CN113201467A - 一种副干酪乳杆菌Lc19和包含其的微生物制剂 - Google Patents

一种副干酪乳杆菌Lc19和包含其的微生物制剂 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种副干酪乳杆菌Lc19和包含其的微生物制剂，该副干酪乳杆菌Lc19已保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，其保藏编号是CGMCC NO.17827；其不仅对便秘和结肠炎具有显著的疗效，而且能够靶向改善多种便秘和结肠炎特征性的肠道相关菌群，提升多种有益菌丰度，降低多种有害菌丰度，维持肠道菌群的平衡，极大提高了恢复肠道菌群的健康化、多样化的能力，此外，本发明的副干酪乳杆菌Lc19还具有食用方便、治疗简单、缓解率高、无毒副作用等优点。

Description

一种副干酪乳杆菌Lc19和包含其的微生物制剂
技术领域
本发明属于微生物制剂技术领域，具体涉及一种副干酪乳杆菌Lc19和包含其的微生物制剂。
背景技术
炎症性肠病(IBD)是一种世界性流行病，主要包括溃疡性结肠炎和克罗恩病等。便秘(constipation)是多种疾病的一种症状，常见症状是排便次数明显减少，每周排便次数少于3次，粪质干硬，常伴有排便困难感(包括排便费力、排出困难、排便不尽感、排便费时及需手法辅助排便)的病理现象，功能性便秘指非全身疾病或肠道疾病所引起的原发性持续性便秘，与生活规律改变、情绪抑制、饮食因素、排便习惯不良等多种因素相关，肠道菌群紊乱、菌群多样性降低是导致便秘和炎症性肠病发生的主要因素。
与正常人的肠道菌群比较，便秘患者肠道菌群的改变主要表现为专性厌氧菌相对减少(如乳酸杆菌、双歧杆菌、拟杆菌属等)和潜在致病菌相对增多(如铜绿假单胞菌、空肠弯曲菌、腐败梭菌等)。与正常人相比，IBD 患者肠道中的致病菌如肠球菌、拟杆菌类等数量及比例明显增多，而乳杆菌及双歧杆菌等有益菌减少。正常人肠道内厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和放线菌门占90％以上，结肠炎患者中的肠道菌群多样性下降，导致有益菌多样性和丰度减少，而条件致病菌和有害菌所占比例增大。便秘的传统治疗药物是泻药，包括容积类泻药(欧车前、车前草等)、渗透性泻药(乳果糖、聚乙二醇、硫酸镁等)和刺激性泻药(蒽醌类药物番泻叶、芦荟等)等。炎症性肠病的传统治疗方法包括氨基水杨酸制剂、糖皮质激素、抗生素及免疫制剂等。然而传统的便秘治疗和炎症性肠病治疗均存在着价格高、安全性低、疗效差、无根治作用、病情易反复等缺陷，因此，迫切需要探索出相较于传统治疗更加安全有效的疗法。
为了解决上述技术问题，有研究报道了副干酪乳杆菌L9用于治疗便秘，然而，该副干酪乳杆菌L9仅仅对肠道内Lactobacillus属和Bifidobaceterium spp.具有一定的增殖作用，作用单一，无法靶向调节肠道内与疾病有关的主要菌属，导致患者肠道菌群的多样性恢复能力低下，病情易反复。(见文献王晓成等，副干酪乳杆菌L9对小鼠肠道短链脂肪酸含量的影响，食品科学，2017,38,238-243)。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中副干酪乳杆菌无法靶向作用肠道内与疾病相关的主要菌属而导致其对于肠道菌群多样性的恢复能力低下的问题，从而提供一种副干酪乳杆菌Lc19和包含其的微生物制剂。
本发明提供了一种副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)Lc19，已保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号是CGMCC NO.17827，保藏日期是2019年05月20日。
本发明提供了一种微生物制剂，所述微生物制剂是以所述的副干酪乳杆菌Lc19、所述的副干酪乳杆菌Lc19的灭活菌或所述副干酪乳杆菌Lc19 的处理物为活性成分的微生物制剂。
进一步地，所述副干酪乳杆菌Lc19的处理物为副干酪乳杆菌Lc19的培养物、浓缩物、干燥物、稀释物和所述培养物的提取物中的至少一种。
进一步地，还包括至少一种适用于微生物制剂的赋形剂。所述适用于微生物制剂的赋形剂为渗透增强剂、防腐剂、抗氧化剂、缓冲剂、螯合剂、离子交换剂、增溶剂、悬浮剂、增稠剂、表面活性剂、湿润剂、张力调节剂和酶抑制剂中的至少一种。
进一步地，所述微生物制剂为粉末、胶囊、颗粒剂、片剂、液体制剂或者凝胶。
进一步地，还包括至少一种其他活性物质。
进一步地，所述其他活性物质包括其他的用于制备调节肠道菌群失调的产品的益生菌、益生元和果蔬粉中的至少一种。
进一步地，所述益生菌为乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)MN-Gup，所述乳双歧杆菌MN-Gup已保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，其保藏编号是CGMCC NO.15578。
所述益生元选自水苏糖、棉籽糖、低聚半乳糖、低聚果糖、菊粉、果蔬粉和抗性糊精中的至少一种。
所述果蔬粉选自南瓜粉、蓝莓粉、山楂粉、大枣粉、沙棘粉、木瓜粉、桑葚粉和草莓粉中的至少一种。
