JP2018082701A - 酵素生成能、胆汁抵抗性、及びヘリコバクターピロリに対する抗菌能及び血栓溶解能を有するバチルスサブチリス(Bacillus subtilis)LRCC1002菌株 - Google Patents

酵素生成能、胆汁抵抗性、及びヘリコバクターピロリに対する抗菌能及び血栓溶解能を有するバチルスサブチリス(Bacillus subtilis)LRCC1002菌株 Download PDF

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Abstract

【課題】酵素生成能、胆汁抵抗性、及びヘリコバクターピロリに対する抗菌能及び血栓溶解能を有するバチルスサブチリス(Bacillus subtilis)LRCC1002菌株を提供する。
【解決手段】本発明によるバチルスサブチリス(Bacillus subtilis)LRCC1002菌株は、優れた酵素生成能を有し、優れた胆汁抵抗性、腸粘膜付着性及びヘリコバクターピロリに対する優れた抗菌能を有するので、腸機能改善用健康食品などの高機能性食品に適用可能である。また、本発明によるバチルスサブチリス(Bacillus subtilis)LRCC1002菌株は優れた血栓溶解能を有するので、血栓症予防又は改善用健康食品に適用可能であり、ひいてはこのような健康食品は血栓によって発生し得る生活習慣病に対する予防効果を期待することができる。
【選択図】 図4

Description

本発明はバチルスサブチリス(Bacillus subtilis)LRCC1002菌株に関するもので、より詳しくは酵素生成能、胆汁抵抗性、及びヘリコバクターピロリに対する抗菌能及び血栓溶解能を有するバチルスサブチリス(Bacillus subtilis)LRCC1002菌株に関するものである。
バチルスサブチリス(Bacillus subtilis)はいわゆる枯草菌とも呼ばれ、主に土壌に棲息するBacillus属に属する菌で、グラム陽性の胞子を形成する菌である。このようなバチルスサブチリスは好気性であり、周毛性鞭毛を持って運動し、耐熱性の菌であり、ブドウ糖など多様な糖類又は澱粉などをエネルギー源として代謝し、みそだま麹又はチョングクチャンのような発酵食品の製造時に発酵菌株として用いられることもある、有機物を分解することができる微生物である。
一方、バチルスサブチリス(Bacillus subtilis)は植物組織のペクチンと多糖類を分解する微生物として知られており、その他にもタンパク質及び澱粉のような多様な物質を分解することができる酵素を生産することができる微生物である。また、病原性細菌を抑制することができる抗菌物質を生成するバチルスサブチリスも研究によって知られ、多様な生化学、物理的な特性を有するとともに菌に対する安全性も立証されているため、生物学的製剤としても広く使われているのが実情である。また、韓国人にはチョングクチャンの発酵微生物として関係が深いだけでなく多くの微生物製剤としても用いられている。
一方、Korean Journal of Microbiology. 2012,Vol.48,No.3,pp.220−224.には伝統醤油類から分離された生体アミン(Biogenic Amines)分解能を有するバチルスサブチリス(Bacillus subtilis)菌株が開示されている。
また、バチルスサブチリスは血栓溶解能を保有するものとして知られているので、血栓に起因する成人病に対する予防効果を期待することができ、各種の有用な生理活性機能が報告されることによって機能性健康食品として注目が増している。
血栓はフィブリノゲン(Fibrinogen)がトロンビン(Thrombin)によってフィブリン(Fibrin)に転換されて形成される重合体であり、脳血管又は心臓血管に血栓が形成される疾患である血栓症は致命的である。よって、血栓を溶解させるために、ウロキナーゼ(Urokinase)、ストレプトキナーゼ(Streptokinase)、組織型プラスミノーゲン活性化因子(Tissue Type Plasminogen Activator tPA)などが使われていた。しかし、このような製剤は血中半減期が短く、出血などの副作用があり、価格が高いという問題点があった。それで、このような問題点を解決することができる血栓溶解物質を捜そうとする研究が活発に進められていた。
しかし、整腸機能(酵素分泌能、胆汁抵抗性、腸粘膜付着性)と血栓溶解能が高く、病原性微生物であるヘリコバクターピロリに対する抗菌作用を同時に有している菌株は見つかっていないのが実情であり、これらを同時に有している高付加価値食品の製造に使用可能な新規微生物に対する研究が必要とされていた。
キムヨンサン他、Korean Journal of Microbiology. 2012,Vol.48,No.3,pp.220−224.
