CN115873748B - 枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌发酵物及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌发酵物及应用，该枯草芽孢杆菌，以及其经过发酵后得到的发酵物，通过大量的实验证明枯草芽孢杆菌具有较好的黏附性，能够黏附于猪胃粘膜上的猪胃黏蛋白，从而能够有效的留存在猪胃当中，起到治疗或预防猪胃溃疡的作用，也在一定程度上减少了细菌随着与食物残渣或胃液等流到肠道中。并且枯草芽孢杆菌也具有抗胃酸的能力，避免了在胃酸的冲刷下死亡。

Description

枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌发酵物及应用
技术领域
本发明涉及枯草芽孢杆菌技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌、枯 草芽孢杆菌发酵物及二者的应用。
背景技术
胃溃疡是指急性消化不良与胃出血引起胃黏膜局部组织糜烂、坏死或 自体消化，从而形成圆形溃疡面，甚至胃穿孔。胃溃疡特指胃的食管区溃 疡。近年来，在屠宰场的屠宰猪中常见，在日常养殖管理中也曾遇到多例， 重度的胃溃疡是造成猪场猪只死亡的主要问题。胃溃疡发生于各种年龄的 猪，可见呕吐、排黑粪，皮肤、粘膜苍白等症状。病初可见粘膜表面起皱 纹，变得粗糙，很易被胆汁或胃内容物染成黄、黄褐色或绿色；进而粘膜上 皮被破坏，形成糜烂、不平；最后形成溃疡、出血。严重时食管区凹陷，边 缘隆起成堤状。
胃溃疡的胃多膨大，食管区失去弹性；胃内容物软或液状；有出血时是 黄褐色；严重出血时则为酱油样。胃出血、溃疡特别严重的猪只，生前吐巧 克力色胃内容，剖检后小肠内容和胃内均为煤焦油样物。
在猪标本的组织切片中，检测出猪螺杆样细菌，这些细菌往往成群或 散在地存在于粘液层，粘膜上皮表面或粘膜腺体内。这些细菌有的呈弧形， 有的呈S形，其形态与在慢性胃炎病人胃粘膜中所见到的幽门螺杆菌十分 相似。且上述胃粘膜组织都呈现出中等度到较严重的慢性炎症病灶，主要 表现为粘膜和固有层大量的单核细胞、淋巴细胞和浆细胞浸润，有些病灶 伴有淋巴滤泡形成。
发明内容
基于此，本发明提出了一种枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌发酵物及二 者的应用，用于治疗或预防猪的急性或慢性胃溃疡，有效减少了溃疡的发 生概率和恶化程度。
本发明提供了一种枯草芽孢杆菌，上述枯草芽孢杆菌的分类命名 为枯草芽孢杆菌B1，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，中 国典型培养物保藏中心位于武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2017591，鉴别种属Bacillus subtilis，保藏时间2017年10月19日。
进一步的，上述枯草芽孢杆菌对猪胃黏蛋白的体外黏附率包括 50-60％。
本发明提供了一种上述枯草芽孢杆菌用于预防和/或治疗猪溃疡性胃 病中灭杀致病菌的组合物和/或活化非活性益生菌组合物的应用。
本发明提供了一种上述枯草芽孢杆菌发酵获得的枯草芽孢杆菌发酵 物，上述发酵物为棕黄色液体，上述发酵物干燥后得到分子量包括204的 发酵组分。
本发明提供了一种上述枯草芽孢杆菌发酵物用于预防和/或治疗猪溃 疡性胃病中灭杀致病菌的组合物和/或活化非活性益生菌组合物的应用。
进一步的，包括将上述枯草芽孢杆菌发酵物用于发酵产物在50～100℃ 下制粒得到颗粒状制粒。
从上述技术方案可以看出，本发明提供的枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆 菌发酵物及二者的应用具有以下有益效果：
本发明提供了一种枯草芽孢杆菌，以及其经过发酵后得到的发酵物， 通过大量的实验证明枯草芽孢杆菌具有较好的黏附性，能够黏附于猪胃粘 膜上的猪胃黏蛋白，从而能够有效的留存在猪胃当中，起到治疗或预防猪 胃溃疡的作用，也在一定程度上减少了细菌随着与食物残渣或胃液等流到 肠道中。并且枯草芽孢杆菌也具有抗胃酸的能力，避免了在胃酸的冲刷下 死亡。
