간 동안 연구에 의하여 식품이나 의약품, 발효산업 등 다양한 산업에서 안전성이 밝혀져 널리 사용되고 있다. 또한 아밀라제, 프로테아제와 글루카나아제 등을 생성하며, 항균 활성 물질을 생산하여 식중독균뿐만 아니라 위암의 원인이 되는 헬리코박터 파이로리에 대한 항균 활성을 지녀 프로바이오틱 산업에서 주목받는 소재이다. 미국이나 일본, 중국 등 해외에서는 이미 바실러스 속을 이용한 프로바이오틱 상품이 시판되고 있으나, 국내에서는 바실러스 속을 이용한 상품이 개발되어 있지 않으며 연구 또한 미비한 실정이다.

따라서 본 발명에서는 새로운 프로바이오틱스를 선발하고자 국내 전통발효식품으로부터 분리한 균주의 인공위액 및 담즙산에 대한 내성, 장내 상피세포에 대한 점착능과 병원성 미생물에 대한 항균활성 및 면역증강 및 아밀라제 효소 분비 수율에 대한 평가를 수행하여 프로바이오틱 산업용 미생물로서의 가능성을 탐색하였다.

한국등록특허 제0443254호에는 내산성, 내담즙성 및 항생제 내성을 갖는 락토바실러스 플란타룸이 개시되어 있고, 한국등록특허 제0464642호에는 락토바실러스 플란타룸 케이와이 1032이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 아밀라제 효소를 분비하고, 유해미생물에 대해 항균 활성을 갖는 바실러스 서틸리스 CBD2 균주 또는 바실러스 서틸리스 KMKW4 균주 및 이의 용도에 대해서는 밝혀진 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명자는 전통발효식품으로부터 분리된 바실러스 서틸리스 CBD2 균주 및 바실러스 서틸리스 KMKW4 균주가 아밀라제 효소를 분비하고, 유해미생물에 대해 항균 활성을 가지며, 내산성, 내담즙성 및 장 점막 점착성이 우수한 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 전통발효식품으로부터 분리된 아밀라제 효소를 분비하고, 유해미생물에 대해 항균 활성을 가지는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) CBD2 균주(기탁번호 KACC91904P) 또는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) KMKW4 균주(기탁번호 KACC91905P)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 유해미생물에 대한 항균용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 프로바이오틱 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 유해미생물에 대한 항균용 미생물 제제를 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유해미생물에 처리하여 유해미생물을 방제하는 방법을 제공한다.

본 발명의 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) CBD2 균주 또는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) KMKW4 균주는 아밀라제 효소를 분비하고, 유해미생물에 대해 항균력이 매우 우수하므로, 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 유해미생물에 대한 항균용 조성물은 식품, 식품 첨가제, 사료 첨가제 또는 의약품으로 매우 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 균주는 내산성, 내담즙성 및 장 점막 점착성이 우수하므로, 프로바이오틱스로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에서 분리한 바실러스 서틸리스 2종에 대한 pH 영향에 따른 생육도를 나타낸다.
도 2는 본 발명에서 분리한 바실러스 서틸리스 2종에 대한 염 농도에 따른 생육도를 나타낸다.
도 3은 본 발명에서 분리한 바실러스 서틸리스 2종에 대한 당 농도에 따른 생육도를 나타낸다.
도 4는 본 발명에서 분리한 바실러스 서틸리스 2종에 대한 아밀라제 효소 활성을 분석한 결과이다.
도 5는 본 발명에서 분리한 바실러스 서틸리스 4종에 대한 장내 점착성 실험을 HT-29 세포를 이용하여 수행한 결과이다.
도 6은 본 발명에서 분리한 바실러스 서틸리스 4종에 대한 면역증강 활성을 분석한 결과이다. 본 발명의 바실러스 서틸리스 4종을 열처리하여 얻은 균주 현탁액을 마우스 대식세포인 RAW264.7 세포와 함께 배양한 결과, 유도되는 산화질소의 대사산물인 NO의 양을 측정하여 나타내었다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 전통발효식품으로부터 분리된, 아밀라제 효소를 분비하고, 유해미생물에 대해 항균 활성을 갖는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) CBD2 균주 또는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) KMKW4 균주를 제공한다.

