CN114561313A - 格氏乳杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri，LG‑7)及其应用。本发明的格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri，LG‑7)保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO.61710。本发明的格氏乳杆菌能有效抑制幽门螺杆菌生长，并能长期定植于胃内。具有极强的耐酸能力和胃内高度增殖能力，解决了目前研究中的菌株多为粪便和乳制品来源，不能耐受胃部极端环境，难以在胃内定植，且抑菌效果不稳定的难题。

Description

格氏乳杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及格氏乳杆菌及其应用。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是一种螺旋形、微需氧、对生长条件要求十分苛刻的细菌。1983年首次从慢性活动性胃炎患者的胃黏膜活检组织中分离成功。2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单中，幽门螺杆菌被列为一类致癌物。幽门螺杆菌定殖在胃粘膜表面和十二指肠部位，是最主要的流行性致病菌之一，其在全球人群中的检出率已经超过 50％，在发达国家，成年人幽门螺杆菌的感染率约为30～40％，在发展中国家，成年人幽门螺杆菌的感染率高达80～90％左右。
在1997-2007十年间，标准三联疗法都被认为是最为有效的医治方案。但随着该疗法的普及以及抗菌药的普遍应用甚至滥用，持续增长的抗生素耐药性令其失去了原有的优越疗效；其他医治方法中，不论基于质子泵的三联法，抑或联合铋剂的四联法，都至少涉及到两种抗菌药，在长期的使用过程中易引起幽门螺杆菌抗药。而且上述治疗方法常常会出现严重副作用(如腹痛、恶心、腹泻等)，致使患者依从性差，同时幽门螺杆菌耐药株的产生进一步增加了治疗难度。幽门螺杆菌对抗生素的抗药以及接连不断的医治失败最初发现于1990年，目前已经成为全球性问题。另外，幽门螺杆菌在抗生素和体内不利因素的诱导下可形成细胞壁缺陷的L型，这也是临床上幽门螺杆菌感染治愈后易复发的主要因素之一，随之导致的多次诊治也使患者的心理与经济压力加剧。与此同时，研究发现幽门螺杆菌感染不仅能引起胃十二指肠的病变，还与血液系统、循环系统、神经系统等多个系统疾病有关，因此，迫切需要一种药物或治疗方式提高幽门螺杆菌临床治疗的效果且不会使幽门螺杆菌产生耐药性，同时提高患者的依从性。
传统疗法出现的诸多问题，使得寻求天然、无毒害的非抗生素药物从而控制耐药性的迅速升高，研究简单高效、疗程短、副作用少的疗法成为当务之急。近年来，研究者主要在探索一些非抗生素物质抗幽门螺杆菌感染的作用效果，如益生菌、益生元、植物提取物、生物活性蛋白、多糖等。乳杆菌因其良好的益生特性、安全性和拮抗幽门螺杆菌效果而被广泛研究。乳杆菌能抵抗胃酸并通过降低脲酶活性来抑制幽门螺杆菌的生长与粘附。但是目前研究中的菌株多为粪便和乳制品来源，难以在胃内定植，且抑菌效果不稳定。
发明内容
基于此，本发明的目的是提供一种格氏乳杆菌及其应用。
具体技术方案如下：
一种格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)LG-7，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO. 61710。
本发明还提供一种上述的格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)LG-7、或上述的格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)LG-7的培养物或代谢产物在制备预防和/或治疗幽门螺杆菌感染的药物中的应用。
本发明还提供一种上述的格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)LG-7、或上述的格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)LG-7的培养物或代谢产物在制备预防和/或治疗幽门螺杆菌感染引起的胃肠道疾病的药物中的应用。
在其中一些实施例中，所述胃肠道疾病为胃溃疡、胃炎或胃癌。
在其中一些实施例中，所述胃肠道疾病为十二指肠溃疡。
本发明还提供一种上述的格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)LG-7、或上述的格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)LG-7的培养物或代谢产物在非诊断、非治疗目的地抑制幽门螺杆菌中的应用。
本发明还提供一种上述格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)LG-7的培养物或代谢产物。
本发明还提供一种产品，其活性成分包括上述的格氏乳杆菌(Lactobacillusgasseri)LG-7，或者其活性成分包括上述的格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)LG- 7的培养物或代谢产物。