进一步地，以每克微生物制剂为基准，所述副干酪乳杆菌Lc19含量为≥1010个/g，优选为5×1010-6×1011个/g。
本发明还提供了一种微生物制剂的制备方法，以所述的副干酪乳杆菌 Lc19为菌种进行培养，得到微生物制剂。
进一步地，在所述培养步骤之后还包括离心，收集湿菌体，加入保护剂进行真空干燥的步骤。
本发明还提供了所述的副干酪乳杆菌Lc19、上述任一所述的微生物制剂，所述的制备方法制得的微生物制剂具有如下的(1)-(8)项中的至少一项用途：
(1)在制备提高短链脂肪酸含量的产品中的用途；
(2)在制备调节便秘特征肠道菌群的产品中的用途；
(3)在制备预防、缓解或改善便秘的产品中的用途；
(4)在制备调节结肠炎特征肠道菌群的产品中的用途；
(5)在制备抑制促炎因子TNF-α、IFN-γ和IL-6的表达的产品中的用途；
(6)在制备促进抗炎因子IL-4和IL-10的表达的产品中的用途；
(7)在制备促进紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、E-cadherin的表达的产品中的用途；
(8)在制备预防、缓解或改善炎症性肠病的产品中的用途。
进一步地，所述的产品包括药物、食品或保健食品。
进一步地，所述短链脂肪酸包括乙酸、丙酸和丁酸。
进一步地，所述调节便秘特征肠道菌群是指提高便秘特征肠道菌群中有益菌属Dorea、Anaerostipes、Ruminococcus_2、Blautia、Lactobacillus、 Bifidobacterium、unclassified_f__Lachnospira、[Eubacterium]_hallii_group和/或Roseburia的丰度；抑制便秘特征肠道菌群中有害菌属 Erysipelotrichaceae_UCG-003、Alistipes、[Ruminococcus]_torques_group和/ 或[Ruminococcus]_gnavus_group的丰度。
进一步地，所述预防、缓解或改善便秘是指提高排便次数，改善排便状况和/或改善粪便性状。
进一步地，所述调节结肠炎特征肠道菌群是指提高结肠炎特征肠道菌群中有益菌属norank_f_Muribaculaceae、Prevotellaceae_UCG-001、 Alloprevotella、Ruminococcaceae_UCG-014、Lactobacillus、Muribaculum、 Unclassified_f_Ruminococcaceae和/或Akkermansia的丰度；抑制结肠炎特征肠道菌群中有害菌属的丰度。
进一步地，所述炎症性肠病为结肠炎和/或克罗恩病。
进一步地，所述便秘为功能性便秘。
进一步地，所述结肠炎为溃疡性结肠炎。
进一步地，以产品的菌数为基准，所述产品的每日有效剂量为每日≥1010个，优选为5×1010-5×1011个。
本发明相对现有技术具有如下优点：
1.本发明提供的一种副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)Lc19，已保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，其保藏编号是CGMCC NO.17827，其不仅对便秘和结肠炎具有显著的疗效，而且能够靶向改善多种便秘和结肠炎特征性的肠道相关菌群，提升多种有益菌丰度，降低多种有害菌丰度，维持肠道菌群的平衡，极大提高了恢复肠道菌群的健康化、多样化的能力，
此外，本发明的副干酪乳杆菌Lc19还具有显著提升肠道菌群代谢产物短链脂肪酸、抑制促炎因子TNF-α、IFN-γ和IL-6表达、促进抗炎因子IL-4 和IL-10表达、促进紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、E-cadherin表达、食用方便、治疗简单、缓解率高、无毒副作用等优点。
2.本发明提供的一种微生物制剂，包含副干酪乳杆菌Lc19的微生物制剂能够靶向提升便秘患者肠道内的多种与排便次数、排便状况及粪便性状相关的有益菌的丰度，抑制多种与排便次数、排便状况及粪便相关的炎症性有害菌的丰度，显著提升肠道菌群代谢产物短链脂肪酸例如乙酸、丙酸、丁酸的含量，还能显著提升结肠炎小鼠模型肠道内的多种与结肠炎相关有益菌的丰度，降低多种与结肠炎相关有害菌的丰度，极大程度上促进便秘特征性肠道菌群和结肠炎特征性肠道菌群的健康化、多样化，表明包含副干酪乳杆菌Lc19的微生物制剂对于便秘、结肠炎等肠道菌群失调的相关疾病具有较好的靶向治疗作用，此外，本发明的副干酪乳杆菌Lc19还具有抑制促炎因子TNF-α、IFN-γ和IL-6表达、促进抗炎因子IL-4和IL-10表达、促进紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、E-cadherin表达、食用方便、治疗简单、缓解率高、无毒副作用等优点。
3.本发明提供的一种微生物制剂，还包括其他益生菌，所述其他益生菌为乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)MN-Gup，所述乳双歧杆菌MN-Gup 已保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，其保藏编号是CGMCC NO.15578；乳双歧杆菌MN-Gup能够与副干酪乳杆菌Lc19协同发挥作用，改善便秘和结肠炎特征性的肠道相关菌群更显著，进一步提升改善便秘和结肠炎的效果。