"항균 (antimicrobial)"의 의미는 어떤 농도에서 미생물의 성장 또는 생존을 감소, 방지, 억제, 또는 제거하는 능력을 의미한다.

본 발명의 "포함하는 (comprising)" 용어는 함유하는 것에 한정되지 않으며, 일예로 다른 첨가제, 성분, 지수 또는 단계와 같은 것을 제외하지 않는다.

본 발명에서 김치, 된장 및 청국장의 전통발효식품으로부터 균주 10종을 분리하였고, 그 중 유해미생물인 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 비브리오 파라헤모리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 쉬겔라 손네이(Shigella sonnei) 및 에스케리치아 콜라이 O157(Escherichia coli O157)에 대해 항균 활성이 뛰어난 균주 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) 균주를 확인하였으며, 이를 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) CBD2 균주로 동정하였고, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) 및 쉬겔라 손네이(Shigella sonnei)에 대해 항균 활성이 뛰어난 균주 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) 균주를 확인하였으며, 이를 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) KMKW4 균주로 동정하였다.

상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) CBD2 균주 또는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) KMKW4 균주는 또한, 내산성, 내담즙성을 나타내었고, 장 점막 점착성이 우수한 특성을 확인하였다.

또한, 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) CBD2 균주 또는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) KMKW4 균주의 적정 생육 조건은 pH 4.5~10.5, 2.5~3.5%(w/v) NaCl 및 5~18%(w/v) 글루코스가 포함된 조건일 수 있고, 바람직하게는 pH 7, 3%(w/v) NaCl 및 5%(w/v) 글루코스가 포함된 조건일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) CBD2 균주 또는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) KMKW4 균주를 국립농업과학원 농업유전자원센터에 2013년 11월 08일자로 기탁하였다 (바실러스 서틸리스 (Bacillus subtilis) CBD2 균주 기탁번호: KACC91904P, 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) KMKW4 균주 기탁번호: KACC91905P).

본 발명의 일 구현 예에 따른 항균용 조성물에서, 상기 유해미생물은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 비브리오 파라헤모리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 쉬겔라 손네이(Shigella sonnei) 및 에스케리치아 콜라이 O157(Escherichia coli O157)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 항균용 조성물에서, 상기 조성물은 바람직하게는 식품, 식품 첨가제, 사료 첨가제 또는 의약품 형태일 수 있고, 상기 식품은 유제품(우유, 두유, 가공우유), 발효유(액상 요구르트, 호상 요구르트), 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 식품은 기능성 식품을 포함할 수 있는데, 본 발명의 기능성 식품에는 상기 유효성분 외에도 필요에 따라 다양한 보조성분을 추가로 함유할 수 있다. 본 발명의 기능성 식품의 경우, 비타민 A, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B6, 비타민 B12, 엽산 (folic acid), 비타민 C, 비타민 D3, 비타민 E 등의 비타민류와, 구리, 칼슘, 철, 마그네슘, 칼륨, 아연 등의 미네랄 또는 유산균 등을 포함할 수 있다.

또한 본 발명의 기능성 식품 중, 건강음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 향미제로는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 들 수 있다. 천연 탄수화물로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토스, 수크로오스 등의 이당류, 덱스트린, 사이클로덱스트린 등의 다당류, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올류 등을 들 수 있다.