本发明还提供一种制幽门螺杆菌生长的方法，其包括向幽门螺杆菌施用上述的格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)LG-7，或者所述方法包括向幽门螺杆菌施用上述格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)LG-7的培养物或代谢产物。
本发明所述的格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)LG-7，分类命名为Lactobacillus gasseri，已于2021年8月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61710，保藏单位地址：广州市先烈中路100号大院 59号楼5楼广东省微生物研究所。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)LG-7及其培养物或代谢产物能有效抑制幽门螺杆菌生长。并且格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)LG-7能长期定植于胃内，对胃上皮细胞GSE-1细胞具有较强的黏附特性，具有很强的耐酸能力和胃内高度增殖能力，解决了目前研究中的菌株多为粪便和乳制品来源，不能耐受胃部极端环境，难以在胃内定植，且抑菌效果不稳定的难题。
附图说明
图1：为实施例1中格氏乳杆菌LG-7的革兰氏染色结果；
图2：为实施例1中格氏乳杆菌LG-7的生长曲线；
图3：为实施例1中格氏乳杆菌LG-7的生化鉴定结果；
图4：为实施例1中格氏乳杆菌LG-7的系统发育树；
图5：为实施例2中格氏乳杆菌LG-7及格氏乳杆菌标准菌株等在不同pH 的人工胃液中的存活量(乳酸杆菌在不同pH值下的生长情况)；
图6：为实施例2中格氏乳杆菌LG-7及格氏乳杆菌标准菌株等在不同pH 的人工胃液中的存活率；
图7：为实施例3中格氏乳杆菌LG-7及格氏乳杆菌标准菌株等的菌液、上清、菌体对幽门螺杆菌的抑菌圈；
图8：为实施例4中格氏乳杆菌LG-7及格氏乳杆菌标准菌株等粘附GES-1 细胞的粘附率；
图9：为实施例5中格氏乳杆菌LG-7及格氏乳杆菌标准菌株等产酸降低培养液PH能力测定；
图10为实施例6中格氏乳杆菌LG-7产短链脂肪酸能力测定；
图11为实施例7中格氏乳杆菌LG-7在小鼠胃内的定植能力的活体成像测定；
图12为实施例7中格氏乳杆菌LG-7在小鼠胃内的定植能力的离体成像测定；
图13为实施例8中格氏乳杆菌LG-7干预后小鼠胃粘膜快速尿素酶检测结果；
图14为实施例8中格氏乳杆菌LG-7干预后小鼠胃粘膜组织HE染色结果。
具体实施方式
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
本发明提供了一株人胃来源的格氏乳杆菌格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)LG-7，本发明的格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)LG-7能够抑制幽门螺杆菌，具体体现在：
(1)格氏乳杆菌LG-7菌液对幽门螺杆菌的抑菌圈直径可达19.50±0.71mm；
(2)格氏乳杆菌LG-7上清液对幽门螺杆菌的抑菌圈直径可达20.50± 0.71mm；
(3)格氏乳杆菌LG-7对胃上皮细胞GSE-1细胞具有较强的黏附特性；
(4)通过活体成像检测，格氏乳杆菌LG-7能够在C57小鼠胃内定植24h 以上；
(5)格氏乳杆菌LG-7，具有极强的耐酸能力，能够耐受PH＝2的环境，甚至在PH＝1.5人工胃液中两小时后仍然存活。
(6)格氏乳杆菌LG-7可在体外培养时将培养基肉汤PH值从7.2降低至 4.0，说明其具有较强产酸能力，实现抑制幽门螺杆菌。
(7)格氏乳杆菌LG-7可抑制幽门螺杆菌从而有效缓解幽门螺杆菌相关胃炎小鼠的胃部炎症。
本发明的格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)LG-7来源于人的胃黏膜组织，而人胃黏膜来源的菌株天然定植于胃黏膜，具有极强的耐酸能力和胃内高度增殖能力，解决了目前研究中的菌株多为粪便和乳制品来源，不能耐受胃部极端环境，难以在胃内定植，且抑菌效果不稳定的难题。
益生菌具有安全、无副作用等特点，格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)是益生菌的一种，目前已被纳入卫生部下发的《可用于食品的菌种名单》，可见，本发明的有效成分为格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)LG-7的产品不会使得幽门螺杆菌产生耐药性，同时，在治疗过程中不会导致患者产生不良反应。
以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
下述实施例中涉及的幽门螺杆菌为来源于NTCC国家典型培养物保藏中心的幽门螺杆菌SS1；下述实施例中涉及的鼠李糖乳杆菌LGG为鼠李糖乳杆菌 ATCC 53103，来源于美国模式培养物集存库(ATCC)，保藏编号为ATCC 53103，下述实施例中涉及的格氏乳杆菌ATCC 33323来源于美国模式培养物集存库(ATCC)，保藏编号为ATCC 33323。下述实施例中涉及的LG-1～6及LG8均为本研究的健康人群的胃黏膜组织分离菌。
下述实施例中涉及的培养基如下：
