CN114480231A - 一种抗幽门螺杆菌感染的罗伊氏乳杆菌及其应用 - Google Patents
一种抗幽门螺杆菌感染的罗伊氏乳杆菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抗幽门螺杆菌感染的罗伊氏乳杆菌及其应用，所述罗伊氏乳杆菌经鉴定为罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri），菌株名为DRTR，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2020年10月19日，保藏编号为CCTCC NO：M2020597。本发明提供的罗伊氏乳杆菌具有良好的耐胃酸能力，可以抑制幽门螺杆菌的增殖和尿素酶活性，降低幽门螺杆菌对人胃粘膜细胞GES‑1粘附；将其制成相应的抑制幽门螺杆菌感染的产品，能够抑制幽门螺杆菌胃部环境下生长；与抗生素联合治疗幽门螺旋杆菌感染，能够显著提高根除率，降低治疗过程中副作用，具有很高的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种抗幽门螺杆菌感染的罗伊氏乳杆菌及其应用。
背景技术
幽门螺杆菌（H. pylorii，Hp）种螺旋杆状微需氧菌，主要定殖于胃黏膜。它是由两位澳大利亚科学家 Warren 和Marshall于1982年首次发现的，他们因其工作获得了2005年诺贝尔医学生理学奖。经过多年研究，众所周知，幽门螺杆菌是慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌、胃黏膜相关淋巴组织（MALT）淋巴瘤的主要致病因素，并与一些肠外疾病有关。1994年，隶属于世界卫生组织的国际癌症研究机构(IARC)指定幽门螺杆菌作为一类致癌物。然而，研究表明，根除H. pylori可以降低胃癌的发病率。
幽门螺杆菌存在于胃上皮细胞中，感染了全球近50%的人口。它与多种胃十二指肠病变有关，包括胃癌和消化性溃疡。这种病原体可能会导致慢性胃炎，进而导致萎缩性胃炎、肠化生并导致胃癌。
目前，有许多方案旨在根除幽门螺杆菌，这些方案突出了抑酸剂和抗生素的重要性。这两类药物的使用会引起胃肠道微生态紊乱，增加抗生素耐药率，增加不良反应的发生率，从而降低幽门螺杆菌的根除率。Hp的理想根除率应在90％以上，而目前标准三联疗法的根除率已远低于Maastrieht III共识意见提出的治疗方案应至少达到80％以上的根除率，且根除失败率逐年升高。国际推荐的一线治疗方案已从标准的7天三联疗法升级为四联疗法14天。然而，剂量越高，治疗过程的变异性和长度越大，这导致幽门螺杆菌根除率进一步下降。
益生菌是治疗胃肠道疾病的新兴替代品，益生菌在根除幽门螺杆菌中的作用越来越得到认可。它们通过修饰微生物群来发挥作用，作为抗菌剂或免疫调节剂。益生菌根除幽门螺旋杆菌的作用机制：1、抑制幽门螺杆菌的定植；2、产生抑制幽门螺杆菌的物质；3、增加免疫；4、平衡胃部环境；5、与幽门螺杆菌共聚。但是，目前仅用益生菌实现幽门螺旋杆菌根除还尚有困难。
因此，在预防幽门螺杆菌感染，代替或者协助抗生素治疗幽门螺杆菌感染方面寻找更有效的益生菌菌株仍是通过益生菌预防/治疗幽门螺旋杆菌的关键。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明目的是提供一种抗幽门螺杆菌感染的罗伊氏乳杆菌及其应用。
技术方案：为了达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种罗伊氏乳杆菌，经鉴定为罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri），菌株名为DRTR，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2020年10月19日，保藏编号为CCTCCNO：M2020597。