본 발명의 균주를 배양하는 단계에서 얻어지는 상기 균주 또는 이의 배양액을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 균주 또는 이의 배양액을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

본 발명의 사료 첨가제는 기초사료에 일정 비율로 첨가하는 것이다. 상기 기초사료는 주성분이 옥수수, 대두박, 유청, 어분, 당밀, 소금, 비타민 프리믹스 및 미네랄 프리믹스 등으로 이루어질 수 있다. 비타민 프리믹스는 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 리보프라빈 및 나이아신으로 구성될 수 있으며, 미네랄 프리믹스는 망간, 철, 아연, 칼슘, 구리, 코발트 및 셀레니늄 등으로 구성될 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 의약품을 제공한다. 상기 의약품은 항균물질을 함유하고 있으므로 유해 세균에 의한 질환을 예방 또는 치료할 수 있다. 상기 균주는 바람직하게는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis)이며, 더욱 바람직하게는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) CBD2 균주 또는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) KMKW4 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 본 발명의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 상기 유효성분 외에 통상적인 약학적 담체 및 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 조성물은 통상적인 프로바이오틱 조성물 제조방법에 따라 열건조 또는 동결-건조하여 생균제 형태로 제조하여 이용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 유해미생물에 대한 항균용 미생물 제제를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 균주를 배양하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법에 따라 배양할 수 있다.

본 발명의 유해미생물에 대한 항균용 미생물 제제는 유효성분으로서 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) CBD2 균주 또는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) KMKW4 균주를 이용하여 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 항균용 미생물 제제는 용액, 분말, 현탁액, 분산액, 에멀젼, 유성 분산액, 페이스트, 분진, 흩뿌림 물질 또는 과립제로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유해미생물에 처리하여 유해미생물을 방제하는 방법을 제공한다. 유해미생물은 전술한 바와 같다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 시료 수집 및 균주의 분리

전통발효식품인 된장, 간장, 청국장, 김치는 지역별(경남, 경북, 전남, 충남, 충북)로 된장 8종, 간장 7종, 청국장 1종, 김치 6종을 수집하였다. 모든 시료는 1g/9㎖ 멸균수와 혼합, 마쇄하였다. 마쇄액을 10배 단계 희석한 다음, NA 고체 배지에 분주하여 37에서 1일 배양하여 생성된 콜로니를 분리하였다.

2. 분리 균주의 동정

전통발효식품으로부터 분리한 10종의 균주는 멸균수에 현탁시킨 다음 영양 아가 (Difco, Detroit, USA) 배지에 도말하여 37℃에서 24시간 동안 배양하여 형성된 콜로니 중에서 생육이 잘되고, 콜로니 모양이 선명한 우세 균주를 선별하여 계대 배양하면서 순수하게 얻어진 균주를 선발하였다. 선발한 균주는 식품원료로 사용 가능한 미생물인지 확인을 위하여 (주)솔젠트(Solgent co., Korea)에 의뢰하여 16s 리보좀 DNA 염기서열을 기초로 균주를 동정한 분석 결과를 얻었다.

3. 분리 균주의 인공위액, 담즙산에 대한 저항성 평가

분리 균주의 인공위액에 대한 저항성 평가를 위하여 균주는 영양 액체(Difco, Detroit, USA)에 전배양한 다음 원심분리하여 균체만 회수하였다. 회수한 균체는 멸균한 0.5% NaCl로 세척하고 세척 마지막 단계에서 0.5% NaCl에 분산시켜 균주 현탁액을 준비하였다. 인공위액의 저항성 측정은 0.5% NaCl(pH 3.0)에 0.3%(w/v) 펩신을 첨가하여 제조한 인공위액에 균주 현탁액을 각각 10%씩 접종하여 3시간 동안 반응한 다음 아가 배지에 평판 도말하여 생균수를 측정하였다. 대조군으로는 0.5% NaCl(pH 3.0)에 0.3%(w/v) 펩신을 첨가하여 제조한 인공위액에 균주 현탁액을 각각 10%씩 접종하자마자 아가 배지에 평판 도말하여 측정하였으며, 정상군은 멸균된 0.5% NaCl(pH 3.0)에 균주 현탁액을 각각 10%씩 접종하여 초기와 3시간 동안 반응 후 아가 배지에 평판 도말하여 생균수를 확인하였다. 분리 균주의 인공위액에 대한 저항성은 대조군에 대한 정상군의 비율을 계산한 초기 생균수와 3시간 동안 반응 후 대조군에 대한 정상군의 비율을 계산한 생균수와 비교하여 %로 나타내었다.

