CN114891675B - 胃源性植物乳杆菌lpf-01及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)LPF‑01及其应用，所述胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)LPF‑01的保藏编号为GDMCC 62385。本发明的发明人从健康人群的胃黏膜组织中筛选到一株植物乳杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)LPF‑01，该菌株具有很强的耐酸能力和胃内高度增殖能力，能有效应用于抑制幽门螺杆菌生长，预防和/或有效抑制幽门螺杆菌相关性胃炎，且无明显副作用，对胃上皮细胞GSE‑1细胞具有较强的黏附特性。

Description

胃源性植物乳杆菌LPF-01及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，更具体地，本发明涉及一株胃源性植物乳杆菌及其应用。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是一种1983年首次从慢性活动性胃炎患者的胃黏膜活检组织中分离得到的螺旋形、微需氧的营养苛求细菌。2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单中，幽门螺杆菌被列为一类致癌物。其被摄入人体后，可以借助鞭毛穿过黏液层，定植于胃粘膜表面和十二指肠部位。幽门螺杆菌带有多个毒力基因和致病岛，并可以产生尿素酶中和胃酸，是最主要的流行性致病菌之一，我国的幽门感染率已达55.8％。
幽门螺杆菌感染可以引起多种疾病，包括帕金森、慢性支气管炎、冠心病、缺铁性贫血、白血病、消化性溃疡、慢性胃炎、胃癌等。其中，消化系统的疾病是最为主要的。幽门螺杆菌在胃部的感染还会刺激驱动胃肠上皮化生，即胃粘膜上皮细胞被肠型上皮细胞所代替。这被认为是由慢性环境刺激驱动的，例如胆汁酸反流和幽门螺杆菌相关炎症。幽门螺杆菌感染、胃酸、胆汁等损害胃黏膜造成炎症，增加胃泌素释放，影响胃十二指肠动力，导致胃-幽门-十二指肠协调运动失调，引起十二指肠逆蠕动增加、幽门关闭功能减弱、胃排空延迟,使得十二指肠内容物过量反流入胃。幽门螺杆菌相关胃炎的进程是从正常胃粘膜发展成慢性浅表性胃炎，然后发展为慢性萎缩性胃炎，进一步进行肠化生、异型增生，最后发展为胃癌。
治疗幽门螺杆菌的常见疗法是铋剂+质子泵抑制剂+一到两种抗生素的三联或四联法，该种方法对大部分的幽门螺杆菌初次根除起效，但也有一定的副作用，如抗生素的过敏问题、恶心呕吐腹痛的消化道不良反应、幽门螺杆菌耐药株的增加、及菌群的紊乱等等。幽门螺杆菌在抗生素和体内不利因素的诱导下可形成球形体，该形态的幽门螺杆菌进入休眠期，代谢缓慢且具有耐药，这也是幽门螺杆菌感染易复发的原因之一，随之导致的多次诊治也使患者的心理与经济压力加剧。因此，一种天然、副作用少而高效的治疗方式是目前所迫切需要的。
近年来的研究希望通过益生菌、益生元、植物提取物、生物活性蛋白、多糖等非抗生素物质来对抗幽门螺杆菌感染。其中，乳杆菌良好的耐酸耐胆盐等益生特性、安全性以及对幽门螺杆菌一定的抑制效果，使其成为目前在幽门螺杆菌治疗研究中的潜在生物药。但是目前为止，现有菌株主要以粪便或乳制品为来源，这些菌株存在耐酸性不够强、在胃部定植能力差且抑制幽门螺杆菌效果不强等问题。
发明内容
基于此，本发明的目的之一是提供一株胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)LPF-01，该胃源性植物乳杆菌能够预防和/或治疗幽门螺杆菌引起的胃肠道疾病。
实现上述发明目的的具体技术方案包括如下：
一种胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01，所述胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01的保藏编号为GDMCC No.62385。
在其中一些实施例中，所述胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)LPF-01的16S rDNA序列包括SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。
本发明还提供了胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01在制备预防和/或治疗幽门螺杆菌感染引起的胃肠道疾病的产品中的应用。
在其中一些实施例中，所述胃肠道疾病为胃溃疡、胃炎、功能性消化不良或胃癌。
在其中一些实施例中，所述胃肠道疾病为十二指肠溃疡。
在其中一些实施例中，所述产品为药品、食品或保健品。
本发明还提供了上述胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01在非诊断、非治疗目的地抑制幽门螺杆菌中的应用。
本发明还提供了一种胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01的培养物或代谢产物，所述胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01的保藏编号为GDMCC No.62385。