所述罗伊氏乳杆菌DRTR是从健康人体中筛选的乳酸菌，该菌株经测序分析，其16SrDNA序列如SEQ ID NO.1所示，将测序得到的序列经过16SrDNA基因比对，结果显示菌株为罗伊氏乳杆菌，命名为罗伊氏乳杆菌DRTR (Lactobacillus reuteri DRTR)。
本发明还提供了所述的罗伊氏乳杆菌在制备抗幽门螺杆菌感染药物中的应用。或者所述罗伊氏乳杆菌在制备食品中的应用。所述抗幽门螺杆菌感染包括预防和/或治疗幽门螺杆菌感染。
作为一种实施方案，所述罗伊氏乳杆菌为活菌或热灭活菌。
作为一种实施方案，所述幽门螺杆菌为幽门螺杆菌（Helicobacterpylori）SS1。
优选的，所述药物的剂型为粉剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液；所述食品为保健食品；或者所述食品包括乳制品、豆制品、肉制品或果蔬制品；或者所述食品为饮料或零食。
进一步优选的，所述粉剂的制备方法包括：将上述罗伊氏乳杆菌按照占培养基总质量3～15％的接种量接种到培养基中，于36-39℃下培养8～12h，得到培养液；将培养液离心，得到菌泥；在所述菌泥中加入菌泥保护剂进行乳化，之后进行冷冻干燥，得到所述粉剂。
更优选的，所述菌泥保护剂成分为：水60-80%，脱脂乳粉8-12%，蔗糖4-6%，甘露糖醇1-6%，吐温-80 1-3%，甜菜碱1-3%，谷氨酸钠0.5-1.5%，可溶性淀粉4-6%。
所述粉剂，还可以与其他药用辅料或食用辅料混合，制成组合物，例如：其他辅料为益生元、植物提取物或其他可与益生菌冻干粉混合食用的固体成分。
本发明还提供了一种组合物，包含所述的罗伊氏乳杆菌。
优选的，所述组合物包含所述的罗伊氏乳杆菌、药物载体和/或药用辅料。
进一步优选的，所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒和/或脂质体；所述药用辅料包含赋形剂和/或附加剂。
更优选的，所述赋形剂包含黏合剂、填充剂、崩解剂和/或润滑剂；所述附加剂包含增溶剂、助溶剂、潜溶剂和/或防腐剂。
优选的，所述组合物包含所述的罗伊氏乳杆菌和食用辅料。
本发明还提供了所述的组合物在制备抗幽门螺杆菌感染药物中的应用。
本发明最后提供了所述的罗伊氏乳杆菌联合抗生素在制备抗幽门螺杆菌感染药物中的应用。所述罗伊氏乳杆菌能够辅助抗生素治疗幽门螺旋杆菌，提高根除率，降低副反应。
作为实施方案，所述抗生素包括三联疗法或者四联疗法中的抗生素，例如所述罗伊氏乳杆菌辅助3联抗生素（奥美拉唑、阿莫西林和甲硝唑）疗法治疗幽门螺杆菌感染。
有益效果：本发明提供的罗伊氏乳杆菌具有良好的耐胃酸能力，可以抑制幽门螺杆菌的增殖和尿素酶活性，降低幽门螺杆菌对人胃粘膜细胞GES-1粘附；将其制成相应的抑制幽门螺杆菌感染的产品，能够抑制幽门螺杆菌胃部环境下生长；与抗生素治疗幽门螺旋杆菌感染，能够显著提高根除率，降低治疗过程中副作用，能用于制备药品、功能食品、食品/药品添加成分，具有很高的应用价值。
附图说明
图1为罗伊氏乳杆菌DRTR革兰氏染色光学显微镜照片示意图。
图2为罗伊氏乳杆菌DRTR生物进化树。
图3为DRTR菌株和DSM17648菌株活菌与SS1共同培养下SS1的活菌数。
图4为 DRTR菌株和DSM17938菌株活菌与SS1共同培养下SS1的尿素酶活性。
图5为罗伊氏乳杆菌DRTR与DSM17938抑制幽门螺旋杆菌GES-1粘附力。
图6为罗伊氏乳杆菌DRTR与DSM17938清除幽门螺旋杆菌GES-1粘附力。
图7为不同模拟胃液环境及干预情况下幽门螺杆菌活性随时间活性变化。
具体实施方式
通过以下实施例进一步对本发明进行进一步阐述。这些实施例完全是例证性的，他们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例对从健康人体中筛选的乳酸菌进行抗幽门螺杆菌感染或抑制幽门螺杆菌生长的筛选，步骤及方法如下：