本発明の目的は、酵素生成能、胆汁抵抗性、及びヘリコバクターピロリに対する抗菌能及び血栓溶解能を有するバチルスサブチリス(Bacillus subtilis)LRCC1002菌株を提供することである。
本発明の一側面によるバチルスサブチリス(Bacillus subtilis)LRCC1002菌株(受託番号:KCCM11880P)は、優れた酵素生成能、胆汁抵抗性、及びヘリコバクターピロリに対する抗菌能を有するとともに優れた血栓溶解能を有する。
そして、前記酵素はアミラーゼ又はプロテアーゼである。
本発明の他の側面による血栓症の予防又は改善用健康食品は、バチルスサブチリス(Bacillus subtilis)LRCC1002菌株(受託番号:KCCM11880P)又は前記菌株の培養液のいずれか一方又は両方を有効成分として含むことができる。
本発明のさらに他の側面による腸機能改善用健康食品は、バチルスサブチリス(Bacillus subtilis)LRCC1002菌株(受託番号:KCCM11880P)又は前記菌株の培養液のいずれか一方又は両方を有効成分として含むことができる。
本発明によるバチルスサブチリス(Bacillus subtilis)LRCC1002菌株は、優れた酵素生成能を有し、優れた胆汁抵抗性、腸粘膜付着性及びヘリコバクターピロリに対する優れた抗菌能を有するので、腸機能改善用健康食品などの高機能性食品に適用可能である。
また、本発明によるバチルスサブチリス(Bacillus subtilis)LRCC1002菌株は優れた血栓溶解能を有するので、血栓症の予防又は改善用健康食品に適用可能であり、さらにこのような健康食品は血栓が原因となり得る生活習慣病に対する予防効果を期待することができる。
本発明によるBacillus subtilis LRCC1002菌株の酵素分泌能確認結果を示す図である。 本発明によるBacillus subtilis LRCC1002菌株の腸内付着性確認結果を示す図である。 本発明によるBacillus subtilis LRCC1002菌株の抗菌力測定結果を示す図である。 本発明によるBacillus subtilis LRCC1002菌株の血栓溶解能測定結果を示す図である。
本発明は多様に変更させることができ、様々な実施例を含み得るが、特定の実施例を図面に例示し、以降、詳細に説明を行う。しかし、これは本発明を特定の実施形態に限定しようとするものではなく、本発明の思想及び技術範囲に含まれる全ての変換、均等物乃至代替物を含むものとして理解されなければならない。本発明の説明において関連の公知技術についての具体的な説明が本発明の要旨をあいまいにするおそれがあると判断された場合には、その詳細な説明を省略する。
本発明の一側面によるバチルスサブチリス(Bacillus subtilis)LRCC1002菌株(受託番号:KCCM11880P、以下LRCC1002菌株の受託番号KCCM11880Pの記載は省略する)は、酵素生成能、胆汁抵抗性、及びヘリコバクターピロリに対する抗菌能及び血栓溶解能を有する。
従来技術によれば、整腸機能(酵素分泌能、胆汁抵抗性、腸粘膜付着性)と血栓溶解能が高く、病原性微生物であるヘリコバクターピロリに対する抗菌作用を併せ持っている菌株が存在しないという問題点があった。
そこで、本発明者らは優れた酵素生成能を有し、優れた胆汁抵抗性、腸粘膜付着性及びヘリコバクターピロリに対する優れた抗菌能を有する菌株について研究を行い、同定して本発明を完成させた。
以下、発明の具体例であるバチルスサブチリス(Bacillus subtilis)LRCC1002菌株についてより詳細に説明する。
前記バチルスサブチリス(Bacillus subtilis)LRCC1002菌株を韓国微生物保存センター(Korean Culture Center of Microorganisms)に2016年8月12日付けで寄託した(Bacillus subtilis LRCC1002菌株)。
前記菌株は、酵素生成能、胆汁抵抗性、及びヘリコバクターピロリに対する抗菌能及び血栓溶解能を同時に有することができる。
前記酵素は消化酵素であって、アミラーゼ(amylase)、セルラーゼ(cellulase)、プロテアーゼ(protease)、リパーゼ(lipase)が挙げられるが、好ましくはアミラーゼ又はプロテアーゼである。
本発明の一側面によれば、本発明によるバチルスサブチリス(Bacillus subtilis)LRCC1002菌株又は前記菌株の培養液を有効成分として含む腸機能改善用健康食品を提供することができる。
一方、本発明によるバチルスサブチリス(Bacillus subtilis)LRCC1002菌株又は前記菌株の培養液を有効成分として含む血栓症予防又は改善用健康食品を提供することができる。