本发明还提供了上述胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01的培养物或代谢产物在制备预防和/或治疗幽门螺杆菌感染引起的胃肠道疾病的产品中的应用。
在其中一些实施例中，所述胃肠道疾病为胃溃疡、胃炎、功能性消化不良或胃癌。
在其中一些实施例中，所述胃肠道疾病为十二指肠溃疡。
在其中一些实施例中，所述产品为药品、食品或保健品。
本发明还提供了上述胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01的培养物或代谢产物在非诊断、非治疗目的地抑制幽门螺杆菌中的应用。
本发明还提供了一种预防和/或治疗幽门螺杆菌感染引起的胃肠道疾病的产品，所述产品的活性成分包括胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01、或胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01的培养物或代谢产物。
在其中一些实施例中，所述胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)LPF-01的有效剂量为106CFU/g～1010CFU/g。
本发明还提供一种非诊断、非治疗目的地抑制幽门螺杆菌生长的方法，其包括向幽门螺杆菌施用上述的胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01，或者所述方法包括向幽门螺杆菌施用上述胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)LPF-01的培养物或代谢产物。
本发明所述的胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01已于2022年4月14日保藏于国家知识产权局指定的保藏单位广东省微生物菌种保藏中心(简称：GDMCC，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼)，保藏日期：2022年4月14日，保藏编号：GDMCC No.62385。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的发明人从健康人群的胃黏膜组织中筛选到一株植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01，由于该菌株来源于胃黏膜组织，具有很强的耐酸能力和胃内高度增殖能力，解决了目前研究中的菌株多不能耐受胃酸环境，在胃部定植能力差的难题；在对该菌株进行进一步研究发现：该菌株对胃上皮细胞GSE-1细胞具有较强的黏附特性，能有效应用于抑制幽门螺杆菌生长，预防和/或有效抑制幽门螺杆菌相关性胃炎，且无明显副作用。
附图说明
图1为本发明实施例1中胃源性植物乳杆菌LPF-01的系统发育树。
图2为本发明实施例2中胃源性植物乳杆菌LPF-01的革兰氏染色结果。
图3为本发明实施例2中胃源性植物乳杆菌LPF-01、格氏乳杆菌LG-01、格氏乳杆菌LG-02、口乳杆菌LO-01及标准株LGG的生长曲线。
图4为本发明实施例2中胃源性植物乳杆菌LPF-01、格氏乳杆菌LG-01、格氏乳杆菌LG-02、口乳杆菌LO-01及标准株LGG在不同pH的人工胃液中的存活量。
图5为本发明实施例2中胃源性植物乳杆菌LPF-01、格氏乳杆菌LG-01、格氏乳杆菌LG-02、口乳杆菌LO-01及标准株LGG在不同浓度胆盐溶液中的存活率。
图6为本发明实施例3中胃源性植物乳杆菌LPF-01、格氏乳杆菌LG-01、格氏乳杆菌LG-02、口乳杆菌LO-01及标准株LGG粘附GES-1细胞的粘附率。
图7为本发明实施例4中胃源性植物乳杆菌LPF-01、格氏乳杆菌LG-01、格氏乳杆菌LG-02、口乳杆菌LO-01及标准株LGG的菌液、上清、菌体对幽门螺杆菌的抑菌圈。
图8为本发明实施例5中胃源性植物乳杆菌LPF-01干预后小鼠胃粘膜快速尿素酶检测及粪便幽门螺杆菌的抗原检测(胶体金法)结果。
图9为本发明实施例5中胃源性植物乳杆菌LPF-01干预后小鼠胃粘膜幽门螺杆菌毒力基因CagA表达情况。
图10为本发明实施例5中胃源性植物乳杆菌LPF-01干预后小鼠胃粘膜组织HE染色结果。
具体实施方式
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明提供了一株人胃来源的植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01，本发明的胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01能够抑制幽门螺杆菌，具体体现在：
(1)、胃源性植物乳杆菌LPF-01菌液及上清均对幽门螺杆菌可产生明显抑菌圈。
(2)、胃源性植物乳杆菌LPF-01对胃上皮细胞GSE-1细胞具有较强的黏附特性。
(3)、植物乳杆菌LPF-01具有极强的耐酸能力，能够耐受pH＝2的环境。
(4)、相比传统三联疗法，胃源性植物乳杆菌LPF-01能更有效地阻止幽门螺杆菌定植于胃部，阻止幽门螺杆菌进一步表达CagA毒力因子。