담즙산에 대한 저항성 평가를 위하여 분리 균주는 액체 배지에 전배양한 후 원심분리하여 균체를 회수한 다음 멸균수로 세척하고 세척 마지막 단계에서 멸균수에 분산시켜 균주 현탁액을 준비하였다. 담즙산의 저항성 측정은 0.3% 담즙 염(bile salt)이 첨가된 액체 배지에 균주 현탁액을 0.5% 첨가하여 24시간 동안 배양한 후 UV-vis 분광광도계 (UVIKON XL, SECOMAN)를 이용하여 600nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로 액체 단독 배지에 균주 현탁액을 처리한 군을 사용하였으며, 담즙산에 대한 저항성은 24시간 동안 배양한 후 흡광도 대비 대조군의 비율을 계산하여 %로 나타내었다.

4. 분리 균주의 장내 점착성 평가

본 실험에 사용된 HT-29 세포는 사람의 대장암에서 유래되는 장관 상피세포로 한국세포주은행(Korea cell line bank, KCLB)에서 분양받아 사용하였다. HT-29세포는 10% FBS (Fetal bovine serum, Welgnen co., Daegu, Korea), 1% 페니실린/스트렙토마이신(Gibco, NY, USA)과 25 mM NaHCO₃ 및 25 mM HEPES를 첨가한 RPMI1640 (Welgene co., Daegu, Korea) 배지를 이용하여 37℃, 5% CO₂가 공급되는 배양기에서 배양하였다. 세포가 단일층(monolayer)을 형성하게 되면 계대 배양하여 격일로 배지를 교환해 주면서 실험에 사용하였다.

장내 점착성 실험을 위해 HT-29 세포는 각 웰 당 1×10⁵ cells/㎖의 농도로 24 웰 플레이트에 분주하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양하였으며 점착성 평가를 하기 전 FBS와 페니실린/스트렙토마이신이 함유되지 않은 순수한 RPMI1640 배지로 교환해 주어 실험을 수행하였다. 분리 균주는 영양 액체 배지에 접종하여 24시간 동안 37℃에서 전배양한 다음, 균주를 회수하여 0.1 M PBS(phosphate buffered saline)으로 3회 세척하여 FBS와 페니실린/스트렙토마이신이 첨가되지 않은 RPMI1640 배지에 분산시켰다. 분리 균주용액은 HT-29 세포를 배양한 웰 플레이트에 500㎕씩 접종하고 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 2시간 동안 배양한 후, 부착되지 않은 균주를 제거하기 위해 0.1 M PBS로 세척하였다. 생균수 측정을 위해 각 웰마다 0.1% 트리톤 X-100 1 ㎖를 넣고 37℃에서 30분간 반응시킨 다음 이를 회수하여 희석한 후 아가 배지에 평판 도말하여 37℃에서 24시간 동안 배양하여 생균수를 확인하였다. 장내 점착성(%)은 접종한 초기 균수에 대한 처리 후 생존한 부착균수의 비율을 계산하여 나타내었다.

5. 분리 균주의 항균성 평가

분리 균주의 병원성 미생물에 대한 항균성을 조사하기 위하여 지시균으로 그람양성과 그람음성으로 구분하여 10종을 대상으로 평가하였다. 10종의 병원성 미생물은 각 미생물 생육 조건에 맞는 액체 배지와 온도 조건에서 전배양 후 면봉을 이용하여 아가 배지에 도말하였다. 10종의 병원성 미생물이 도말되어 있는 아가 배지에 분리 균주를 이쑤시개로 접종하여 37℃, 24시간 동안 배양 후 클리어 존(clear zone)을 형성하는 생육 저지대를 확인하여 항균성이 있는 균주를 선발하였다.