枯草芽孢杆菌及其发酵物具有较好的生物活性，能够灭杀胃中的有害 菌和致病菌，例如猪螺杆样细菌，从而有效治疗或预防猪螺杆样细菌引起 的猪胃溃疡或胃炎，并有助于胃中有益菌的生长，从而起到治疗或预防胃 溃疡的作用。
枯草芽孢杆菌及其发酵物具有较好的耐高温的性能，能够将该发酵物 用于猪胃药的制备，并且在胃药颗粒的制备过程后，发酵物仍能够较好的 保持药物的有效性。由于发酵物具有较好的稳定性，可以使发酵物被配置 为各种制剂，且便于保存。
附图说明
图1为本发明实施例的枯草芽孢杆菌发酵物的色谱图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实 施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
目前看来，对病猪的治疗原则是镇静止痛、抗酸止酵、消炎止血，同 时改善饲养、加强护理。改善饲养，给予富含营养易消化的饲料，减少应 激反应。减轻疼痛和反射性刺激。
枯草芽孢杆菌是一种应用比较多的生防细菌，关于枯草芽孢杆菌的防 病作用已经进行了大量的研究，目前虽然化学药剂在畜牧病害防治方面具 有主导地位，但枯草芽孢杆菌因其在肠道抗菌方面的应用逐渐受到重视， 但由于胃部环境与肠道具有明显区别，尤其是对于胃酸，大多细菌无法在 胃酸中存活。
基于此，根据上述情况，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌，该枯草芽 孢杆菌的分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B1，保藏在中 国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2017591。
进一步的，该枯草芽孢杆菌对猪胃黏蛋白的体外黏附率包括50-60％。
本发明提供了一种该枯草芽孢杆菌用于预防和/或治疗猪溃疡性胃病 中灭杀致病菌的组合物或活化非活性益生菌组合物的应用。
进一步的，该枯草芽孢杆菌可以与其他成分，通过包埋、自组装等方 法制成胶囊或药液。
进一步的，组合物中还可以包括鞣酸、氧化镁、硝酸铋、止血剂、葡 萄糖或维生素等利于病症恢复的成分。
进一步的，组合物中还可以包括稳定剂、络合剂等利于组合物制备成 胶囊或药液的成分。
本发明提供了一种该枯草芽孢杆菌发酵获得的枯草芽孢杆菌发酵物， 该发酵物为棕黄色液体，该发酵物干燥后得到分子量包括204的发酵组分。
本发明提供了一种该枯草芽孢杆菌发酵物用于预防和/或治疗猪溃疡 性胃病中灭杀致病菌的组合物或活化非活性益生菌组合物的应用。
细菌需要发挥益生效果需要在肠道上皮细胞上进行粘附，如果不具有 较好的粘附效果，那么它就会脱落随着其他杂质一起排除体外，在体内没 有较长的停留时间表明效果有限。
本发明提供的枯草芽孢杆菌，以及其经过发酵后得到的发酵物，通过 大量的实验证明枯草芽孢杆菌具有较好的黏附性，能够黏附于猪胃粘膜上 的猪胃黏蛋白，从而能够有效的留存在猪胃当中，起到治疗或预防猪胃溃 疡的作用，也在一定程度上减少了细菌随着与食物残渣或胃液等流到肠道 中。并且枯草芽孢杆菌也具有抗胃酸的能力，避免了在胃酸的冲刷下死亡。
枯草芽孢杆菌及其发酵物具有较好的生物活性，能够灭杀胃中的有害 菌和致病菌，并有助于胃中有益菌的生长，从而起到治疗或预防胃溃疡的 作用。
枯草芽孢杆菌对于猪胃本身具有一定的有益作用，在胃中定值后具有 一定的益生效果，灭杀胃中的有害菌和致病菌，抑制其生长，并有助于胃 中有益菌的生长，最终改善猪消化系统的环境，进一步还能够起到对免疫 系统起到增强作用。
进一步的，包括将枯草芽孢杆菌发酵物用于发酵产物在50-100℃下制 粒得到颗粒状制粒。
普通片剂都有适宜的硬度，有利于口服，制作工艺比较复杂且纯度高， 含有的杂质极少，生物利用率高，容易把握其使用剂量。保存条件并不高， 能长时间保存，即使在高温潮湿的环境中也可以储存很长时间。但此类药 片在胃液中15分钟后才能慢慢被崩解，消耗的时间比较长。
药液服用起来方便，能迅速崩解且吸收好，起效速度快，这样能降低 药物带来的不良反应，从而提高其药效，但美中不足的是此类药物不能长 时间保存，放在高温潮湿环境下，可能会沉淀或发生霉变。跟片剂相比， 药液制备工艺简单，杂质含量比较高，且但药品包装打开之后，不能长期 暴露在空气中。