MRS固体培养基(g/L)：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K 2 PO 4·3H 2 O 2.6g/L、MgSO 4 ·7H 2 O 0.1g/L、MnSO4 0.05g/L、吐温801mL/L、琼脂20g/L。
MRS液体培养基(g/L)：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K 2 PO 4·3H 2 O 2.6g/L、MgSO 4 ·7H 2 O 0.1g/L、MnSO4 0.05g/L、吐温801mL/L。
实施例1格氏乳杆菌LG-7的分离筛选鉴定
1.乳杆菌的分离筛选
(1)以来源于健康人群的胃黏膜组织为样本，胃镜下用活检钳取胃黏膜组织，研磨棒研碎后涂布于MRS固体培养基，置于37℃恒温厌氧或好氧培养箱中培养24h。
(2)培养后根据菌落的颜色、大小、边缘形状等，用接种环挑取菌落划线纯化。
(3)所得菌落进行革兰氏染色，保留革兰氏染色阳性杆菌，格氏乳杆菌LG- 7的革兰氏染色图片如图1。
(4)测定28h生长曲线，格氏乳杆菌LG-7的生长曲线如图2示。
(5)生化鉴定，格氏乳杆菌LG-7的生化鉴定结果如图3所示。
2.乳杆菌的分子生物学鉴定
(一)单菌基因组抽提；
(A)将步骤(1)所筛选得到的格氏乳杆菌LG-7培养过夜；
(B)培养过夜的菌悬液1mL于1.5mL离心管，10000r/min离心2min，弃上清得菌体；
(C)加入溶菌酶溶液进行破壁处理，具体方法为：加入110μl缓冲液(20 mM Tris,pH 8.0；2mM Na 2-EDTA；1.2％Triton)，和70μl溶菌酶溶液，37℃处理30min以上。
(D)向管中加入20μl Proteinase K溶液，混匀。
(E)加入220μl缓冲液GB，振荡15sec，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
(F)加220μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
(G)将步骤(F)所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱 CB3放入收集管中。
(H)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3 放入收集管中。
(I)向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。
(J)重复操作步骤(I)。
(K)吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
(L)吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2 min，将溶液收集到离心管中。
(2)16S rDNA PCR
(A)细菌16S rDNA 20μLPCR反应体系
通用引物27F，1μL；通用引物1492R，1μL；Taq酶，10μL；模板，2 μL；ddH 2 O，6μL。
(B)PCR条件
95℃5min；95℃10s；55℃30s；72℃30s；step2-4 30×；72℃5min；12℃ 2min。
(C)备1％琼脂糖凝胶，之后将PCR产物与10000×loading buffer混合，上样量2μL，120V跑30min，然后进行凝胶成像；
(D)将得到PCR产物送专业测序公司，在美国国家生物技术信息中心 (nationalcenter for biotechnology information，NCBI)将得到的测序结果利用 BLAST在GenBank中进行搜索和相似性比对，并利用MAGE7.0软件做格氏乳杆菌LG-7系统发育树。
(E)将鉴定为格氏乳杆菌的菌株-80℃保存。
测序结果：格氏乳杆菌LG-7的16S rDNA序列包括以下的SEQIDNO.1和 SEQIDNO.2：
CACCCGGGGGGGGGGTGCCTAATACATGCAGTCGAGCGAGCTTGCCT AGATGAATTTGGTGCTTGCACCAAATGAAACTAGATACAAGCGAGCGGCG GACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCAAGAGACTGGGATAACACC TGGAAACAGATGCTAATACCGGATAACAACACTAGACGCATGTCTAGAGTT TAAAAGATGGTTCTGCTATCACTCTTGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTA GTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCAATGATGCATAGCCGAGTTGAGA GACTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAG GCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGC CGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGGTAGTGAAG AAAGATAGAGGTAGTAACTGGCCTTTATTTGACGGTAATTACTTAGAAAGT CACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGT TGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGTGCAGGCGGTTCAATAAGTCTGA TGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGGAGAATTGCATCAGAAACTGTTGAACT TGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTA GATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGCAACTG ACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTA GTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGGAGGTTTCCGCCTCTCA GTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAGG GTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTG (SEQIDNO.1)。
CCCCGGGTCCTTCCTTAGACGGCTGACTCCTATAAAGGTTATCCCACC GGCTTTGGGTGTTACAGACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGG CCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCC AGCTTCGTGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAGTCCGAACTGAGAACGGCTTT CAGAGATCCGCTTGCCTTCGCAGGTTCGCTTCTCGTTGTACCGTCCATTGTA GCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCATCCCC ACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCATTAGAGTGCCCAACTTAATG ATGGCAACTAATGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATC TCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCACCACCTGTCTCAGCGTCCCCG AAGGGAACTCCTAATCTCTTAGGTTTGCACTGGATGTCAAGACCTGGTAAG GTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGC CCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGA GTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAGAGGCGGAAACCTCCCAACACT TAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCT ACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTGCAGACCAGAGAGCCGCCTTC GCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTCCACCGCTACACATGGAGTT CCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCAACAGTTTCTGATGCAATTCTCCG GTTGAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACTTATTGAACCGCCTGCACTCGCTT TACGCCCAATAATCCGGACACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCT GGCACGTAGTTAGCCGTGACTTTCTAAGTAATTACCGTCAAATAAAAGGCC AGTTACTACCT(SEQIDNO.2)。
实验结果：如图4为格氏乳杆菌LG-7的系统发育树。
本发明的格氏乳杆菌LG-7具有如下特性：
(1)菌体特征：呈革兰氏染色阳性，不形成孢子，非运动性的细菌；
(2)菌落特征：呈乳白色、圆形、凸起，表面光滑、湿润且边缘不整齐；
(3)生长特性：37℃恒温厌氧或需氧条件下，在MRS培养基培养约14h到达对数末期；
(4)菌株特性：糖发酵与格氏乳杆菌标准株ATCC33323一致；
(5)药物敏感性：对青霉素、先锋霉素敏感，对庆大霉素耐药。
(6)耐酸特性：对人工胃液具有较强耐受能力，可在PH1.5条件下存活。
(7)黏附特性：对GSE-1细胞具有较强的粘附能力。
(8)胃内定植特性：可定植于胃内24h以上。
(9)对幽门螺杆菌有较强抑制能力。
实施例2：格氏乳杆菌LG-7对人工胃液具有良好的耐受性