(5)、胃源性植物乳杆菌LPF-01可以缓解幽门螺杆菌感染相关性胃炎。
本发明的植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01来源于人的胃黏膜组织，由于人胃黏膜来源的菌株已经定植于胃黏膜，具有极强的耐酸能力和胃内高度增殖能力，解决了目前研究中的菌株多为粪便和乳制品来源，导致得到的菌株不能耐受胃部极端环境，难以在胃内定植，且抑菌效果不稳定的难题。
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)作为一种乳杆菌，具有安全、无副作用等特点，目前已被纳入卫生部下发的《可用于保健食品的益生菌菌种名单》。本发明的有效成分为胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01的产品，不会对患者产生毒副作用，且避免了抗生素的使用，不会耐药幽门螺杆菌菌株的出现。
下述实施例中涉及的幽门螺杆菌为来源于NTCC国家典型培养物保藏中心的幽门螺杆菌SS1。下述实施例中涉及的鼠李糖乳杆菌LGG，来源于美国模式培养物集存库(ATCC)，保藏编号为ATCC 53103。
下述实施例中涉及的培养基如下：
MRS固体培养基(g/L)：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO40.05 g/L、吐温80 1mL/L、琼脂20g/L。
MRS液体培养基(g/L)：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO40.05 g/L、吐温80 1mL/L。
幽门螺杆菌培养基(g/L)：无菌脱纤维羊血70ml/L、酵母浸粉3g/L、酪胨12g/L、动物组织消化物5g/L、牛肉浸粉3g/L、玉米淀粉1g/L、氯化钠5g/L、琼脂13.5g/L、pH7.3±0.2(25℃)。
以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。
实施例1胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01的分离与鉴定
包括以下步骤：
1、分离
(1)、以胃镜下活检钳取得的健康人群的胃黏膜组织为样本，研磨棒研碎后涂布于MRS固体培养基，置于37℃恒温厌氧或好氧培养箱中培养24h。
(2)、培养后根据菌落的颜色、大小、边缘形状等，用接种环挑取菌落划线纯化。筛选得到四株菌，分别命名为LPF-01、LG-01、LG-02和LO-01。用30％甘油将菌株保藏于-80℃冰箱。
2、分子生物学鉴定
以菌株LPF-01的基因组DNA为模板，利用27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3')为引物，进行16S rDNA片段扩增和测序(反应体系20μ：通用引物27F 1μL、通用引物1492R 1μL、Taq酶10μL、模板2μL、ddH2O，6μL；反应程序：95℃5min；95℃10s、55℃30s、72℃30s，30×循环；72℃5min；12℃2min)，PCR产物经测序分析，将得到的测序结果在美国国家生物技术信息中心(national center forbiotechnologyinformation，NCBI)利用BLAST在GenBank中进行搜索和相似性比对，并利用MAGE7.0软件制作16S rDNA发育树(图1)，该菌株的16S rDNA序列为植物乳杆菌的16S rDNA序列，将该菌株命名为胃源性植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01，16S rDNA序列包括SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。LG-01、LG-02、LO-01分别命名为格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)LG-01、格氏乳杆菌(Lactobacillusgasseri)LG-02、口乳杆菌(Lactobacillus oris)LO-01。
其中，基因组DNA的提取方法如下：
a.将菌株LPF-01培养过夜；
b.取培养过夜的菌悬液1mL于1.5mL离心管，10000r/min离心2min，弃上清，得菌体沉淀；
c.加入110μl缓冲液(20mM Tris，pH 8.0；2mM Na2-EDTA；1.2％Triton)，和70μl溶菌酶溶液，37℃处理30min以上；
d.向管中加入20μl Proteinase K溶液，混匀；
e.加入220μl缓冲液GB，振荡15sec，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
f.加220μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
g.将步骤(f)所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
h.向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