具体的に、腸機能改善又は血栓症の予防又は改善の効果を目的として本発明の前記菌株乾燥粉末又は菌株培養液を食品又は飲料に添加することができる。この時、食品又は飲料中の前記菌株乾燥粉末又は菌株培養液の量は食品総重量の0.01〜1.0重量%で加えることができ、健康飲料組成物は1000mlを基準として0.1〜10.0gの割合で加えることができる。
本発明の健康機能性飲料組成物は、必須成分として前記菌株乾燥粉末又は菌株培養液を含む限り、他の成分には特別な制限がなく、通常の飲料のように多様な甘味料又は天然炭水化物などを追加成分として配合することができる。上述した天然炭水化物の例は、単糖類、例えばブドウ糖、果糖など;二糖類、例えばマルトース、スクロースなど;及び多糖類、例えばデキストリン、シクロデキストリンなどの一般的な糖、及びキシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールである。上述したものの他に、甘味料として天然甘味料(タウマチン、ステビア抽出物、レバウディオサイドA、グリチルリチンなど)及び合成甘味料(サッカリン、アスパルテームなど)を使うことができる。
その他に、本発明の前記菌株乾燥粉末又は菌株培養液は多様な栄養剤、ビタミン、ミネラル(電解質)、合成香料及び天然香料などの香料、着色料及び充填剤(チーズ、チョコレートなど)、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、pH調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使われる炭酸化剤などを配合することができる。その他に、本発明の前記菌株乾燥粉末又は菌株培養液は天然果汁及び果汁飲料及び野菜飲料の製造のための果肉を配合することができる。このような成分は単独又は組合せで使うことができる。
本発明の一側面による腸機能改善又は血栓症予防又は改善用健康食品において、前記食品は乳製品、発酵乳、ドリンク剤、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディー類、スナック類、お菓子類、ピザ、ラーメン、ガム類、アイスクリーム類、スープ、飲料、アルコール飲料及びビタミン複合剤からなる群から選択されるものであるが、これに制限されない。
以下、本発明の好適な実施例を添付図面に基づいて詳細に説明する。ただ、これら実施例は専ら本発明を例示するためのもので、本発明の範囲がこれら実施例によって制限されるものとして解釈されてはいけない。
試験例1:分離菌株の同定及び酵素分泌能に優れた菌株の分離
伝統発酵食品から菌株を分離した後、生育がよくコロニー形状が鮮やかな9種の菌株を選抜した。選抜した菌株は食品原料として使用可能な微生物であるかを確認するために(株)バイオファクト(BIOFACT Co.Ltd.,大韓民国)に依頼して16sリボソームDNA塩基配列に基づいて菌株を同定した分析結果を得た。同定を実施した結果、いずれもBacillus属の微生物であり、このうち食用可能な微生物は4種で、いずれもBacillus subtilisであり、その細胞外酵素分泌能を確認した結果、Bacillus subtilis LRCC1002菌株においてアミラーゼ(Amylase)及びプロテアーゼ(Protease)酵素活性が一番優秀であった(図1)。実験の対照群は韓国細胞株銀行から分譲されたBacillus subtilis KCCM12512を用いた。
試験例2:人工胃液及び胆汁酸に対する抵抗性評価
分離菌株の人工胃液に対する抵抗性評価のために菌株はトリプシンソイ培地(Tryptic Soy Broth)(Difco、Detroit、USA)にて前培養した後、遠心分離して菌体のみ回収した。回収した菌体は滅菌した0.5%NaClで洗浄し、洗浄の最終段階で0.5%NaClに分散させて菌株懸濁液を準備した。人工胃液の抵抗性測定は、0.5%NaCl(pH2.5)に0.04%(w/v)ペプシンを添加して製造した人工胃液に菌株懸濁液を接種し、3時間反応させたのち寒天(Agar)培地に平板塗抹して生菌数を測定した。対照群の生菌数は、人工胃液に接種した後、直ちに寒天(Agar)培地に平板塗抹して測定した。分離菌株の人工胃液に対する抵抗性は初期生菌数と3時間反応後の生菌数の割合で計算してLog%で示した。
胆汁酸に対する抵抗性評価のために、分離菌株は液体培地にて前培養した後、遠心分離して菌体を回収した後、滅菌水で洗浄し、洗浄の最終段階で滅菌水に分散させて菌株懸濁液を準備した。胆汁酸の抵抗性測定は0.5%NaCl(pH7.0)に0.3%胆汁塩(Bile Ox gall salt)が添加された液体培地に菌株懸濁液を接種し、3時間反応させ、寒天(Agar)培地に平板塗抹して生菌数を測定した。対照群の生菌数は、胆汁酸液に接種した後、直ちに寒天培地に平板塗抹して測定した。分離菌株の胆汁酸に対する抵抗性は初期生菌数と3時間反応後の生菌数の割合で計算してLog%で示した。