4.本发明提供的一种微生物制剂，还包括益生元，所述副干酪乳杆菌 Lc19能够与益生元协同发挥作用，改善便秘和结肠炎特征性的肠道相关菌群更显著，进一步提升改善便秘和结肠炎的效果。
5.本发明提供的一种微生物制剂的制备方法，取副干酪乳杆菌Lc19培养即得微生物制剂，制备方法简单、操作方便，进一步地，还包括离心，收集湿菌体，加入保护剂进行真空干燥的步骤，通过上述步骤将副干酪乳杆菌Lc19灭活得到Lc19灭活菌粉，该菌粉具有优良的耐热性和pH稳定性，易加工，不受食品形式限制，而且含菌量稳定，品质易控制，且不污染生产线；此外还不用冷藏，不受生产、运输等外界条件影响；不受抗生素影响，且无耐药基因转移风险。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实验例2中正常组小鼠的结肠组织切片的HE染色；
图2为实验例2中模型组小鼠的结肠组织切片的HE染色；
图3为实验例2中低剂量Lc组小鼠的结肠组织切片的HE染色；
图4为实验例2中高剂量Lc组小鼠的结肠组织切片的HE染色。
具体实施方式
以下通过具体实施例来说明本发明的实施方式，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法均采用本技术领域常规技术，实施例中所用到的试剂和原料均可由市场购得。
其中下述实施例中采用的MRS培养基和菌体保护剂溶液的组成如下：
MRS培养基的原料组成是：大豆蛋白胨10g、牛肉膏5g、酵母粉5g、葡萄糖20g、吐温80 1ml、磷酸二氢钠2g、无水乙酸钠5g、柠檬酸三胺2g、硫酸锰0.02g、硫酸镁0.1g和蒸馏水1L，调pH至6.2，加入琼脂15g，在 121℃下灭菌15min。
菌体保护剂溶液的原料组成是：脱脂乳8g、海藻糖5g、甘油5g、维生素C0.05g、蒸馏水81.95g。
本发明中的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)Lc19和乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)MN-Gup，均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国普通微生物菌种保藏中心)，保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号分别是CGMCC NO.17827和CGMCC NO.15578，副干酪乳杆菌Lc19的保藏日期是2019年05月20日，乳双歧杆菌MN-Gup的保藏日期是2018年 04月10日。
下述实施例中的乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)MN-Gup灭活菌粉的制备方法如下：
向MRS培养基中接种乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)(保藏编号是CGMCCNO.15578)，接种量为2％，37℃下静置培养18h，培养至对数期，活菌数达到109cfu/mL，转速为8000rpm下离心，收集湿菌体，加入上述菌体保护剂溶液，菌体保护剂溶液加入质量为湿菌体质量的3倍，得到浓缩菌液，将浓缩菌液在75℃下真空干燥，得到MN-Gup灭活菌粉，其中MN-Gup灭活菌粉的菌数为5×1011个/g。
本发明中的动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)MN-Gup已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNo.15578，保藏日期是2018年4月10日。在本发明中，将动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)MN-Gup，简称为乳双歧杆菌MN-Gup。
实施例1
本实施例提供一种微生物制剂的制备方法，具体包括以下步骤：
向MRS培养基中接种副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)Lc19(保藏编号是CGMCC NO.17827)，接种量为1％，37℃下静置培养16h，培养至对数期，活菌数达到109cfu/mL，转速为8000rpm下离心，收集湿菌体，加入上述菌体保护剂溶液，菌体保护剂溶液加入质量为湿菌体质量的5倍，得到浓缩菌液，将浓缩菌液在70℃下真空干燥，得到Lc19灭活菌粉，其中 Lc19灭活菌粉的菌数为2×1011个/g。
实施例2
本实施例提供一种微生物制剂的制备方法，具体包括以下步骤：
向MRS培养基中接种副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)Lc19(保藏编号是CGMCC NO.17827)，接种量为2％，37℃下静置培养20h，培养至对数期，活菌数达到1010cfu/mL，转速为8000rpm下离心，收集湿菌体，加入上述菌体保护剂溶液，菌体保护剂溶液加入质量为按照湿菌体质量重量的3倍加入无菌的菌体保护剂溶液，得到浓缩菌液，将浓缩菌液在80℃下真空干燥，得到Lc19灭活菌粉，其中Lc19灭活菌粉的菌数为6×1011个 /g。