i.向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中；
j.重复操作步骤(i)；
k.吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
l.吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。
SEQ ID No.1
AAAATCTGGGTTCAACCTTAGGGCGGCTGGTTCCTAAAGGTTACCCCACCGACTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAATGGCTTTAAGAGATTAGCTTACTCTCGCGAGTTCGCAACTCGTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCACCAGAGTGCCCAACTTAATGCTGGCAACTGATAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTATCCATGTCCCCGAAGGGAACGTCTAATCTCTTAGATTTGCATAGTATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGCATTCATCGTTTACGGTATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTACCCATACTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTCCCAGTTTCCGATGCACTTCTTCGGTTGAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACTTAAAAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAAATACCGTCAATACCTGAACAGTTACTCTCGGATATGTTCTTCTTTAACAACAGGAGTTTACGAGGCCGAAACCCTCTCACTCACGCGGGCGTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGGTGGAAGAATTCCCTACTGCCTGCCTCCGTA
SEQ ID No.2
AGGGAGGTGCCTATACTTGCAAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGCTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAGGATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAGCTACGCGAGAACCTTACCAGTCTTGACATACTATGCAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGTTGTCG
实施例2胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01的特征、性能研究
1、革兰氏染色
(1)、将细菌菌液进行涂片后干燥、固定。
(2)、初染：草酸铵结晶紫染1分钟后水洗。
(3)、媒染：加碘液去掉残余水分，约1分钟后水洗。
(4)、脱色：将载玻片上的水甩干，用酒精洗片至不出现紫色为止，立即用水洗净。
(5)、复染：用番红液染1-2分钟后水洗。
干燥后在显微镜下观察，如图2所示，胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)LPF-01呈革兰氏阳性。
2、生长曲线
(1)、分别测定植物乳杆菌LPF-01、鼠李糖乳杆菌标准株LGG、格氏乳杆菌LG-01、格氏乳杆菌LG-02和口乳杆菌LO-01在2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24h时的生长情况。
(2)、吸取待测菌液1.5ml至2ml离心管中，9000rpm，离心1分钟后弃去上清，加入2ml磷酸盐缓冲液，吹打混匀。
(3)、以磷酸盐作为调零对照，将2ml待测菌液加入比色皿中，测定吸光度。
如图3所示，胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01接种5小时后到达对数生长期，接种20小时后到达稳定期，与鼠李糖乳杆菌LGG曲线接近。
3、生化鉴定
对胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01进行糖发酵生化鉴定。结果如表1所示。
表1胃源性植物乳杆菌LPF-01及鼠李糖乳杆菌LGG的糖发酵生化鉴定
Figure BDA0003639384850000121
Figure BDA0003639384850000131
4、耐酸特性
(1)、分别将冻存于-80℃的胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)LPF-01、鼠李糖乳杆菌标准株LGG、格氏乳杆菌LG-01、格氏乳杆菌LG-02和口乳杆菌LO-01接种于MRS液体培养基中，37℃，有氧培养24h，复苏得到的菌悬液按同法传代2-3次；