枯草芽孢杆菌及其发酵物具有较好的耐高温的性能，能够将该发酵物 用于猪胃药的制备，并且在胃药颗粒的制备过程后，发酵物仍能够较好的 保持药物的有效性。由于发酵物具有较好的稳定性，可以使发酵物被配置 为各种制剂，且便于保存。
进一步的，枯草芽孢杆菌发酵物通过在50-100℃下制粒得到颗粒状制 粒的工艺过程可以采用现有的制药过程，分别经历提取、纯化、浓缩、混 合、制粒、干燥、包衣等步骤。
以下通过较佳实施例来对本发明的技术方案作详细说明，需要说明的 是，下文中的具体实施例仅用于示例，并不用于限制本发明。
实施例1：枯草芽孢杆菌发酵物的表征。
图1为本发明实施例的枯草芽孢杆菌发酵物的色谱图。
对本发明提供的枯草芽孢杆菌B1进行发酵，取上清液重复分离提纯 后再次进样检测，得到单一的峰，显示该峰保留时间为4.182min，对色谱 峰进行面积归一化处理，得到此组分的百分含量为99.32％。确定物质的分 子量在204左右。
实施例1：探究枯草芽孢杆菌对病原菌抑制作用。
对本发明提供的枯草芽孢杆菌B1在37℃的LB培养基或者营养肉汤 培养基中进行发酵培养18～48小时，取上清液重复分离提纯获得枯草芽孢 杆菌发酵物，并采用相同的发酵方式获得的其他枯草芽孢杆菌(从广东环 凯微生物科技有限公司购买)的发酵物，测定上述发酵物对有害菌的抑制 作用，其中，(-)表示无抑菌效果；牛津杯直径为7.8mm，结果见表1。
表1枯草芽孢杆菌对有害菌的抑制作用
Figure BDA0003804752880000051
Figure BDA0003804752880000061
由表1可知，芽孢杆菌中BS2和B1的抑菌能力较好，并且，由此看 出，本申请提供的枯草芽孢杆菌B1及枯草芽孢杆菌发酵物对于普通的有 害菌和引起猪胃溃疡致病菌均具有比较好的抑制作用，从而表明本申请提 供的枯草芽孢杆菌B1及枯草芽孢杆菌发酵物能够起到治疗或预防猪胃溃 疡的作用。
实施例2：探究枯草芽孢杆B1对猪胃黏蛋白的体外黏附作用。
由表1的结果可知，芽孢杆菌中BS2和B1的抑菌能力较好，因此仅 对上述枯草芽孢杆菌的菌株进行了体外的黏附的测试
用猪胃粘蛋白来模拟肠道细胞，细菌粘附猪胃粘蛋白的能力用来评价 其在肠道细胞上的粘附能力。配置0.1mg/mL的Ⅲ型猪胃黏蛋白 (Sigma-Aldrich)，取100μL加入到96孔细胞培养板的孔中固定，4℃过夜 处理后，多余的黏蛋白用无菌PBS冲洗干净。将培养好的菌液4000rpm 离心5分钟，去掉上清液，再加入无菌PBS洗3次收集菌体，将菌体配置 成108CFU/mL的菌悬液，取100μL加入到每个孔中，放置于37℃静置3 h，然后用200μL的无菌PBS洗掉孔内未固定的细菌，重复洗5次，再加 入200μL 0.05％的Triton X-100分离吸附的细菌。37℃处理1h后活菌平 板计数，结果以细菌菌落数的对数值log CFU表示，粘附率＝加入菌悬液 后0h时活菌数/3h后活菌数×100％表示。重复3次，取平均值，结果见 表2。
表2枯草芽孢杆菌的体外黏附能力
Figure BDA0003804752880000062
由表2可知，本申请提供的芽孢杆菌B1相较于BS2具有较好的体外 黏附效果，证明枯草芽孢杆菌具有较好的黏附性，能够黏附于猪胃粘膜上 的猪胃黏蛋白，从而能够有效的留存在猪胃当中，起到治疗或预防猪胃溃 疡的作用。
实施例3：探究枯草芽孢杆B1的耐受性。
(1)探究枯草芽孢杆菌的耐酸性
将菌种在pH为5.0、6.0和7.0的培养基中，观察其生长状态，并通 过吸光度和生长状况体现其对酸的耐受性，结果见表3和表4。
表3枯草芽孢杆菌OD600吸光值的测定
Figure BDA0003804752880000071
表4芽孢杆菌的生长情况
Figure BDA0003804752880000072
表4中，++表示菌种生长良好，+表示能生长但生长能力很弱。
由表3和表4可知，菌种在pH为5.0、6.0和7.0的培养基中，生长 良好，培养基浑浊，摇瓶底部有沉淀，说明对pH为5.0、6.0的耐受能力 较强；在pH降低到4.0、3.0、2.0后，菌种的生长明显微弱，培养基较为 澄清，摇瓶底部没有沉淀，根据测OD600吸光值能证明，在较低的pH2.0、 3.0、4.0的培养基中，耐受力较差，菌种生长能力很弱。