6. 분리 균주의 면역증강

분리 균주에 의한 면역증강 활성을 평가하기 위하여 마우스 대식세포인 RAW264.7 세포를 한국세포주은행(KCLB)에서 분양받아 이용하였다. 세포는 DMEM(Dulbecoo's modified eagle's medium, Welgene co.)에 10% FBS(Welgene co.)와 1% 페니실린/스트렙토마이신(Gibco)를 첨가한 배지를 이용하여 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 배양하였다.

면역증강 활성은 RAW264.7 세포로부터 생산되는 NO(nitric oxide) 생성량을 그리스 용액 시스템 방법(Ahn et al. 2012 J Biomed Res, 13, 353-356)을 이용하여 조사하였다. RAW264.7 세포는 24 웰 플레이트에 5×10⁴ cells/㎖의 농도로 분주하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양하였으며, 균주 처리를 위하여 FBS와 페니실린/스트렙토마이신이 함유되지 않은 순수한 DMEM 배지로 교환해주어 면역증강을 측정하였다. 분리 균주는 액체 배지에 전배양한 다음, 균주를 회수하여 세척한 후 PBS를 추가하여 110℃에서 15분 동안 처리하여 면역증강 활성 측정용 시료(OD_660nm=1.2~1.5)로 사용하였다. 분리 균주 현탁액은 RAW264.7 세포를 배양한 웰 플레이트에 100㎕씩 접종하고 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, NO의 양은 세포 배양액과 그리스 시약(Sigma, St. Louis, MO, USA)을 동일한 비율로 혼합하여 반응시킨 다음 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, NaNO₂로부터 작성된 표준곡선을 이용하여 NO의 함량을 산출하였다.

7. 분리 균주의 생육을 위한 적정 배지 조건 분석

분리된 바실러스를 pH 3, pH 4, pH 5, pH 6, pH7, pH 8, pH 9, pH 10, pH 11로 조정한 영양배지에 접종한 후 37℃에서 24시간 배양하여 600nm에서 흡광도를 측정하여 적정 pH 조건을 조사하였다. 또한, NaCl 농도 1%, 2%, 3%, 4%로 조정한 영양배지에 접종한 후 37℃에서 24시간 배양하여 600nm에서 흡광도를 측정하여 적정 염 농도를 조사하였다. 또한, 글루코스 농도 0%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%로 조정한 영양배지에 접종한 후 37℃에서 24시간 배양하여 600nm에서 흡광도를 측정하여 적정 당 농도를 조사하였다.

8. 효소 활성의 측정

아밀라제(Amylase) 활성은 0.2M 소듐 포스페이트 완충용액(pH 7.0)에 용해한 0.5% 가용성 전분 0.5 mL에 0.5 mL의 소듐 포스페이트 완충용액(pH 7.0) 및 미리 전 배양한 미생물의 전배양액의 상징액 0.5 mL을 첨가하여 37℃에서 60분 반응시켰다. 이때 생성된 환원당의 함량은 DNS법으로 측정하였으며, 활성의 단위는 상기의 반응조건에서 1분당 생성하는 1umol의 환원당을 1 유닛(unit)으로 하였다.

실시예 1. 분리 균주의 동정 및 효소 분비능 우수 균주 분리

전통발효식품으로부터 균주를 분리한 후, 생육이 잘되고 콜로니 모양이 선명한 11종의 균주를 선발하여 동정을 실시한 결과 모두 바실러스 속 미생물로 나타났으며, 이들 중 식용 가능한 미생물은 4종으로 모두 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis)였으며 이들은 바실러스 서틸리스 CBD2, 바실러스 서틸리스 CBKW, 바실러스 서틸리스 KGC, 바실러스 서틸리스 KMKW4로 명명하였다. 이 중 세포외 효소 분비능을 확인하기 위해 아밀라제를 측정한 결과 바실러스 서틸리스 CBD2 및 바실러스 서틸리스 KMKW4에서 가장 높은 아밀라제 효소활성을 나타내어 소화 개선용 산업적 적용을 위한 2종의 바실러스 서틸리스의 생육활성 및 효소활성을 측정하였다.