实施例3
本实施例提供了一种微生物制剂及其制备方法，该微生物制剂的原料配方如下表1所示：
表1微生物制剂配方
Figure RE-GDA0002695148490000101
制备方法包括如下步骤：
(1)按照配方量称取菊粉、脱脂乳粉和南瓜粉，并混合均匀记为A料；
(2)称取0.6g抗性糊精与配方量的副干酪乳杆菌Lc19灭活菌粉并混合均匀记为B料；
(3)按照配方量分别称取水苏糖、低聚果糖、棉籽糖、剩余部分抗性糊精和二氧化硅，并与将A料、B料混合均匀，即得。
实施例4
本实施例提供了一种微生物制剂及其制备方法，该微生物制剂的原料配方如下表2所示：
表2微生物制剂配方
Figure RE-GDA0002695148490000102
Figure RE-GDA0002695148490000111
制备方法包括如下步骤：按照配方量称取乳双歧杆菌MN-Gup灭活菌粉和副干酪乳杆菌Lc19灭活菌粉并混合均匀，即得。
实验例1
1、受试对象
招募患有便秘疾病的受试者140人为研究对象，纳入者标准如下：
(1)年龄18-65岁者；
(2)每周大便次数3-4次者；
(3)长期或间歇性便秘、大便不成形者优先；
(4)排便次数不规律者优先；
(5)肠胃敏感或有胃肠道疾病者优先。每个年龄段人数尽量保持均衡，以保证组内可比性。
2、食用剂量与时间
将受试者随机分为两组，每组70人，分别为低剂量组和高剂量组，其中：低剂量组食用本申请实施例1的Lc19菌粉(菌数为2×1011个/g)，每日2次，每次0.125g，每日服用菌数为5×1010个，高剂量组食用本申请实施例1的Lc19菌粉，每日2次，每次0.5g，每日服用菌数为2×1011个，低剂量组和高剂量组均为口服给药，连续服用21天。
3、测试方法
(1)气相色谱检测法测定受试者粪便中短链脂肪酸含量
分别取各组受试者食用Lc19菌粉之前的新鲜粪便样品(干预前)和各组受试者食用Lc19菌粉21天后的新鲜粪便样品(干预后)，然后按照下述方法测定粪便样品中短链脂肪酸含量，计算平均值。
短链脂肪酸标准曲线的建立：用容量瓶配制含有5mmol/L乙酸、 5mmol/L丙酸、5mmol/L丁酸、5mmol/L庚酸的乙醚溶液，采用倍比稀释的方法，得到分别含有2.5,1.25,0.625,0.312,0.156mmol/L的乙酸、丙酸、丁酸、庚酸的标准溶液。分别移取1μL标准液作气相色谱分析，每个浓度重复测定3次，得到各浓度的峰面积与对应浓度，从而制作标准曲线，并求得回归方程和相关系数。
确定检测粪便样品中SCFA浓度的色谱条件：检测器为FID氢火焰离子检测器；色谱柱为60-80目(酸洗、硅烷化)不锈钢柱(25m×0.320mm)，涂渍填充10％FFAP(硝基对苯二甲酸改性的聚乙二醇)和1％H3PO4；升温程序：50℃保持1min，以10℃/min升至140℃，保持1min，以30℃/min 升至240℃，保持2min；载气(N2)压力260kPa；氮气流速为40mL/min，氢气流速为40mL/min，空气流速为400mL/mi；进样量2μL；检测温度230℃。 N2000色谱工作站收集信号并检测。
粪便中短链脂肪酸的提取和测定：在1.5mL螺口收集管内加入适量玻璃珠(2～3mm)，加入1mL含有庚酸(浓度为1mmol/L)的乙醚溶液和50μL 的盐酸溶液(浓度为1mmol/L)，称重。用镊子向收集管中小心加入粪便样品(约0.1-0.2g)，再称次重，记录加入粪便的重量。配平后用均质机匀浆1min，10000r/min离心2min。转移上清液有内插管的进样瓶中。因乙醚具有强挥发性，上述操作均需在冰浴或低温条件下快速进行。
按照上述气相色谱条件进行测量，计算对应短链脂肪酸的峰面积，采用外标法做出标准曲线，用内标庚酸浓度进行修正，测定上清液中乙酸、丙酸和丁酸浓度，并换算出其在粪便样品中的含量。
(2)靶向改善便秘特征肠道菌群的验证
肠道菌群检测：分别取各组受试者食用Lc19菌粉之前的新鲜粪便样品 (干预前)和各组受试者食用Lc19菌粉21天后的新鲜粪便样品(干预后)，按照《保健食品检验与评价技术规范(2003年版)》检测肠道菌群，并委托上海美吉生物DNA测序公司通过16s rDNA测序(Illumina Miseq平台高通量基因组测序)对上述粪便样品进行测试，以确定和重点分析便秘肠道菌群的特征性变化。
(3)排便状况观察
记录各组患者每日排便次数和排便状况，并观察粪便性状，并对排便状况和性质按下述方法进行统计积分。
将排便状况根据排便困难程度(腹痛或肛门烧灼感、下坠感、不适感，有否便频但排便困难而量少等症状)分为I-IV级，统计积分值，I级(0分)：排便正常。II级(1分)：仅有下坠感、不适感。III级(2分)：下坠感、不适感明显，或有便频但排便困难而量少，较少出现腹痛或肛门烧灼感。IV 级(3分)：经常出现腹痛或肛门烧灼感，影响排便。
将粪便性状根据布里斯托(Bristol)粪便性状分类法分为I-III级，统计积分值：I级(0分)：像香肠或蛇，平滑而且软；像香肠，但在它的表面有裂痕；软的团块，有明显的边缘(容易排出)。II级(1分)：香肠形状，但有团块；松散的块状，边缘粗糙，像泥浆状的粪便。III级(2分)：分离的硬团，像果核(不易排出)。