プロバイオティック微生物を製品に適用するためには胃腸管の低いpH条件及び消化酵素が多い胆汁が存在する環境で生存させなければならない。よって、選抜されたBacillus subtilisのうち人工胃液と胆汁酸に対する抵抗性が高い菌株の探索実験を行い、下記の表1にその結果を示した。実験の対照群として、前記と同様に、Bacillus subtilis KCCM12512及びBacillus subtilis KCCM12027、Bacillus subtilis KCCM12511を用いた。人工胃液に対する抵抗性を評価した結果、Bacillus subtilis LRCC1002がLog67.6%と一番高い生存率を示し、0.3%胆汁塩を用いて製造した胆汁酸に対する耐性は4種の菌株のいずれもLog99%以上であり、有意差はなかった。
試験例3:腸内付着性評価
本実験に使用されたCaco2 Cellは人の大腸癌に由来する腸管上皮細胞であって、ATCC(American Type Culture Collection)から分譲されたものを用いた。Caco2 Cell(HTB−37、ATCC)は10%ウシ胎児血清(FBS;Fetal bovine serum)(Welgene co.,デグ,大韓民国)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco、NY、USA)を添加したEagle’s Minimum Essential Medium(EMEM、Welgene co.,デグ,大韓民国)培地を用いて37℃で5%CO2が供給される培養器で培養した。細胞が単一層(Monolayer)を形成したものについて、継代培養し、隔日で培地を交換しながら実験に使った。腸内付着性実験のために、Caco2 Cellは24Well PlateにWell当たり1×105cells/mLの濃度で分取し、37℃で5%CO2培養器で24時間培養した。分離菌株はトリプシンソイ培地(Tryptic Soy Broth)に接種し、24時間の間37℃で前培養した後、菌株を回収し、0.1Mリン酸緩衝生理食塩水(PBS;Phosphate Buffered Saline)で3回洗浄し、FBSとペニシリン/ストレプトマイシンが無添加のEMEM培地に分散した。Caco2Cellを培養した24Well Plateに分離された菌株培養液を500μlずつ接種し、37℃で5%CO2条件の下で2時間培養した後、付着しなかった菌株を除去するために0.1Mリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。これを回収して希釈した後、トリプシンソイ寒天(Tryptic Soy Agar)培地に平板塗抹し、37℃で24時間培養して生菌数を確認した。腸内付着性(Log%)は接種した初期菌数に対するCaco2 Cellに処理されて付着した菌数の割合で計算した。
消化器官を通過して最終目的部位である腸に到逹したときに腸管上皮細胞に正常に付着して生存することができるかを評価するために、分離した菌株と比較群としてKCCM12512、KCCM12027、KCCM12511の腸内付着性を評価した結果を図2に示した。Bacillus subtilis LRCC1002とBacillus subtilis KCCM12511がそれぞれLog80.3%、Log78.2%と腸内付着性が高い結果を示した。
試験例4:ヘリコバクターピロリ(Helicobacter pylori)菌に対する抗菌能評価
ヘリコバクターピロリ(Helicobacter pylori ATCC 40449)は韓国微生物保存センター(KCCM;Korean Culture Center of Microorganisms)から分譲された。ヘリコバクターピロリは10%羊血液(Sheep Blood)を含む血液寒天培地(BAP;Blood Agar Plate)(ハンイルコメド、大韓民国)に接種し、10%CO2培養器で増菌した。3日乃至4日間培養されたヘリコバクターピロリを0.85%生理食塩水に懸濁して準備した。実験用培地はBottom Agar(Agar 1.2%含有)及びTop Agar(Agar 0.3%含有)に区分して作成した。BBLTM Brucella Broth(Becton、Dickinson and Company、USA)を滅菌し、40℃まで冷やし、全体の10%の体積でウシ胎児血清(FBS;Fetal Bovine Serum)を追加した。