실시예 2. 바실러스 속 균주 배양의 적정 환경조건

선발된 바실러스의 성장에 적합한 환경조건을 알아보기 위하여 실험을 실시한 결과 pH의 영향에 따른 생육도는 도 1과 같다. 바실러스는 pH 5.0~10.0의 영역에서 높은 생육도를 나타내었으며, pH 7.0으로 조정한 영양배지에서 배양한 흡광도가 가장 높았다. 바실러스의 염 내성을 알아보기 위해 실험을 실시한 결과는 도 2와 같다. 소금의 구성이온인 Na⁺와 Cl^-은 미생물 생장에 촉매 역할을 하고, 적정 농도의 소금양은 세균 성장에 좋은 조건이 된다고 알려져 있다. 본 발명에서는 37℃에서 24시간 배양 후, NaCl 농도를 3%로 조정한 영양배지에서 가장 높은 성장량을 보였으며 NaCl 함량이 4%부터 약간의 성장량이 감소하는 경향을 나타내어 3%에서 우수한 생육특성을 확인하였다. 도 3과 같이, 당 내성은 KMKW4, CBD2 2종 모두 유사한 생육특성을 나타내어 글루코스의 농도가 10%까지는 높은 성장량을 나타냈지만 글루코스 농도가 20% 이상에서는 대부분의 바실러스들이 생존하지 못하는 것을 확인하였다.

본 발명에서 분리된 두 균주 모두 아밀라제 효소활성이 나타났으며 바실러스 서틸리스 CBD2와 KMKW4에서 각각 529.72, 673.64 Unit/mL로 CBD2보다 KMKW4에서 더 높은 효소활성을 나타내는 것을 확인하여(도 4) 아밀라제 효소활성이 우수한 균주를 소화개선용 소재로 사용하면 소화개선의 증진에 도움이 될 것으로 사료된다.

실시예 3. 바실러스 속( Bacillus sp .)의 인공위액 및 담즙산에 대한 저항성 평가

프로바이오틱 미생물로 적용하기 위해서는 위장관의 낮은 pH 조건 및 소화 효소가 많은 담즙이 존재하는 환경에서 생존하여야 한다. 따라서 국내 전통발효식품으로부터 분리된 식용 가능 균주로 선발된 바실러스 서틸리스 CBD2, 바실러스 서틸리스 CBKW, 바실러스 서틸리스 KGC, 바실러스 서틸리스 KMKW4 4종에 대한 인공위액과 담즙산의 저항성을 확인하였다. NaCl로 조정된 pH 3.0에 0.3%(w/v) 펩신을 첨가하여 제조한 인공위액에 대한 저항성을 평가한 결과 바실러스 서틸리스 KMKW4가 64.58%로 가장 높은 생존율을 보였으며 바실러스 서틸리스 CBD2가 55.34%로 나타났고 바실러스 서틸리스 KGC, 바실러스 서틸리스 CBKW 각각 39.66%, 35.93% 순으로 인공위액에 대한 저항성을 보였다(표 1). 0.3% 담즙염을 이용하여 제조한 담즙산에 대한 내성을 평가하여 표 1에 나타내었다. 내담즙성은 바실러스 서틸리스 KMKW4가 31.17%로 가장 높게 나타났으며 바실러스 서틸리스 CBD2의 경우 8.84%로 담즙산에 대한 저항성이 약하게 나타났다. 박 등(1998 J Korean Soc Food Sci Nutr, 27, 433-440)은 바실러스 서틸리스의 경우 중성이나 약알칼리 환경에서 잘 자라며 산성이나 답즙산에 대해 강하지는 않으나 균주 선발을 통하여 내산성이나 내담즙성이 있는 것을 선별하는 것이 가능하다고 하였다. 전통발효식품으로부터 분리한 4종의 바실러스 서틸리스 중 바실러스 서틸리스 KMKW4는 다른 균주에 비해 내산성과 내답즙성이 상대적으로 우수하게 나타났으며, 바실러스 서틸리스 CBD2의 경우 내산성은 우수하였으나 내답즙성은 다소 약하게 나타났다. 그러나 이들은 상부 소화기관을 통과하면서 어느 정도 생존되어야 하는 프로바이오틱 미생물이 갖추어야 할 조건에 부합함을 확인하였다.