对幽门螺杆菌抑制率的测定方法为：采用琼脂扩散法来测量菌株对幽门螺杆菌的抑菌活性。选择浓度为0.05 mg/mL的甲硝唑溶液为阳性对照，MRS液体培养基作为空白对照。
抑制幽门螺杆菌实验所采用的菌株为幽门螺杆菌SS1，幽门螺杆菌SS1培养基采用含5%脱纤维羊血（v/v）的哥伦比亚血琼脂培养基或液体培养基。幽门螺杆菌SS1培养条件为：微需氧条件（5%O2、10%CO2、85%N2），37℃培养72-96小时。幽门螺杆菌菌悬液的制备方式为在固体培养基培养72-96小时后，使用生理盐水冲洗菌落，并收集幽门螺杆菌悬液。
抑制幽门螺杆菌的备选乳酸菌为从健康人体肠道中筛选的乳酸菌，包含但不限于植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、乳双歧杆菌、干酪乳杆菌等42株。备选乳酸菌均采用MRS培养基进行培养，培养条件为37℃、静止培养8-16小时后，8000r/min离心15分钟，分别收集上清液和菌体沉淀，上清液离心2次，菌体沉淀用无菌生理盐水洗涤两次并获取菌体悬液。
取100μL幽门螺杆菌的菌悬液均匀涂布与不含抗生素的琼脂平板上，每孔加入100μL乳酸菌发酵上清液、乳酸菌菌悬液、阳性对照和空白对照等待测液体，然后置于37℃、微需氧环境下培养72-96小时，培养结束后测量抑菌圈直径。
显著抑制幽门螺旋杆菌生长的有8株乳酸菌，选择抑制能力最强的前4种菌株作为备选菌株，该4株乳酸菌抑菌情况如表1所示。由表1可知，MRS培养基对幽门螺旋杆菌无抑制作用，而乳酸菌的菌悬液和上清液对幽门螺旋杆菌均具有抑制作用，培养48h时，菌株DRTR的菌悬液抑菌圈直径达2.57±0.21cm以上，上清液的抑菌圈直径可达3.08±0.15cm以上；培养72h时，菌株DRTR的菌悬液抑菌圈直径达2.91±0.13以上，上清液的抑菌圈直径可达3.53±0.08以上，抑菌效果明显。
表1 抑制幽门螺旋杆菌情况
发酵上清液对幽门螺旋杆菌的抑制性说明乳酸菌发酵代谢产物中产生了能够抑制幽门螺杆菌成分，菌株DRTR的上清液抑菌能力最强，显示该菌株代谢成分抑制幽门螺旋杆菌效率更高或产抑制幽门螺旋杆菌能力更强。
实施例2
本实施例对实施例1中筛选的高抑菌率菌株进行耐酸、耐胆盐筛选。
将实施例1中具有显著高抑菌率的4株乳酸菌进行耐酸耐胆盐筛选，将测试菌株分别在MRS琼脂培养基含有0.3%牛胆汁盐和pH=3.5的MRS琼脂培养基上涂布对比培养，根据在两种琼脂培养基上菌落生长差异情况，筛选出高耐酸和胆汁盐的乳酸菌，最后再通过16SrRNA测序进行菌种准确性鉴定，最终通过综合评价其耐酸耐胆盐及抑制幽门螺杆菌能力，确定一株编号为DRTR的菌株。
表2 菌株在酸性及胆盐培养基上生长情况
由表2可知，在酸性和胆盐培养基上，各菌株的活性有所降低，主要原因是此种筛选方法虽然方便快捷，但由于培养时间长会导致菌株活性被显著抑制。但不难看出，菌株DRTR在酸性和胆盐培养基上的活性菌高于其他3株菌，结合实施例1，确定DRTR为具备高抑制油门螺旋杆菌，并有优良耐酸耐胆盐的目标菌株。
实施例3
本实施例对实施例2中筛选的高抑制幽门螺杆菌能力、耐酸耐胆盐的DRTR菌株进行纯化、及保存。
将实施例2中获得的DRTR菌株，在MRS琼脂培养机上进行划线培养48小时后，挑选光亮饱满的单菌落置于10mL液体MRS培养基中，37℃静置培养12-16小时，获得纯化菌液。取5mL纯化菌液按1:1体积加入30%-40%无菌甘油，充分混合后分装至2ml无菌冻存管，并置于4℃预冷2h，然后置于-20℃预冻4h，最后转至-80℃冰箱或液氮中保存。
实施例4
本实施例对实施例2中筛选的DRTR菌株进行形态鉴定及16S rRNA分子生物学鉴定，具体步骤如下：
（1）形态鉴定
取纯化菌液在显微镜下进行观察可知，细胞短，纤细或粗大，常为棒状杆菌，无分叉，菌株在MRS琼脂培养基上菌落为乳白色，呈半圆形凸起，表面光滑、湿润，边缘整齐。
（2）革兰氏染色