(2)、取1ml培养液于1.5ml离心管中，8000×g离心2min，弃上清，收集菌体沉淀，用PBS重悬至调整OD600值为1；
(3)、分别取10ul步骤(2)所得重悬液加到990ul的pH＝2、pH＝3、pH＝4的人工胃液，得到原液；
(4)、将原液于37℃下有氧培养，分别在0h、2h时取样，倍比稀释后涂布于MRS固体培养基，置于37℃下培养，24h后进行平板菌落计数，记录计算其存活量。
结果如图4所示，从图4可以看出，胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)LPF-01表现出极强的耐酸能力。胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)LPF-01具有比其它从胃黏膜分离的乳杆菌株更强的耐酸能力。在pH＝2时，胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01比鼠李糖乳杆菌LGG表现出更强的耐酸能力。
5、耐胆盐特性
(1)、分别将冻存于-80℃的胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)LPF-01和鼠李糖乳杆菌LGG、格氏乳杆菌LG-01、格氏乳杆菌LG-02和口乳杆菌LO-01接种于MRS液体培养基中，37℃，有氧培养24h，复苏得到的菌悬液按同法传代2-3次；
(2)、取1ml培养液于1.5ml离心管中，8000×g离心2min，弃上清，收集菌体沉淀，用PBS重悬至调整OD600值为1；
(3)、分别取10ul步骤(2)所得重悬液加到990ul的0.3％、0.5％的胆盐溶液，得到原液；
(4)、将原液于37℃下有氧培养，分别在0h、2h时取样，倍比稀释后涂布于MRS固体培养基，置于37℃下培养，24h后进行平板菌落计数，记录计算其存活量。
结果如图5所示，从图5可以看出，胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)LPF-01表现出极强的耐胆盐能力且具有比其它从胃黏膜分离的乳杆菌株更强大的耐胆盐能力。且胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01比鼠李糖乳杆菌LGG表现出更强的耐胆盐能力。
实施例3胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01粘附GES-1(正常人胃粘膜上皮细胞)的能力
(1)、将-80℃保存的胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01、鼠李糖乳杆菌标准株LGG、格氏乳杆菌LG-01、格氏乳杆菌LG-02和口乳杆菌LO-01分别接种于MRS液体培养基中，在50℃有氧环境培养24h，将复苏得到的菌液按同样方法传代2-3次。
(2)、将GES-1消化后计数，以1-2x104个/ml为浓度，铺种24孔板，1ml/well，在24孔细胞培养皿中放置细胞爬片，将液氮冻存的GES-1细胞复苏于放置了细胞爬片、含有DMEM高糖培养基及10％FBS的24孔板中，长至单层。
(3)、取1ml胃源性植物乳杆菌LPF-01混悬液、鼠李糖乳杆菌标准株LGG混悬液、LG-01混悬液、LG-02混悬液、LO-01混悬液分别于1.5ml离心管，5500rpm/min离心2min，弃上清，得到菌体沉淀，用1mLPBS重悬菌体，吹打清洗，5500rpm/min离心2min，弃上清，重复清洗三次后，用DMEM高糖培养基重悬，调整OD600值为1。
(4)、分别取100μL步骤(3)所得重悬液分别加到含有900μL含DMED高糖培养基及10％FBS的24孔细胞皿，37℃有氧培养4h。
(5)、将24孔培养皿内上清吸尽，用PBS清洗细胞3次，弃去上清，加入4％多聚甲醇固定，弃去上清，用眼科镊夹取细胞爬片，革兰氏染色，油镜下每张爬片随机取5处视野，计数粘附于GES-1细胞的胃源性植物乳杆菌LPF-01、鼠李糖乳杆菌标准株LGG、格氏乳杆菌LG-01、格氏乳杆菌LG-02和口乳杆菌LO-01。
粘附率(％)以粘附于GES-1细胞的菌数与加入培养皿的菌数之比计算。
胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01、鼠李糖乳杆菌标准株LGG、格氏乳杆菌LG-01、格氏乳杆菌LG-02和口乳杆菌LO-01对GES-1细胞的粘附率结果如图6所示，结果显示与鼠李糖乳杆菌LGG及其他胃源性乳杆菌分离株相比，胃源性植物乳杆菌LPF-01表现出了对GES-1细胞更高的粘附率及更强的黏附能力。说明胃源性植物乳杆菌LPF-01比鼠李糖乳杆菌LGG及其他胃源性乳杆菌分离株更容易粘附于胃上皮细胞。
实施例4胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01对幽门螺杆菌的抑制能力
包括以下步骤：