(1)将冷冻保存的格氏乳杆菌LG-7接种于MRS培养基中，在温度37℃好氧环境培养24h，再经MRS培养液传代培养2～3次后。
(2)取1ml格氏乳杆菌LG-7培养液8000×g离心2min收集菌体、用PBS 重悬至调整OD600值为1。
(3)分别取10ul步骤(2)所得重悬液加到990ul的PBS和PH＝1、 PH＝1.5PH＝2、PH＝3、PH＝4的人工胃液，得到原液。
(4)将原液于37℃下培养，分别在0h、2h时取样，倍比稀释后涂布于MRS 琼脂平板，置于37℃下培养,24h后进行平板菌落计数，测定活菌数并计算其存活量和存活率。存活率(％)以该培养液中在取样时的活菌数与在第0h时活菌数之比计算。
实验结果：如图5所示为格氏乳杆菌LG-7及格氏乳杆菌标准菌株等在不同pH的人工胃液中的存活量。如图6所示为格氏乳杆菌LG-7及格氏乳杆菌标准菌株等在不同pH的人工胃液中的存活率。结果显示与格氏乳杆菌 ATCC33323、鼠李糖乳杆菌ATCC 53103及其他菌株相比，格氏乳杆菌LG-7 表现出极强的耐酸能力。
实施例3：格氏乳杆菌LG-7对幽门螺杆菌具有较强的的抑制能力。
(1)将格氏乳杆菌LG-7划线于MRS固体培养基上，37℃条件下培养 24h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；
(2)将活化液调整至OD600＝1后按2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养24h，得到菌液；菌液经8000g离心2min得到上清液和菌体，取上清液备用，并分别用PBS和剩余上清液将菌体调整至OD600＝1备用；
(3)分别取步骤2中获得的上清液、PBS重悬的菌体、上清液重悬的菌体用牛津杯法测定抑制幽门螺杆菌生长的效果。
实验结果：如图7所示，从左到右为格氏乳杆菌LG-7菌液(上清液重悬的菌体)、上清液、菌体(PBS重悬的菌体)的抑菌圈。其中菌液和上清液出现明显的抑菌圈。如表1所示，格氏乳杆菌LG-7菌液对幽门螺杆菌的抑菌圈大小可达19.50±0.71mm，格氏乳杆菌LG-7上清液对幽门螺杆菌的抑菌圈大小可达20.50±0.71mm，表明格氏乳杆菌LG-7具有抑制幽门螺杆菌生长的作用，且其抑菌作用比格氏乳杆菌标准菌株更强。
表1乳酸杆菌对幽门螺杆菌的抑菌圈直径
Figure RE-GDA0003332632670000111
实施例4：格氏乳杆菌LG-7具有较强的GES-1细胞(人胃粘膜上皮细胞) 粘附能力。
(1)将GES-1消化后计数，以1-2x104个/ml为浓度，铺种12孔板，1ml/ well，用含胎牛血清的1640培养至细胞长至单层。
(2)以MRS肉汤于37℃孵箱中培养格氏乳杆菌LG-7，24小时后取出， 12000rpm，室温离心5min。以PBS重悬至OD600＝1，此时格氏乳杆菌LG-7 浓度约为109CFU/ml；
(3)细菌重悬后，以终浓度107CFU/ml加入12孔板，每个浓度比加3 孔，将12孔板放入37℃培养箱培养；
(4)分别在放入培养箱培养2小时后，取出培养板，吸走培养液，以 PBS洗板3次。最后一次将PBS全部吸除干净。
(5)每孔加入200ul去离子水，浸泡20min以裂解细胞。用细胞刮轻轻刮板孔的培养面，然后用吸管反复吹打使细胞完全破裂，并使悬液均匀。
(6)以去离子水为稀释液，以10倍为梯度，将细胞破裂后的悬液等比稀释。
(7)各取20ul涂布于MRS固体平板，过夜培养。
(8)计数，计算黏附率。
实验结果：如图8所示，格式乳杆菌LG-7对GES-1有较强的黏附能力，保障了格式乳杆菌LG-7在胃内的定植。
实施例5：格氏乳杆菌LG-7能产酸从而显著降低培养液pH。
(1)将格氏乳杆菌LG-7划线于MRS固体培养基上，37℃条件下培养24h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；
(2)将活化液调整至OD600＝1后按2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养。
(3)分别在第0、4、8、12、18、24、30、36、48小时，测培养液pH值。
实验结果：如图9所示为格氏乳杆菌LG-7降低培养液pH结果，在第8个小时，格氏乳杆菌LG-7即可将培养液pH值显著降低，在第12小时降到较低水平，体现出其极强的产酸能力和抑制幽门螺杆菌生长的潜力。
实施例6：格氏乳杆菌LG-7具有较强产短链脂肪酸能力。
(1)取调至OD600＝1的格氏乳杆菌LG-7菌液100ul加到8ml MRS肉汤培养基中培养24h，取菌悬液1mL于1.5mL离心管，10000r/min离心2min，取上清100ul，加入5ul内标(IS)，5ul去离子水，150ul甲醇，40ul 2.5％H2SO， 0.05g无水硫酸钠，涡旋1.5min，离心(14000rpm，室温，5min)；取上清于装有衬管的进样小瓶，待测。
(2)配制随行空白样本：取100ul生理盐水，加入5ul内标(IS)，5ul去离子水，150ul甲醇，40ul 2.5％H2SO，0.05g无水硫酸钠，涡旋1.5min，离心 (14000rpm，室温，5min)，步骤同样本处理。
(3)配制质控样本：取100ul生理盐水，加入5ul内标(IS)，5ul STD- 4,150ul甲醇，40ul 2.5％H2SO，0.05g无水硫酸钠，涡旋1.5min，离心 (14000rpm，室温，5min)，步骤同样本处理。