革兰氏染色结果显示为革兰氏阳性，菌体革兰氏染色特性如图1所示。
（3）16S rRNA序列的测定
利用已发表的16S通用引物（引物序列为：8F：5’-AGAFTTTGATCCTGGCTCA-3’；1510R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’），对菌株DRTR的16SrDNA基因序列进行扩增和测序，PCR扩增产物送上海生工生物工程股份有限公司进行测序鉴定。菌株DRTR的16SrDNA的核苷酸序列为序列表中的序列1；经过16SrDNA基因比对，与Genebank中的Lactobacillus reuteri菌株比对相似率达100％；结合微生物系统鉴定，DRTR菌株为一株罗伊氏乳杆菌，命名为罗伊氏乳杆菌DRTR (Lactobacillus reuteri DRTR)；罗伊氏乳杆菌的16SrDNA如SEQIDNO.1所示，生物进化树如图2所示。
对生物学鉴定的罗伊氏乳杆菌DRTR菌株进行典藏，该菌株于2020年10月19日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏编号CCTCC NO：M2020597，保藏地址为中华人民共和国湖北省武汉市武汉大学。
实施例5
本实施例为进一步证实实施例4中的罗伊氏乳杆菌DRTR拮抗幽门螺杆菌的能力。
为验证罗伊氏乳杆菌DRTR的活菌对在与幽门螺杆菌共同培养条件下的生长影响，并以瑞典拜奥（BioGaia）公司生产的罗伊氏乳杆菌DSM17938阳性对照，该菌株具有良好的益生功能。对抑制幽门螺杆菌生产和尿素酶活性的影响进行对比分析。
活化两代后新鲜的幽门螺杆菌SS1（1×108CFU/mL）重悬在含有5%脱纤维羊血（v/v）的哥伦比亚血琼脂培养基中，加入10%乳酸菌活细胞（1×108CFU/mL）。幽门螺杆菌SS1活菌数利用其选择性培养基计数，乳酸菌活菌数采用MRS培养基进行平板计数。
尿素酶活性采用比色法测定，取40μL幽门螺杆菌菌悬液分别与10μL乳酸菌的发酵上清液或菌悬液混匀，以10μL的无菌幽门螺杆菌液体培养基为对照。混合液加入至干净无菌的96孔板中，37℃微需氧环境培养24-48小时。将培养好的混合液体取出，每个孔内加入150μL的尿素酶试剂（0.9% NaCl，20 mmol/L尿素，14μg/mL苯酚红，用HCl调至pH为6.8），观察颜色变化并测定其OD550的数值。
DRTR菌株和DSM17648菌株活菌对幽门螺杆菌生长和尿素酶活性的影响如图3和图4所示。
从图中可以看出，随着时间延长，幽门螺杆菌SS1的活菌数下降。在24h时，DRTR和DSM17938都抑制幽门螺杆菌SS1生长和尿素酶活性作用；其中DRTR抑制幽门螺杆菌SS1生长和尿素酶活性的能力最强，抑菌率达到94.7%，尿素酶活性降低至53.8%。在72h时，DRTR抑制幽门螺杆菌SS1生长和尿素酶活性进一步增强，抑菌率达到96.5%，尿素酶活性降低至32.6%。DSM17938虽然能够抑制幽门螺杆菌SS1的尿素酶活性但也有所减弱，对其生长抑制性不显著。因此罗伊氏乳杆菌DRTR对幽门螺杆菌SS1的生长及尿素酶活性抑制能力显著优于罗伊氏乳杆菌DSM17938，显示出了良好的抑制幽门螺杆菌效果。
实施例6
本实施例为验证实施例4中罗伊氏乳杆菌DRTR菌株抑制幽门螺杆菌对人胃粘膜细胞GES-1粘附能力效果。具体方法如下：
在96孔板中，将培养至单层的细胞（104个/孔）用PBS液洗3次，加入0.05mL乳酸菌活菌或死菌（1×108CFU/mL用RPMI-1640重悬，死菌为85℃热灭活3h），在温度37℃、5%CO2的条件下培养1h，然后用PBS液洗3次，将未吸附的乳酸菌除去，再加入0.05mL幽门螺杆菌SS1（1×108CFU/mL用RPMI-1640重悬），继续在温度37℃与5%CO2培养箱的条件下培养2h；用PBS清洗5次后，加入200μL尿素酶试剂培养3h后，用酶标仪在波长550nm处测定其吸光值。阴性对照为只含有细胞的情况下测定OD值，阳性对照为用幽门螺杆菌和细胞共同存在时测定的OD值，并且以幽门螺杆菌的粘附力定义为100%。幽门螺杆菌的粘附力=（实验组OD–阴性对照OD）/（阳性对照OD–阴性对照OD）×100%。