(1)、分别将胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01、鼠李糖乳杆菌标准株LGG、格氏乳杆菌LG-01、格氏乳杆菌LG-02和口乳杆菌LO-01五区划线于MRS固体培养基上，37℃培养24h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养24h进行活化，连续活化两代，得到活化液；
(2)、将活化液调整至OD600＝1后按2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养24h，得到菌液；菌液经8000g离心2min，得到上清液和菌体，取上清液备用；并分别用PBS和剩余上清液将菌体调整至OD600＝1备用；
(3)、用牛津杯法分别测定步骤(2)中获得的上清液、PBS重悬的菌体、上清液重悬的菌体抑制幽门螺杆菌生长的效果。
结果如图7所示，从左到右为胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)LPF-01、鼠李糖乳杆菌标准株LGG、格氏乳杆菌LG-01、格氏乳杆菌LG-02和口乳杆菌LO-01的菌液(上清液重悬的菌体)、上清液、菌体(PBS重悬的菌体)的抑菌圈。其中胃源性植物乳杆菌LPF-01的菌液和上清液出现出明显的抑菌圈，且大小要明显优于其它的胃源性乳杆菌分离株。表明胃源性植物乳杆菌LPF-01具有较好的抑制幽门螺杆菌生长的作用，且效果与广泛应用的鼠李糖乳杆菌相当。
各菌株的幽门螺杆菌抑菌圈直径统计结果如表2所示。
表2各菌株的幽门螺杆菌抑菌圈直径
菌液(mm) 上清(mm) 菌体(mm)
LGG 19.00±1.00 18.00±1.00 0.00±0.00
LPF-01 16.50±0.50 17.50±0.50 0.00±0.00
LO-01 15.50±0.50 14.50±0.50 0.00±0.00
LG-01 10.00±1.00 13.00±2.00 0.00±0.00
LG-02 14.50±1.50 14.50±0.50 0.00±0.00
从表2可知，胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01菌液对幽门螺杆菌的抑菌圈大小可达16.50±0.50mm，上清液对幽门螺杆菌的抑菌圈大小可达17.50±0.50mm，菌体无抑菌圈，表明胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)LPF-01或其代谢产物具有抑制幽门螺杆菌生长的作用，其抑菌作用明显强于其他分离株，但稍弱于鼠李糖乳杆菌标准株LGG，但相比于LGG，本菌来源于胃，具备天然定植于胃环境的特点。
实施例5植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01有效缓解幽门螺杆菌相关胃炎
方法如下：
(1)、4周龄C57BL/6小鼠24只，正常饲养一周后随机分成四组：
control组(n＝4)
HP(H.pylori)组(n＝6)
LPF-01组(n＝8)
三联疗法组(n＝6)
(2)、第1至3天，各组小鼠于晨8时禁食，4小时后三联混合抗生素(氨苄青霉素2.75mg+阿奇霉素2.75mg+庆大霉素0.3mg)0.25ml灌胃，间隔2小时再次三联混合抗生素0.25ml灌胃。
(3)、第4～11天，各组小鼠于晨8时禁食，control组、HP组和三联疗法组均灌胃空白MRS肉汤0.3ml，LPF-01组灌胃OD600＝1的LPF-01肉汤0.3ml。
(4)、第12天，各组小鼠于晨8时禁食，2小时后予0.08ml 50％乙醇灌胃，间隔2小时，control组灌胃空白幽门螺杆菌液体培养基0.3ml，其他组均灌胃OD600＝1新鲜HP混悬液0.3ml；6小时后，control组、HP组和三联疗法组灌胃空白MRS肉汤0.3ml，LPF-01组灌胃OD600＝1的LPF-01肉汤0.3ml，解除禁水禁食。
(5)、第13～39天，各组小鼠于晨8时禁食，间隔2小时，control组灌胃空白幽门螺杆菌液体培养基0.3ml，其他组均灌胃OD600＝1新鲜HP混悬液0.3ml；6小时后，control组、HP组和三联疗法组灌胃空白MRS肉汤0.3ml，LPF-01组灌胃OD600＝1的LPF-01肉汤0.3ml，解除禁水禁食。
(6)、第40～53天，各组小鼠于晨8时禁食，2小时后予0.08ml 50％乙醇灌胃，间隔2小时，control组灌胃空白幽门螺杆菌液体培养基0.3ml，其他组均灌胃OD600＝1新鲜HP混悬液0.3ml；6小时后，control组和HP组灌胃空白MRS肉汤0.3ml，LPF-01组灌胃OD600＝1的LPF-01肉汤0.3ml，三联疗法组灌胃0.3ml治疗剂量浓度的奥美拉唑+克拉霉素+阿莫西林，解除禁水禁食。
(7)、第56天解剖检测各项指标。
各组小鼠胃黏膜组织快速尿素酶检测及粪便抗原检测(胶体金法)结果如图8所示，从图8可知，HP组的快速尿素酶检测及粪便抗原检测均为阳性，LPF-01干预组结果多数为阴性，而三联疗法组呈现强阳性(推测三联疗法清除幽门螺杆菌的速度比较慢，残存的死菌依然有抗原活性，从而粪便抗原检测会呈现抗原反应阳性)。
各组小鼠胃黏膜qPCR检测CagA基因水平的结果如图9所示，从图9可知，HP组CagA表达量显著高于control组，说明幽门螺杆菌已在小鼠体内定植，造模成功；HP组表达水平也显著高于LPF-01组，说明LPF-01在小鼠体内能够显著抑制幽门螺杆菌，且效果优于三联疗法。