(4)气相色谱—质谱(GC-MS)格氏乳杆菌LG-7测定短链脂肪酸含量。
实验结果：如图10所示，格氏乳杆菌LG-7表现出较好的产短链脂肪酸能力，尤其丙酸、丁酸、庚酸产量较高。
实施例7:格氏乳杆菌LG-7能够在C57小鼠胃内长时间定植。
(1)母液配制
clickA偶联剂+500ulDMSO即为clickA母液；
clickB燃料DIBO+100ulDMSO即为clickB母液。
(2)使用液配制
clickA：取10ul母液加DMSO配至1ml得到稀释液，再取100ul配至480ul即得到使用浓度50uM；
clickB：取2ul母液加DMSO配至1ml得道使用浓度50uM。
(3)菌与使用液共培养。
(A)培养50ml菌液：100ul实施例3所述调整至OD600＝1的格氏乳杆菌 LG-7活化液+50mlMRS肉汤培养基培养24h
(B)每次加入200ul clickA后再避光培养24h后取1ml重悬，之后PBS洗一遍，再用1mlPBS重悬。
(C)每管加入5ul clickB后再37℃避光培养1h即可用于灌胃。
(D)将灌胃后的小鼠分别在第0.5、2、4、8、12、24小时利用多模式小动物活体成像系统(FX Pro)进行成像。
实验结果：如图11为格氏乳杆菌LG-7在小鼠胃内的定植能力的活体成像结果，图12为格氏乳杆菌LG-7在小鼠胃内的定植能力的离体成像测定结果，在格氏乳杆菌LG-7进入小鼠体内24小时后，胃部仍有大量定植，相较于标准株和其他株显示出极强的定植能力，保障了其对幽门螺杆菌起到抑制作用。
实施例8:格氏乳杆菌LG-7能抑制幽门螺杆菌从而有效缓解幽门螺杆菌相关胃炎。
4周龄C57BL/6小鼠43只，正常饲养一周后随机分成五组：control组 (n＝8)，HP(H.pylori)组(n＝8)，HP+LG7组(n＝9)，HP+LGG组(n＝9)。
第1至3天，各组小鼠于晨8时禁食，4小时后三联混合抗生素(氨苄青霉素2.75mg+阿奇霉素2.75mg+庆大霉素0.3mg)0.25ml灌胃，间隔2小时再次三联混合抗生素0.25ml灌胃，4小时后control组和HP组灌胃空白MRS肉汤0.3ml，LG7组、LGG组分别灌胃OD＝1的LG7、LGG肉汤0.3ml，解除禁水禁食。
第4天，各组小鼠于晨8时禁食，2小时后予0.08ml 50％乙醇灌胃，间隔 2小时control组和HP组灌胃空白MRS肉汤0.3ml，LG7组、LGG组分别灌胃 OD＝1的LG7、LGG肉汤0.3ml；6小时后control组灌胃空白HP肉汤0.3ml，其他组均灌胃OD＝1新鲜HP混悬液0.3m，解除禁水禁食。
第5-32天，各组小鼠于晨8时禁食，4小时后control组和HP组灌胃空白MRS肉汤0.3ml，LG7组、LGG组分别灌胃OD＝1的LG7、LGG肉汤0.3ml；间隔6小时control组灌胃空白HP肉汤0.3ml，其他组均灌胃OD＝1新鲜HP混悬液0.3m，解除禁水禁食。
第32-59天，各组小鼠于晨8时禁食，4小时后，control组和HP组灌胃空白MRS肉汤0.3ml，LG7组、LGG组分别灌胃OD＝1的LG7、LGG肉汤0.3ml，解除禁水禁食。
第62天解剖检测各项指标。
实验结果：HP组胃黏膜组织涂板后分离出大量幽门螺杆菌，说明幽门螺杆菌已在小鼠体内长期定植，造模成功。如图13所示为各组小鼠胃黏膜组织快速尿素酶检测结果，其中对照组与LGG、LG-7干预组结果均为阴性，而HP 组呈现强阳性，说明LG-7在小鼠体内能够显著抑制幽门螺杆菌。如图14所示为LG-7干预后小鼠胃粘膜组织HE染色结果，提示H.pylori组出现囊性变、萎缩，炎症浸润黏膜全层及固有层上1/3，而利用乳杆菌LG-07干预后炎症细胞浸润症状可显著缓解。说明格氏乳杆菌LG-7能够抑制幽门螺杆菌从而减轻幽门螺杆菌相关胃炎。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州维生君生物科技有限公司
<120> 格氏乳杆菌及其应用
<130> 2021-08-26
<150> 2021108090025
<151> 2021-07-16
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 944
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
cacccggggg gggggtgcct aatacatgca gtcgagcgag cttgcctaga tgaatttggt 60
gcttgcacca aatgaaacta gatacaagcg agcggcggac gggtgagtaa cacgtgggta 120
acctgcccaa gagactggga taacacctgg aaacagatgc taataccgga taacaacact 180
agacgcatgt ctagagttta aaagatggtt ctgctatcac tcttggatgg acctgcggtg 240
cattagctag ttggtaaggt aacggcttac caaggcaatg atgcatagcc gagttgagag 300
actgatcggc cacattggga ctgagacacg gcccaaactc ctacgggagg cagcagtagg 360
gaatcttcca caatggacgc aagtctgatg gagcaacgcc gcgtgagtga agaagggttt 420