罗伊氏乳杆菌DRTR与罗伊氏乳杆菌DSM17938抑制幽门螺旋杆菌粘附人胃粘膜细胞GES-1结果如图5所示。结果显示经过罗伊氏乳杆菌DRTR预先处理的GES-1能够显著降低幽门螺杆菌的粘附，活菌可降低幽门螺旋杆菌粘附力至36.2%，热灭活的DRTR可降低幽门螺旋杆菌粘附力至46.7%，且抑制幽门螺旋杆菌粘附的效果优于DSM17938。因此，所述罗伊氏乳杆菌DRTR能够通过降低幽门螺旋杆菌对人胃粘膜细胞的粘附力，大大降低幽门螺旋杆菌对人胃粘膜的粘附几率和数量，从而达到预防幽门螺杆菌感染的目的，其活菌或热灭活菌均可用于预防幽门螺杆菌感染。
实施例7
本实施例为验证实施例4中罗伊氏乳杆菌DRTR菌株清除幽门螺杆菌对人胃粘膜细胞GES-1粘附能力效果。
在96孔板中，将培养至单层的细胞（104个/孔）用PBS液洗3次，加入0.05mL幽门螺杆菌SS1（1×108CFU/mL用RPMI-1640重悬），在温度37℃、5%CO2的条件下培养2h，然后用PBS液洗3次，将未吸附的幽门螺杆菌除去，再加入0.05mL乳酸菌活菌或死菌（1×108CFU/mL用RPMI-1640重悬，死菌为85℃热灭活3h），继续在温度37℃与5%CO2培养箱的条件下培养1h；用PBS清洗5次后，加入200μL尿素酶试剂培养3h后，用酶标仪在波长550nm处测定其吸光值。阴性对照为只含有细胞的情况下测定OD值，阳性对照为用幽门螺杆菌和细胞共同存在时测定的OD值，并且以幽门螺杆菌的粘附力定义为100%。幽门螺杆菌的粘附力=（实验组OD–阴性对照OD）/（阳性对照OD–阴性对照OD）×100%。
罗伊氏乳杆菌DRTR与罗伊氏乳杆菌DSM17938抑制幽门螺旋杆菌粘附人胃粘膜细胞GES-1结果如图6所示。结果显示罗伊氏乳杆菌DRTR对已粘附于GES-1的幽门螺杆菌让然具有较强降低粘附作用，活菌可降低幽门螺旋杆菌粘附力至18.7%，热灭活的DRTR可降低幽门螺旋杆菌粘附力至19.6%，且降低幽门螺旋杆菌粘附的效果显著优于DSM17938。因此，罗伊氏乳杆菌DRTR活菌或热灭活菌均可用于对幽门螺杆菌感染后的清除。
实施例8
本实施例为实施例4中的罗伊氏乳杆菌DRTR进行规模发酵并制备冻干粉工艺。
为便于罗伊氏乳杆菌DRTR应用于抑制幽门螺杆菌，并且便于工业扩大培养，其冻干粉制备工艺为：
（1）培养基配置。
提供工业化高密度发酵罗伊氏乳杆菌DRTR培养基配置方案为：大豆蛋白胨10g/L，牛肉浸粉10g/L，酵母浸粉10g/L，无水葡萄糖40g/L，磷酸氢二钾3g/L，柠檬酸氢二胺2g/L，乙酸钠5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰1g/L，L-半胱胺酸盐酸盐1g/L，大豆磷脂1g/L进行配置，原料均采用食品级原料进行配置。
（2）液体培养
培养基配置后调节pH值为6.5，121℃灭菌15min，冷却至38℃-39℃时，按3%-15%接种量，优选为12%进行发酵罐接种培养，培养温度为36℃-39℃，pH值为5.5-6.5，发酵过程中发酵液通氮气，慢速搅拌。
（3）离心
培养8-12小时，活菌量达到108CFU/mL-1010CFU/mL，根据OD600值测得生长曲线进入平台期后快速将发酵液降温至15℃以下，使用管式离心机5000rpm进行离心，收获菌泥。
（4）保护剂乳化及冻干
收获菌泥稀释为含水量60%-80%，等体积加入菌泥保护剂进行乳化；菌泥保护剂成分为：水70%，脱脂乳粉10%，蔗糖5%，甘露糖醇5%，吐温-80 2%，甜菜碱2%，谷氨酸钠1%，可溶性淀粉5%。搅拌均匀后装入真空冷冻干燥机进行冷冻真空干燥，冻干物料厚度≤1cm。冻干机温度曲线为：-50℃保持4h，每隔2h温度提高5℃，到第24h时温度温度为0℃，之后每隔2h温度提高3℃，最终最高温度为30℃保持不变，直至物料干燥，物料干燥的特点为水分含量低于5%，水活度在0.11-0.22aw。