各组小鼠胃黏膜组织HE染色结果如图10所示，从图10可知，HP组提示黏膜基层出现炎性浸润，而LPF-01组和三联疗法组胃黏膜组织均未见明显异常。
综上所述，该实施例的结果表明：植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01能够抑制幽门螺杆菌，从而减轻幽门螺杆菌相关胃炎。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州维生君生物科技有限公司
<120> 胃源性植物乳杆菌LPF-01及其应用
<130> 1
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1146
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaaatctggg ttcaacctta gggcggctgg ttcctaaagg ttaccccacc gactttgggt 60
gttacaaact ctcatggtgt gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgc 120
ggcatgctga tccgcgatta ctagcgattc cgacttcatg taggcgagtt gcagcctaca 180
atccgaactg agaatggctt taagagatta gcttactctc gcgagttcgc aactcgttgt 240
accatccatt gtagcacgtg tgtagcccag gtcataaggg gcatgatgat ttgacgtcat 300
ccccaccttc ctccggtttg tcaccggcag tctcaccaga gtgcccaact taatgctggc 360
aactgataat aagggttgcg ctcgttgcgg gacttaaccc aacatctcac gacacgagct 420
gacgacaacc atgcaccacc tgtatccatg tccccgaagg gaacgtctaa tctcttagat 480
ttgcatagta tgtcaagacc tggtaaggtt cttcgcgtag cttcgaatta aaccacatgc 540
tccaccgctt gtgcgggccc ccgtcaattc ctttgagttt cagccttgcg gccgtactcc 600
ccaggcggaa tgcttaatgc gttagctgca gcactgaagg gcggaaaccc tccaacactt 660
agcattcatc gtttacggta tggactacca gggtatctaa tcctgtttgc tacccatact 720
ttcgagcctc agcgtcagtt acagaccaga cagccgcctt cgccactggt gttcttccat 780
atatctacgc atttcaccgc tacacatgga gttccactgt cctcttctgc actcaagttt 840
cccagtttcc gatgcacttc ttcggttgag ccgaaggctt tcacatcaga cttaaaaaac 900
cgcctgcgct cgctttacgc ccaataaatc cggacaacgc ttgccaccta cgtattaccg 960
cggctgctgg cacgtagtta gccgtggctt tctggttaaa taccgtcaat acctgaacag 1020
ttactctcgg atatgttctt ctttaacaac aggagtttac gaggccgaaa ccctctcact 1080
cacgcgggcg tgctccatca gactttcgtc cattggtgga agaattccct actgcctgcc 1140
tccgta 1146
<210> 2
<211> 1043
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agggaggtgc ctatacttgc aagtcgaacg aactctggta ttgattggtg cttgcatcat 60
gatttacatt tgagtgagtg gcgaactggt gagtaacacg tgggaaacct gcccagaagc 120
gggggataac acctggaaac agatgctaat accgcataac aacttggacc gcatggtccg 180
agcttgaaag atggcttcgg ctatcacttt tggatggtcc cgcggcgtat tagctagatg 240
gtggggtaac ggctcaccat ggcaatgata cgtagccgac ctgagagggt aatcggccac 300
attgggactg agacacggcc caaactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccacaa 360