(3)探究枯草芽孢杆菌的对人工胃液的耐受性
在pH为2.0的人工胃液中培养2h、3h后，观察其生长状态，并通 过生长状况体现其对人工胃液的耐受性，结果见表5。
表5芽孢杆菌在pH为2.0的人工胃液耐受情况(log CFU/mL)
Figure BDA0003804752880000073
由表5可知，本申请提供的枯草芽孢杆菌B1在pH为2.0和3.0的人 工胃液中培养2h、3h后，枯草芽孢杆菌B1均有一定的耐受力，由此可 以看出本申请提供的枯草芽孢杆菌可以长时间在胃液中存活，形成菌群， 从而能够有效的留存在猪胃当中，起到治疗或预防猪胃溃疡和猪胃炎的作 用，也避免了在胃酸的冲刷下死亡。
(3)探究枯草芽孢杆菌的对人工肠液的耐受性
在人工肠液中培养2h、3h后，观察其生长状态，并通过生长状况 体现其对人工肠液的耐受性，结果见表6。
表6芽孢杆菌在人工肠液耐受情况(log CFU/mL)
Figure BDA0003804752880000081
由表6可知，本申请提供的枯草芽孢杆菌B1在人工肠液中培养2h、 3h后，枯草芽孢杆菌B1均有一定的耐受力，由此可以看出本申请提供的 枯草芽孢杆菌可以长时间在肠道中存活，部分细菌即使随着食物残渣或胃 液等流到肠道中，也能在肠道中发挥作用，能够抑制肠道中的有害菌生长， 并有助于胃中有益菌的生长，从而起到调节消化系统的作用。
本发明提供了一种枯草芽孢杆菌，以及其经过发酵后得到的发酵物， 通过大量的实验证明枯草芽孢杆菌具有较好的黏附性，能够黏附于猪胃粘 膜上的猪胃黏蛋白，从而能够有效的留存在猪胃当中，起到治疗或预防猪胃 溃疡的作用，也在一定程度上减少了细菌随着与食物残渣或胃液等流到肠 道中。并且枯草芽孢杆菌也具有抗胃酸的能力，避免了在胃酸的冲刷下死 亡。
实施例4：探究枯草芽孢杆B1发酵物的高温抑菌作用。
将菌种进行发酵后，获得枯草芽孢杆B1发酵物，将该发酵物进行不 同温度的处理，对处理后样品进行抑菌测试，结果见表7。
表7枯草芽孢杆B1发酵物的抑菌情况
Figure BDA0003804752880000082
Figure BDA0003804752880000091
由表7可知，本申请提供的枯草芽孢杆菌B1的发酵物在100℃以内 均具有比较好的抑菌效果，由此可以看出本申请提供的枯草芽孢杆菌发酵 物在制药制粒等过程中，仍能够保持较好的抑菌性能，能够抑制肠道中的 有害菌生长，并有助于胃中有益菌的生长，从而起到调节消化系统的作用。
枯草芽孢杆菌及其发酵物具有较好的耐高温的性能，能够将该发酵物 用于猪胃药的制备，并且在胃药颗粒的制备过程后，发酵物仍能够较好的 保持药物的有效性。由于发酵物具有较好的稳定性，可以使发酵物被配置 为各种制剂，且便于保存。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行 了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已， 并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、 等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌的分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis B1，保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M2017591。
2.一种权利要求1所述的枯草芽孢杆菌用于制备预防和/或治疗由猪螺杆样细菌引起的猪胃溃疡或胃炎的组合物的应用。
3.一种通过权利要求1所述的枯草芽孢杆菌发酵获得的枯草芽孢杆菌发酵物，其特征在于：所述发酵物为棕黄色液体，所述发酵物干燥后得到包括分子量为204的发酵组分。
4.一种权利要求3所述的枯草芽孢杆菌发酵物用于制备预防和/或治疗由猪螺杆样细菌引起的猪胃溃疡或胃炎的组合物的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：包括将所述枯草芽孢杆菌发酵物用于在50～100℃下制粒得到颗粒状制粒。
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