冻干后的菌粉活性可达6.8×1011CFU/g，可便于存放。也便于用于制备预防/抑制幽门螺杆菌感染的制剂使用。
实施例9
本实施例基于实施例8制备的高活性罗伊氏乳杆菌DRTR冻干粉，制备一种幽门螺杆菌抑制剂或幽门螺杆菌感染预防剂，所述制剂通过以下方法制备：
抑制幽门螺杆菌制剂包含实施例8中制备的罗伊氏乳杆菌DRTR冻干粉5.0×109CFU至5.0×1010CFU，其他辅料为益生元、植物提取物或其他固体可与益生菌冻干粉混合食用的成分。可制成1g-10g的小包装单元便于食用。
实施例10
本实施例验证实施例7的罗伊氏乳杆菌DRTR冻干粉在模拟胃部环境条件下对幽门螺杆菌生长抑制作用。
为充分测试不同胃部条件下罗伊氏乳杆菌DRTR对幽门螺杆菌生长的抑制情况，分别设置空胃条件和标准健康饮食后胃部条件。空胃条件下胃部环境近似模拟为：调节pH为3.0的无菌生理盐水溶液（0.9% w/v），添加0.165%（w/v）胃蛋白酶、0.043%（w/v）淀粉酶，达到0.6mM的最终浓度。标准健康饮食后胃部条件近似模拟为：60% w/v碳水化合物（50% 蔗糖和50%小麦粉）、25% w/v脂质（植物油）、15% w/v蛋白质（酪蛋白胨）、0.165%（w/v）胃蛋白酶、0.043%（w/v）淀粉酶，达到0.6mM的最终浓度，调节pH值为3.0。空白对照为pH值为7.0的生理盐水溶液。
将罗伊氏乳杆菌DRTR冻干粉制备的幽门螺杆菌抑制剂重悬于生理盐水中（活菌浓度1.6×109CFU/mL）作为干预菌液（GY）。同时将幽门螺杆菌SS1在37℃微需氧环境下培养72-96小时后，将菌落悬浮在盐水溶液（活菌浓度0.2×109CFU/mL）作为被干预菌液（BG）。各实验组设置如下：
表3罗伊氏乳杆菌DRTR在模拟胃部环境条件下对幽门螺杆菌生长抑制作用实验分组
各实验组设3组重复，置于37℃微需氧环境摇床上进行培养，摇床震荡频率为150rpm。为了评估罗伊氏乳杆菌DRTR制剂对幽门螺杆菌在胃模拟试验中的生存能力，在0、0.5、1、1.5和2.5小时分别从每个实验组取样，在选择培养基上进行培养计数。结果如图7所示。
从图7中可以看出，在模拟空胃条件下和标准健康饮食后胃部条件下罗伊氏乳杆菌DRTR与幽门螺杆菌混合培养可以显著抑制幽门螺杆菌活性。在空胃条件下培养0.5h后可以使幽门螺杆菌失活率达90%以上，在2.5h时甚至可以使其全部失活，因此显示出了罗伊氏乳杆菌在胃部环境下能够显著抑制幽门螺杆菌。
罗伊氏乳杆菌DRTR在标准健康饮食后胃部条件下对幽门螺杆菌的抑制弱于空胃条件下对幽门螺杆菌的抑制，因此使用罗伊氏乳杆菌DRTR进行抑制胃部幽门螺杆菌时，空胃/空腹食用或餐前食用效果优于餐后食用。
实施例11
本实施例验证实施例7的罗伊氏乳杆菌DRTR冻干粉制剂对根除三联疗法抗幽门螺杆菌根除率的影响及缓解其副作用的功效。
共选择62名幽门螺旋杆菌阳性患者，随机分为2组，A组接受三联疗法（奥美拉唑＋阿莫西林＋甲硝唑）作为对照，B组接受三联疗法同时，每天早晚各补充罗伊氏乳杆菌DRTR冻干粉制剂一次（2.0×1010CFU/次，用抗生素之前2h或之后2h食用）。每位受试者每日均填写情况记录表，连续治疗14天后评估幽门螺旋杆菌根除状态及副作用情况。根除标准为采用碳13尿素呼气试验DOB值＜4。最终记录信息完整的受试者为47人，其中A组21人，B组26人，补充罗伊氏乳杆菌DRTR对三联疗法根除幽门螺旋杆菌结果如表4所示，补充罗伊氏乳杆菌DRTR对三联疗法根除幽门螺旋杆菌的副作用影响如表5所示。
表4 补充罗伊氏乳杆菌DRTR对三联疗法根除幽门螺旋杆菌影响
表5 补充罗伊氏乳杆菌DRTR对三联疗法根除幽门螺旋杆菌的副作用影响