tggacgaaag tctgatggag caacgccgcg tgagtgaaga agggtttcgg ctcgtaaaac 420
tctgttgtta aagaagaaca tatctgagag taactgttca ggtattgacg gtatttaacc 480
agaaagccac ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt 540
ccggatttat tgggcgtaaa gcgagcgcag gcggtttttt aagtctgatg tgaaagcctt 600
cggctcaacc gaagaagtgc atcggaaact gggaaacttg agtgcagaag aggacagtgg 660
aactccatgt gtagcggtga aatgcgtaga tatatggaag aacaccagtg gcgaaggcgg 720
ctgtctggtc tgtaactgac gctgaggctc gaaagtatgg gtagcaaaca ggattagata 780
ccctggtagt ccataccgta aacgatgaat gctaagtgtt ggagggtttc cgcccttcag 840
tgctgcagct aacgcattaa gcattccgcc tgggagtacg gccgcaaggc tgaaactcaa 900
ggattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgagc tacgcgagaa 960
ccttaccagt cttgacatac tatgcaatct aagagattag acgttccctt cggggacatg 1020
gatacaggtg gtgcatgttg tcg 1043
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (9)

1.一种胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01，所述胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01的保藏编号为GDMCC No.62385。
2.根据权利要求1所述的胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01，其特征在于，所述胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01的16SrDNA序列包括SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。
3.一种胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01的培养物，所述胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01的保藏编号为GDMCCNo.62385。
4.权利要求1或2所述的胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01、或权利要求3所述的胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01的培养物在制备预防和/或治疗幽门螺杆菌感染引起的胃肠道疾病的药品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述胃肠道疾病为胃溃疡、胃炎、功能性消化不良或胃癌。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述胃肠道疾病为十二指肠溃疡。
7.权利要求1或2所述的胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01、或权利要求3所述的胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01的培养物在非诊断、非治疗目的地抑制幽门螺杆菌中的应用。
8.一种预防和/或治疗幽门螺杆菌感染引起的胃肠道疾病的药品，其特征在于，所述药品的活性成分包括权利要求1或2所述的胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01、或所述药品的活性成分包括权利要求3所述的胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01的培养物。
9.根据权利要求8所述的所述预防和/或治疗幽门螺杆菌感染引起的胃肠道疾病的药品，其特征在于，所述胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01、或胃源性植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LPF-01的培养物，其有效剂量为106CFU/g～1010CFU/g。
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