바실러스 속(Bacillus sp.) 균주의 인공위액 및 담즙산에 대한 저항성 분석

Digestive Juice	*Bacillus* *subtilis*	Viability (%)
Artificial gastric Juice	CBD2	55.34±1.12
	CBKW	35.93±8.47
	KGC	39.66±5.74
	KMKW4	64.58±2.95
0.3% Bile salt	CBD2	8.84±1.07
	CBKW	25.72±4.19
	KGC	8.62±2.09
	KMKW4	31.17±5.78

실시예 4. 바실러스 속( Bacillus sp .)의 장내 점착성 평가

프로바이오틱 산업용 미생물은 소화기관을 통과하여 최종 목적 부위인 장에 도달하게 되면 장내 상피세포에 정상적으로 부착하여 생존할 수 있는가가 가장 중요한 특성 중 하나이다. 이를 위하여 바실러스 서틸리스 4종의 시험관 내에서 장 상피세포에 대한 점착성을 평가하여 도 5에 나타내었다. HT-29 세포는 인체 장내 상피세포 계열로 프로바이오틱 미생물 선발을 위한 장내 점착성을 알아보기 위한 연구에 많이 이용되고 있다. 본 발명에서는 HT-29 세포를 이용하여 바실러스 서틸리스 4종에 대한 장내 점착성 실험을 실시하여 도 5에 나타내었다. 바실러스 서틸리스 CBD2와 바실러스 서틸리스 KMKW4가 각각 4.01%, 3.68%로 높게 나타났으며, 바실러스 서틸리스 CBKW와 바실러스 서틸리스 KGC는 3% 이하의 낮은 장내 점착성을 보였다. 이러한 결과를 같은 종의 바실러스 속(Bacillus sp.)이라도 HT-29 세포에 대한 점착능이 다르게 나타나고 있는데 이는 단백질의 성분이나 다당류, 리포테이코산(lipoteichoic acid) 등의 장 점착을 위한 인자의 농도와 균주 자체의 생리 활성에 의한 것이라 사료된다.

실시예 5. 바실러스 속( Bacillus sp .)의 항균성 평가

바실러스 서틸리스 4종의 병원성 미생물에 대한 저해활성 범위를 조사하고자 10종의 그람 양성 및 음성 유해균에 대한 항균력을 측정하였다(표 2). 그 결과 4종의 바실러스 서틸리스는 종류에 따른 차이는 나타났으나 대체적으로 병원성 미생물에 대한 항균력을 지니고 있었으며, 그 중에서도 바실러스 서틸리스 CBD2가 10종의 병원성 미생물 중 슈도모나스 아라지노사(Pseudomonas aeraginosa)를 제외한 9종에 대하여 생육 억제환을 생성함에 따라 가장 광범위한 항균스펙트럼을 가지는 것으로 관찰되었다. 바실러스 서틸리스가 생산하는 항생물질은 주로 펩티드로 구조적으로 단단하여 소수성의 특성을 지니고 있어 미생물이 표면에 부착하는 하는 것을 억제하며, 플레밍 등(1975 Appl Microbiol, 30, 1040-1042)은 항균성 평가에서 3 mm 이상의 생육 억제 환이 관찰될 경우 항균력이 있는 것으로 판단할 수 있다고 보고함에 따라 전통발효식품으로부터 분리한 바실러스 서틸리스 4종은 프로바이오틱으로서 적용을 위한 유해균의 억제력에 대한 특성을 지니고 있는 것으로 판단된다.