4、实验结果
(1)对短链脂肪酸的影响
短链脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)含量是益生菌缓解便秘效果的重要评价指标，SCFAs同时也是肠道微生态与慢性便秘关系的重要靶点。在近端结肠端，丁酸能加快结肠长传播频率，抑制短传播频率，乙酸、丙酸均抑制长短传播，而在远端结肠端，丁酸加快结肠推进速度，丙酸减慢结肠推进速度。
如下表所示，低剂量组Lc19菌粉干预前后，乙酸含量增加20.09％，丙酸增加31.51％，丁酸增加20.37％，总酸(乙酸、丙酸、丁酸含量的总和) 增加19.66％，高剂量组Lc19菌粉干预前后，乙酸含量增加37.63％，丙酸增加30.88％，丁酸增加35.29％，总酸增加35.38％。人群试食前后，乙酸、丙酸、丁酸、总酸含量均上升。
表3 Lc19菌粉对便秘人群短链脂肪酸的影响
Figure RE-GDA0002695148490000141
(2)对便秘特征肠道菌群的影响
选取与便秘相关的9种有益菌属，便秘人群与健康人群相比，下述9 种有益菌属的丰度均有不同程度的降低，从下表可以看出，本发明Lc19菌粉提升了9个与排便状况和粪便性状相关有益菌的丰度，提升了8个与排便次数相关有益菌的丰度。
表4 Lc19菌粉对便秘人群粪便中肠道菌群水平的影响
Figure RE-GDA0002695148490000142
Figure RE-GDA0002695148490000151
选取与便秘相关的4种有害菌属，便秘人群与健康人群相比，下述4 种有害菌属的丰度均有不同程度的提升，从下表可以看出，本发明Lc19菌粉降低了3个与排便次数相关的有害菌的丰度，降低了3个与粪便性状相关有害菌的丰度，降低4个与排便状况相关有益菌的丰度。
表5 Lc19菌粉对便秘人群粪便中肠道菌群水平的影响
Figure RE-GDA0002695148490000152
Figure RE-GDA0002695148490000161
便秘人群与健康人群相比，拟杆菌门(Bacteroidetes)丰度减少、厚壁菌门(Firmicutes)丰度增加、变形菌门丰度减少(Proteobacteria)。由下表所示，食用Lc19菌粉后，三种优势菌门均趋于向健康人群转变，Lc19 菌粉减少了便秘人群的厚壁菌门丰度，增加了拟杆菌门和变形菌门的丰度。
表6 Lc19对便秘人群优势菌门的影响
Figure RE-GDA0002695148490000162
本发明中便秘特征肠道菌群的有益菌属和有害菌属可以参照下述文献：Huang,Lin Sheng,et al(2018).Analysis of fecal microbiota in patients withfunctional constipation undergoing treatment with synbiotics.European Journalof Clinical Microbiology&Infectious Diseases Official Publication of theEuropean Society of Clinical Microbiology 37.3.
Khalif IL,Quigley EM,Konovitch EA,Maximova ID(2005)Alterations in thecolonic flora and intestinal permeability and evidence of immune activationin chronic constipation.Dig Liver Dis 37(11):838–849.
(3)对排便状况的影响
下表为受试者在服用Lc19菌粉前(干预前，第0天)以及连续服用21 天Lc19菌粉(干预后，第21天)的排便次数、排便状况和粪便性状的统计结果，下述中各组测试得分为每组所有患者的积分之和除以每组人数，由结果可知，Lc19菌粉干预前后比较，干预之后排便次数极显著增加 (P<0.001)，最后一次排便状况积分极显著降低(P<0.01)，最后一次粪便性状积分极显著降低(P<0.01)。结果表明Lc19菌粉可提高便秘人群的排便次数，减少排便不适，形成软便，从而显著改善排便状况。
表7干预前后排便情况比较(x±SD)
Figure RE-GDA0002695148490000171
综上所述，本发明制得的副干酪乳杆菌Lc19能靶向提升与排便状况、排便次数及粪便性状相关的有益菌群的丰度，抑制与排便状况、排便次数及粪便性状相关的炎症性有害菌群丰度，维持肠道菌群的平衡，恢复肠道菌群的健康化，达到显著改善患者便秘情况的效果；而且本发明的副干酪乳杆菌Lc19还能够显著提升肠道菌群代谢产物短链脂肪酸的含量，显著改善便秘人群的排便状况。
实验例2
1、试验方法
(1)实验动物与分组处理