cggctcgtaa agctctgttg gtagtgaaga aagatagagg tagtaactgg cctttatttg 480
acggtaatta cttagaaagt cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg 540
tggcaagcgt tgtccggatt tattgggcgt aaagcgagtg caggcggttc aataagtctg 600
atgtgaaagc cttcggctca accggagaat tgcatcagaa actgttgaac ttgagtgcag 660
aagaggagag tggaactcca tgtgtagcgg tggaatgcgt agatatatgg aagaacacca 720
gtggcgaagg cggctctctg gtctgcaact gacgctgagg ctcgaaagca tgggtagcga 780
acaggattag ataccctggt agtccatgcc gtaaacgatg agtgctaagt gttgggaggt 840
ttccgcctct cagtgctgca gctaacgcat taagcactcc gcctggggag tacgaccgca 900
gggttgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtg 944
<210> 2
<211> 1026
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
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tacagactct catggtgtga cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcgg 120
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tgctggcacg tagttagccg tgactttcta agtaattacc gtcaaataaa aggccagtta 1020
ctacct 1026

Claims (10)

1.一种格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)LG-7，其保藏编号为GDMCC NO. 61710。
2.权利要求1所述格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)LG-7、或者权利要求1所述格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)LG-7的培养物或代谢产物在制备预防和/或治疗幽门螺杆菌感染的药物中的应用。
3.权利要求1所述格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)LG-7、或者权利要求1所述格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)LG-7的培养物或代谢产物在制备预防和/或治疗幽门螺杆菌感染引起的胃肠道疾病的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述胃肠道疾病为胃溃疡、胃炎或胃癌。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述胃肠道疾病为十二指肠溃疡。
6.权利要求1所述格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)LG-7、或者权利要求1所述格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)LG-7的培养物或代谢产物在非诊断、非治疗目的地抑制幽门螺杆菌中的应用。
7.权利要求1所述格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)LG-7的培养物或代谢产物。
8.一种产品，其特征在于，包括活性成分和辅料，所述活性成分包括权利要求1所述格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)LG-7，或者所述活性成分包括权利要求7所述格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)LG-7的培养物或代谢产物。
9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于，所述产品为药品、食品或保健品。
10.一种非诊断、非治疗目的地抑制幽门螺杆菌生长的方法，其特征在于，所述方法包括：向幽门螺杆菌施用权利要求1所述格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)LG-7；或者所述方法包括向幽门螺杆菌施用权利要求7所述格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)LG-7的培养物或代谢产物。
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