从表4中可以看出，补充罗伊氏乳杆菌DRTR可以将三联疗法根除率从52.4%提升至76.9%，且具有显著性。从表5结果中可以看出，三联疗法根除幽门螺杆菌感染具有很强的副作用，恶心、便秘/腹泻、腹痛发生率极高，补充罗伊氏乳杆菌DRTR可以显著降低三联疗法导致的恶心（从100%降低至42.3%）、便秘/腹泻（从95.2%降低至46.2%）、腹痛的发生率（从76.2%降低至42.3%），显示出罗伊氏乳杆菌DRTR菌株在辅助治疗幽门螺旋杆菌感染上的巨大优势。
综上所述，本发明提供了一种抗幽门螺杆菌感染的罗伊氏乳杆菌，所述罗伊氏乳杆菌具有良好的耐胃酸能力，可以抑制幽门螺杆菌的增殖和尿素酶活性；将其制成相应的抑制幽门螺杆菌感染的产品，不会引起不良反应，也不会影响肠道微生物的菌群平衡，同时也避免了因使用抗生素而使幽门螺杆菌等病原菌产生耐药性，具有应用于生产实际中的价值。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 南京益瑞兰生物科技有限公司
<120> 一种抗幽门螺杆菌感染的罗伊氏乳杆菌及其应用
<141> 2022-04-11
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1480
<212> DNA
<213> 罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)
<400> 1
ttgggggggg gtgctataca tgcagtcgta cgcactggcc caactgattg atggtgcttg 60
cacctgattg acgatggatc accagtgagt ggcggacggg tgagtaacac gtaggtaacc 120
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ctaaccatta tggagggagc cgcctaagcg accagatatc 1480
Claims (10)
1.一种罗伊氏乳杆菌，其特征在于，经鉴定为罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri），菌株名为DRTR，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2020年10月19日，保藏编号为CCTCC NO：M2020597。
2.权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌在制备抗幽门螺杆菌感染药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌为活菌或热灭活菌。
4.权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌在制备食品中的应用。
5.一种组合物，包含权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌。
6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌、药物载体和/或药用辅料。
7.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌和食用辅料。
8.权利要求5所述的组合物在制备抗幽门螺杆菌感染药物中的应用。
9.权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌联合抗生素在制备抗幽门螺杆菌感染药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述抗生素包括奥美拉唑、阿莫西林和甲硝唑。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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