8周龄SPF级BALB/c野生型雄性小鼠，19±1g，自由饮水和采食，适应1周。适应期结束后将小鼠随机分为4组，每组10只，分别为正常组、 DSS(葡聚糖硫酸钠)阳性对照组、低剂量Lc19组和高剂量Lc19组，除正常组外，其他各组按照如下处理，其中，低剂量Lc19组和高剂量Lc19 组分别灌胃本实施例2制得的Lc19菌粉的水溶液，低剂量Lc19组每kg小鼠体重灌胃给予8.0×109个，灌胃体积为0.2ml，高剂量Lc19组每kg给予 4.0×1010个，灌胃体积为0.2ml，正常组和DSS阳性对照组灌胃给予相同体积的生理盐水，为期7天。从第8天开始，除正常组，DSS阳性对照组灌胃0.2mL生理盐水和同时自由饮用2.5％(w/v)DSS水溶液，自由饮用7 天；而试验组灌胃0.2mL产品的同时自由饮用2.5％(w/v)DSS水溶液，自由饮用7天，实验周期共14天。
(2)在实验期间，每日称量小鼠体重、进食量和饮水量，每日观察粪便样品便血和便质情况，并通过疾病活动指数(DAI)对各组小鼠实验第 14天的粪便便血、便质和体重下降三项指标定量评分，具体评分标准见下表。
表8结肠炎疾病活动指数
体重下降(％) 粪便样品 便血 计分
没有 完整干燥的粪便颗粒 没有出血 0
0-5 较软的颗粒 隐匿性出血 1
5-10 松散 轻微出血 2
10-15 潮湿粪便 中度出血 3
>15 腹泻 严重出血 4
(3)实验结束后，对小鼠用乙醚麻醉摘眼球快速采集血液样本，采用 TNF-α，IFN-γ，IL-6，IL-4，IL-10ELISA检测试剂盒(均购自南京建成生物工程研究所)并按照试剂盒说明书的方法分别检测血清中TNF-α，IFN-γ，IL-6，IL-4，IL-10水平。
(4)在实验第14天收集各组小鼠的新鲜粪便样品，委托上海美吉生物 DNA测序公司对粪便样品进行16SrRNA高通量测序，以测定副干酪乳杆菌 Lc19对DSS致急性溃疡性结肠炎小鼠肠道菌群的影响。
(5)结肠组织病理切片的制作和苏木素-伊红(HE)染色
采用颈椎脱臼法处死，迅速取出结肠，纵向切开，PBS清洗，测量结肠长度。取实验小鼠远端结肠组织0.6cm，于PBS中清洗3次，将各组结肠样本依次编号，分别置于1.5ml的离心管中，倒入10％的福尔马林1ml 常温放置24h，固定后，采用蒸馏水冲洗2-3次，以此除去渗入到结肠样本中多余的固定液，在50℃的恒温培养箱中，依次使用体积百分数为70％、80％的乙醇水溶液脱水90min，转至95％的乙醇水溶液中脱水1h，最后于无水乙醇中脱水2次，时间均为35min，将脱水后的组织样本移至无水乙醇与二甲苯(1：1)混合液中放置45min后，转至二甲苯中保持20min，直至结肠样本呈半透明状，透明后将切片移入二甲苯与石蜡混合液(1：1)中， 60℃放置30min，再在熔化的石蜡中保持3h(每隔1h更换1次石蜡)后；采用镊子将其放置到盛有石蜡的模具，并进行包埋，在40℃的水浴锅中展开6μm厚的结肠组织石蜡包埋切片，贴至洁净的载玻片上，65℃烘箱中烤片1h，连续2次将切片移入二甲苯溶液，保持10min溶去切片上的石蜡。然后依次经由：二甲苯与无水乙醇(1：1)混合液-无水乙醇(2次)-95％乙醇-85％乙醇-70％乙醇各处理3min后，放入蒸馏水中浸5min，采用苏木素 -伊红染液；苏木素8min-自来水冲刷-1％盐酸溶液30s-自来水20min-75％、 85％乙醇中各5min-伊红2min-95％、无水乙醇2次各5min-无水乙醇与二甲苯混合液(1：1)、二甲苯3次各5min，然后在光镜下观察炎症浸润情况。
(6)免疫组化分析
委托北京博知源生物科技有限公司采用免疫组化检测方法测试各组小鼠的结肠组织中的肠道紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、E-cadherin、Claudin1 的表达情况，并按照下述表格评分标准对各蛋白表达量进行评分。
表9免疫组化蛋白表达量评分标准
评分 染色范围(％) 显色情况
0 0 阴性
1 <30％ 轻度阳性
2 30％-60％ 中度阳性
3 >60％ 重度出血
注：总评分＝染色范围+显色情况，其中阴性：蛋白不表达；轻度阳性：蛋白少量表达；中度阳性：显色为黄褐色或蛋白表达量较多；重度阳性：显色呈棕褐色，大量表达。
2、试验结果
(1)各组结肠炎小鼠的DAI评分结果
从下表可以看出，模型组小鼠的DAI评分最高，显著高于对照组、低剂量Lc19组和高剂量Lc19组，低剂量Lc19组和高剂量Lc19组小鼠的DAI 评分与模型组相比显著降低，且Lc19菌粉对小鼠结肠炎的改善效果呈现剂量依赖性。
表10各组结肠炎小鼠DAI评分(n＝9)
Figure RE-GDA0002695148490000201
Figure RE-GDA0002695148490000211
其中，b表示与模型组相比，p<0.05；a表示与对照组组相比，p<0.05。
(2)各组小鼠结肠长度
处死小鼠当日观察记录各组小鼠结肠病变情况，解剖之后取出的各组小鼠结肠长度如下表所示，发现正常组小鼠结肠长度最长、肠道组织完好、肠腔内粪便成形；模型组小鼠结肠长度最短，肠壁变薄，肠腔内可见不成形便，部分小鼠肠腔内有暗红色血便；低剂量Lc19组和高剂量Lc19组的结肠长度与对照组没有显著差异，恢复到正常水平。
表11 Lc19对小鼠结肠长度的影响
组别 结肠长度(cm)
对照组 10.6±0.13
模型组 9.51±0.19
低剂量Lc19组 10.15±0.20
高剂量Lc19组 10.32±0.12
(3)对结肠炎特征肠道菌群的影响
表12 Lc19对小鼠粪便肠道菌群水平的影响
组别 厚壁菌门 拟杆菌门 厚壁/拟杆 变形菌门
对照组 39.20％ 57.71％ 0.6793 0.15％