Bottom Agar10mLをペトリ皿(Petri Dish)に先に分取し、常温で2時間程度固化させた。滅菌したTop Agarは40℃まで冷やし、全体の10%の体積でウシ胎児血清(FBS)と用意したヘリコバクターピロリ菌を接種し、固化させたBottom Agar上に3mL分株し、30分間固化させた後、10mmペーパーディスク(Toyo Roshi Kaisha、Ltd、Japan)を前記プレート上に載せた。LRCC 1002菌株の培養液を遠心分離して(8,000rpm、10分)上澄液と菌体液を分離した後、それぞれの試料を30μLずつペーパーディスクに分取し、37℃10%CO2培養器で3日乃至4日間培養して、阻止円形成の有無を観察した(図3)。伝統発酵食品から分離したBacillus subtilis LRCC 1002菌株はプロバイオティックスとして適用可能な有害菌の抑制力に対する特性を持っていると判断される。
試験例5:血栓溶解能活性評価
Astrup,T.and Mullertz方法[The Fibrin Plate Method for Estimating Fibrinolytic Activity、 Archivesbiochem. Biophysics,1952]を変形してフィブリノゲン(Fibrinogen)溶液(0.17M ほう酸緩衝溶液、0.3%フィブリノゲン10mL)をペトリ皿に分取し、これにトロンビン(Thrombin)溶液(0.17Mほう酸緩衝溶液、500U/mLトロンビン)を0.5mL添加した後、1分間撹拌し、1時間以上固化させた。固化したフィブリンプレートにペーパーディスクを載せ、測定試料20μLを分株した後、室温で3時間放置し、ペーパーディスクの周りに生成された透明な部位の直径を測定した。対照群は、精製された血栓溶解酵素であるプラスミン(Plasmin、1.0units/mL)を用い、次の式で血栓溶解能を計算した。分離した菌株LRCC1002と比較群としてのKCCM12512、KCCM12027、KCCM12511の血栓溶解酵素活性度の測定結果は図4に示す通りである。
*血栓溶解能(Fibrinolytic activity)(%)=(Sample Clear Zone/Nattokinase Clear Zone)×100
前記のように、本発明によるバチルスサブチリス(Bacillus subtilis)LRCC1002菌株は、優れた酵素生成能を有し、優れた胆汁抵抗性、腸粘膜付着性及びヘリコバクターピロリに対する優れた抗菌能を有するので、腸機能改善用健康食品などの高機能性食品に適用可能であることが分かった。さらに、本発明によるバチルスサブチリス(Bacillus subtilis)LRCC1002菌株は優れた血栓溶解能を有するので、血栓症の予防又は改善用健康食品に適用可能であり、ひいてはこのような健康食品は血栓によって発生し得る生活習慣病に対する予防効果を期待することができる。
以上で本発明の特定部分を詳細に記述したが、当該分野の通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述はただ好適な実施様態であるだけで、これによって本発明の範囲が制限されるものではない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は添付の請求項とその等価物によって定義されると言える。
寄託機関:韓国微生物保存センター
受託番号:KCCM11880P
寄託日:2016.08.12

Claims (4)

  1. 酵素生成能、胆汁抵抗性、及びヘリコバクターピロリに対する抗菌能及び血栓溶解能を有する、バチルスサブチリス(Bacillus subtilis)LRCC1002菌株(受託番号KCCM11880P)。
  2. 前記酵素生成能はアミラーゼ又はプロテアーゼを生成する能力である、請求項1に記載のバチルスサブチリス(Bacillus subtilis)LRCC1002菌株(受託番号KCCM11880P)。
  3. 酵素生成能、胆汁抵抗性、及びヘリコバクターピロリに対する抗菌能及び血栓溶解能を有するバチルスサブチリス(Bacillus subtilis)LRCC1002菌株(受託番号KCCM11880P)又は前記菌株の培養液のいずれか一方又は両方を有効成分として含む、血栓症予防又は改善用健康食品。
  4. 酵素生成能、胆汁抵抗性、及びヘリコバクターピロリに対する抗菌能及び血栓溶解能を有するバチルスサブチリス(Bacillus subtilis)LRCC1002菌株(受託番号KCCM11880P)又は前記菌株の培養液のいずれか一方又は両方を有効成分として含む、腸機能改善用健康食品。
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