바실러스 속(Bacillus sp.) 균주의 유해성 세균에 대한 항균성 분석

Group	Microorganism	Antimicrobial activity
Group	Microorganism	CBD2	CBKW	KGC	KMKW4
Gram positive bacteria	Staphylococcus aureus	++	+	+	+
	Bacillus cereus	+	-	-	-
	Listeria monocytogenes	++	++	-	++
	Candida albicans	++++	+++	++++	++++
Gram negative bacteria	Vibrio parahaemolyticus	+	+	-	-
	Salmonella typhimurium	+	+	+	+
	Escherichia coli	+	+	+	-
	Shigella sonnei	+	+	+	+
	Escherichia coli O157	+	-	-	-
	Pesudomonas aeraginosa	-	+	-	-

성장 저해에 의한 클리어 존 생성 정도 : +; 1~5mm, ++; 6~10mm, +++; 11~15mm, ++++; 16~20mm, -; no inhibition zone.

실시예 6. 바실러스 속( Bacillus sp .)의 면역증강 활성 평가

프로바이오틱 미생물은 장 건강유지, 혈청 지질 및 콜레스테롤의 감소와 유해균 증식억제 및 위산과다, 항암 등 다양한 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 또한 프로바이오틱 미생물은 대식세포와 림프구를 활성화시켜 면역을 증강시키는 효과를 지니고 있다. 따라서 본 연구에서는 전통발효식품으로부터 분리한 바실러스 서틸리스 4종에 대한 면역증강 활성을 확인하였다.

바실러스 서틸리스 4종을 열처리하여 얻은 균주 현탁액은 마우스 대식세포인 RAW264.7 세포와 함께 배양한 결과, 유도되는 산화질소의 대사산물인 NO의 양을 측정하여 도 6에 나타내었다. 음성 대조구로 사용한 PBS 처리군은 9.42±93 μM이었으나, 대식세포 활성화를 유도하는 물질로 알려진 LPS(lipopolysaccharide)를 양성대조구로 사용하였을 때 1 ㎍/㎖의 LPS에서 108.80±2.04 μM의 높은 NO 생성량을 보였다. 전통발효식품으로부터 분리한 4종의 균주 중 바실러스 서틸리스 CBKW가 96.94±6.20 μM로 음성대조구 대비 10.3배 증가하여 가장 높게 나타났으며, 바실러스 서틸리스 KGC, 바실러스 서틸리스 CBD2, 바실러스 서틸리스 KMKW4가 각각 84.84±0.92, 82.08±4.20, 52.74±4.43μM순으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 바실러스 서틸리스 4종은 NO(nitric oxide) 생성량을 증가시키므로 면역증강 활성을 가진다는 것을 알 수 있었다.

농업생명공학연구원

KACC91904P

20131108

농업생명공학연구원

KACC91905P

20131108

Claims

전통발효식품으로부터 분리된 아밀라제 효소를 분비하고, 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대해 항균 활성 및 면역 증강 활성을 가지며, 내산성, 내담즙성 및 장내점착능을 가지는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) CBD2 균주(기탁번호 KACC91904P).
전통발효식품으로부터 분리된 아밀라제 효소를 분비하고, 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대해 항균 활성 및 면역 증강 활성을 가지며, 내산성, 내담즙성 및 장내점착능을 가지는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) KMKW4 균주(기탁번호 KACC91905P).
제1항에 있어서, 상기 균주의 적정 생육 조건은 pH 4.5~10.5, 2.5~3.5%(w/v) NaCl 및 5~18%(w/v) 글루코스가 포함된 조건인 것을 특징으로 하는 균주.
제2항에 있어서, 상기 균주의 적정 생육 조건은 pH 4.5~10.5, 2.5~3.5%(w/v) NaCl 및 5~18%(w/v) 글루코스가 포함된 조건인 것을 특징으로 하는 균주.
제1항 또는 제2항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대한 항균용 조성물.
제5항에 있어서, 상기 조성물은 식품 형태인 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.
제6항에 있어서, 상기 식품은 유제품, 발효유, 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.
제1항 또는 제2항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱 조성물.
제1항 또는 제2항의 균주를 배양하는 단계를 포함하는 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대한 항균용 미생물 제제를 제조하는 방법.
제1항 또는 제2항의 균주 또는 이의 배양액을 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 처리하여 칸디다 알비칸스를 방제하는 방법.