模型组 33.54％↓ 63.73％↑ 0.5263↓ 0.75％↑
低剂量Lc19组 35.15％↑ 52.38％↓ 0.6715↑ 0.46％↓
高剂量Lc19组 37.32％↑ 60.88％↓ 0.6130↑ 0.21％↓
与对照组相比，模型组的厚壁菌门的丰度降低，拟杆菌门的丰度增加，厚壁菌门与拟杆菌门的丰度比降低，变形菌门的丰度增加；而Lc19菌粉干预后肠道菌群门水平趋于向对照组转变，与模型组相比，低剂量Lc19组和高低剂Lc19组的中厚壁菌门的丰度增加，拟杆菌门的丰度减少，厚壁菌门与拟杆菌门的比有所恢复，变形菌门的丰度降低。
表13各组小鼠粪便肠道菌属中的有益菌属的相对丰度
Figure RE-GDA0002695148490000212
Figure RE-GDA0002695148490000221
对相对丰度大于1％的菌属进行分析，各组各个菌属的相对丰度变化情况如下表所示，与结肠炎相关益生菌有8种，与对照组相比，模型组有7 种含量降低，与模型组相比，低剂量Lc19组和高剂量Lc19组分别有7种和8种有益菌丰度升高。
表14各组小鼠粪便肠道菌群中的有害菌属的相对丰度
Figure RE-GDA0002695148490000222
与结肠炎相关的有害菌有5种，与对照组相比，模型组有5种有害菌的丰度增加，而低剂量Lc19组和高剂量Lc19组分别有4种和5种有害菌的丰度降低。
本发明中结肠炎特征肠道菌群的有益菌属和有害菌属可以参照下述文献：NezarNoor Al-Hebshi,Akram Thabet Nasher,Mohamed Yousef Maryoud, et al.InflammatoryBacteriome Featuring Fusobacterium Nucleatum and Pseudomonas AeruginosaIdentified in Association With Oral Squamous Cell Carcinoma[J].Sci Rep.2017,7(1):1834.
Yi Cui,Hongyun Wei,Fanggen Lu,et al.Different Effects of ThreeSelected Lactobacillus Strains in Dextran Sulfate Sodium-Induced Colitis inBALB/c Mice[J].PLoS One.2016,11(2):e0148241.
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(4)对结肠组织切片的HE染色结果
如图1-4所示，正常组小鼠的结肠黏膜结构保持完整，隐窝正常，腺体排列整齐，未见黏膜溃烂，无炎性细胞的浸润。模型组小鼠的结肠黏膜组织结构损伤明显，光镜下可见黏膜严重缺损、出血，腺体、隐窝破坏，炎症细胞浸润严重，深度达整个黏膜层，部分小鼠累及黏膜下层，表明小鼠 UC模型造模成功。低剂量Lc19组小鼠的组织黏膜层损伤，局部肠腺结构消失，被增生的结缔组织取代，伴有少量炎性细胞浸润。高剂量Lc19组小鼠的组织结构完整，上皮细胞形态正常，未见脱落，肠腺数量丰富，排列紧密，形态正常，肠腔内可见少量脱落的上皮样细胞。
综上，低剂量Lc19菌粉和高剂量Lc19菌粉均可有效保护结肠组织结构完整性，减少炎症细胞浸入。
(5)对炎症因子表达情况的影响
表15小鼠血清中炎症因子的表达情况
Figure RE-GDA0002695148490000241
用ELISA法测定了小鼠血清中的的炎症因子水平，与对照相比，模型组中促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-6的表达量显著升高，抗炎因子IL-4和IL-10 的表达量显著下降。与模型组相比，低剂量Lc19和高剂量Lc19均显著下调促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-6的表达量，上调抗炎因子IL-4和IL-10的表达量，从而显著小鼠体内的炎症水平。
(6)对小鼠结肠组织进行免疫组化分析
表16紧密连接蛋白免疫组化评分
Figure RE-GDA0002695148490000242
结果如上表所示，与对照组相比，模型组小鼠的紧密连接蛋白ZO-1、 Occludin、E-cadherin的表达量显著降低，与模型组相比，Lc19低剂量组和Lc19高剂量组的ZO-1、Occludin、E-cadherin的表达量显著上调，维持了结肠组织的完整性。
综上所述，本发明制得的副干酪乳杆菌Lc19的菌粉，可以靶向性改善结肠炎特征肠道菌群，提升与结肠炎相关有益菌丰度，降低与结肠炎相关有害菌丰度，恢复肠道菌群的健康化，达到显著改善小鼠溃疡性结肠炎(UC) 的效果；本发明制得的副干酪乳杆菌Lc19的灭活菌粉，能通过降低促炎因子分泌，提升抗炎因子分泌，改善体内炎症状态；通过上调结肠组织紧密连接蛋白的表达，维持结肠组织的完整性。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (13)

1.一种副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)Lc19，已保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，其保藏编号是CGMCC NO.17827。
2.一种微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂是以副干酪乳杆菌Lc19、副干酪乳杆菌Lc19的灭活物或副干酪乳杆菌Lc19的处理物为活性成分的微生物制剂。
3.根据权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于，所述副干酪乳杆菌Lc19的处理物为副干酪乳杆菌Lc19的培养物、浓缩物、干燥物、稀释物和所述培养物的提取物中的至少一种。
4.根据权利要求2或3所述的微生物制剂，其特征在于，还包括至少一种适合于微生物制剂的赋形剂；所述微生物制剂为粉末、丸剂、胶囊、颗粒剂、片剂、液体制剂或者凝胶剂。
5.根据权利要求2-4中任一所述的微生物制剂，其特征在于，还包括至少一种其他活性物质；所述其他活性物质为用于制备调节肠道菌群失调的产品的其他益生菌、益生元和果蔬粉中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的微生物制剂，其特征在于，所述其他益生菌为乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)MN-Gup，所述乳双歧杆菌MN-Gup已保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，其保藏编号是CGMCC NO.15578；
所述益生元选自水苏糖、棉籽糖、低聚半乳糖、低聚果糖、菊粉、果蔬粉和抗性糊精中的至少一种；
所述果蔬粉选自南瓜粉、蓝莓粉、山楂粉、大枣粉、沙棘粉、木瓜粉、桑葚粉和草莓粉中的至少一种。
7.根据权利要求2-6中任一所述的微生物制剂，其特征在于，以每克微生物制剂为基准，所述副干酪乳杆菌Lc19含量为≥1010个/g，优选为5×1010-6×1011个/g。
8.一种微生物制剂的制备方法，其特征在于，以权利要求1所述的副干酪乳杆菌Lc19为菌种进行培养，得到微生物制剂。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，在所述培养步骤之后还包括离心，收集湿菌体，加入保护剂进行真空干燥的步骤。
10.权利要求1所述的副干酪乳杆菌Lc19、权利要求2-7中任一所述的微生物制剂或者权利要求8或9所述的制备方法制得的微生物制剂具有如下的(1)-(8)项中的至少一项用途：
(1)在制备提高短链脂肪酸含量的产品中的用途；
(2)在制备调节便秘特征肠道菌群的产品中的用途；
(3)在制备预防、缓解或改善便秘的产品中的用途；
(4)在制备调节结肠炎特征肠道菌群的产品中的用途；
(5)在制备抑制促炎因子TNF-α、IFN-γ和IL-6的表达的产品中的用途；
(6)在制备促进抗炎因子IL-4和IL-10的表达的产品中的用途；
(7)在制备促进紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、E-cadherin的表达的产品中的用途；
(8)在制备预防、缓解或改善炎症性肠病的产品中的用途。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述短链脂肪酸为乙酸、丙酸和丁酸中的至少一种；
所述调节便秘特征肠道菌群是指提高便秘特征肠道菌群中有益菌属Dorea、Anaerostipes、Ruminococcus_2、Blautia、Lactobacillus、Bifidobacterium、unclassified_f__Lachnospira、[Eubacterium]_hallii_group和/或Roseburia的丰度；抑制便秘特征肠道菌群中有害菌属Erysipelotrichaceae_UCG-003、Alistipes、[Ruminococcus]_torques_group和/或[Ruminococcus]_gnavus_group的丰度；
所述炎症性肠病为结肠炎和/或克罗恩病；
所述调节结肠炎特征肠道菌群是指提高结肠炎特征肠道菌群中有益菌属norank_f_Muribaculaceae、Prevotellaceae_UCG-001、Alloprevotella、Ruminococcaceae_UCG-014、Lactobacillus、Muribaculum、Unclassified_f_Ruminococcaceae和/或Akkermansia的丰度；抑制结肠炎特征肠道菌群中有害菌属Lachnospiraceae_NK4A136_group、Alistipes、Bacteroides、Odoribacter和/或Erysipelatoclostridium的丰度。
12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，所述便秘为功能性便秘；所述结肠炎为溃疡性结肠炎。
13.根据权利要求10-12中任一所述的用途，其特征在于，以产品的菌数为基准，所述产品的每日有效剂量为≥1010个，优选为5×1010-5×1011个。
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