CN117987330A - 具有清除自由基、缓解便秘作用的副干酪乳杆菌gf027冻干粉的制备方法及应用 - Google Patents

具有清除自由基、缓解便秘作用的副干酪乳杆菌gf027冻干粉的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了具有清除自由基、缓解便秘作用的副干酪乳杆菌GF027冻干粉的制备方法及应用,属于微生物技术领域。本发明将副干酪乳杆菌GF027接种到半固体发酵培养基中,发酵结束后,直接加入冻干保护剂,充分混匀后进行冷冻干燥,得到副干酪乳杆菌GF027冻干粉。本发明通过采用改进的半固体发酵培养基,省去了菌体离心步骤,可以在发酵产物中直接加入冻干保护剂,得到食品级副干酪乳杆菌GF027冻干粉。本发明所得副干酪乳杆菌GF027冻干粉具有清除DPPH自由基和缓解便秘的作用,可用于后期相关产品的开发。

Description

具有清除自由基、缓解便秘作用的副干酪乳杆菌GF027冻干粉 的制备方法及应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域,尤其涉及具有清除自由基、缓解便秘作用的副干酪乳杆菌GF027冻干粉的制备方法及应用。
背景技术
副干酪乳杆菌GF027保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC NO .22831,保藏时间为2021年07月06日,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。专利CN202311142064.0中公开了副干酪乳杆菌GF027可以帮助提高记忆,改善和提高儿童的生长发育,增加血清中的IGF-1水平,对儿童的生长发育有促进作用。同时,该专利中还给出了副干酪乳杆菌GF027的发酵培养方法,给出了副干酪乳杆菌GF027发酵培养基为:葡萄糖20g/L、牛肉浸粉5g/L、酵母浸粉902 10g/L、胰蛋白胨10g/L、玉米浆粉15g/L,乙酸钠5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸锰0.05g/L。但由于副干酪乳杆菌GF027菌体较为丝滑,凝聚力偏低,难以进行离心沉降,离心获得的菌体量较少,生产工艺存在一定的瓶颈。并且,已公开的副干酪乳杆菌GF027发酵培养基为液体发酵,培养基中含有大量无机盐、蛋白胨等成分,导致发酵产物需要再次处理(如离心等操作)获得菌体后才能使用,从而难以利用其他具有活性功效的菌体代谢产物且口感不佳。因此,如何对发酵工艺进行改进是充分利用副干酪乳杆菌GF027亟需解决的问题。
便秘是临床上常见的一种消化系统疾病,主要指排便次数少、排便频率低。排便同时伴有腹痛、腹泻等症状。近年来,随着对便秘发病机制的不断探索,发现肠道菌群失调与便秘密不可分,便秘同时伴有肠道菌群失调,肠道菌群失调也会引起便秘的发生,二者互为因果。便秘患者的肠道菌群失调的现象也引起了微生物学家的重视。研究发现口服微生态制剂能够调节肠道菌群,促进肠道菌群代谢产生短链脂肪酸(SCFAs),起到抑制病原菌生长并降低肠道pH促进肠蠕动的功效。因此,服用益生菌来预防和缓解便秘成为一种新思路,如现有技术已报道的副干酪乳杆菌L.CASEI431和副干酪乳杆菌ADP-1就具有一定的肠道保护作用,但目前,对于副干酪乳杆菌GF027冻干粉是否具有缓解便秘的功效尚未报道。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种副干酪乳杆菌GF027冻干粉的制备方法,通过采用改进的半固体发酵培养基,省去了离心步骤,可以在发酵产物中直接加入冻干保护剂,得到食品级副干酪乳杆菌GF027冻干粉。
本发明的目的还在于提供副干酪乳杆菌GF027冻干粉在制备DPPH自由基清除和缓解便秘的产品中的应用。
为了实现上述发明目的,本发明提供了以下技术方案:
本发明提供了一种副干酪乳杆菌GF027冻干粉的制备方法,包括以下步骤:副干酪乳杆菌GF027接种到半固体发酵培养基中,发酵结束后,直接加入冻干保护剂,充分混匀后进行冷冻干燥;
所述半固体发酵培养基按质量份数计,包括以下组分:600~800份β-环糊精、80~120份麦芽粉、80~120份葡萄糖、80~120份玉米胚芽粉和400~600份大枣清汁;所述冻干保护剂包括脱脂乳粉、海藻糖和抗性淀粉。
优选的,所述大枣清汁由大枣熬煮后去渣得到。
优选的,所述副干酪乳杆菌GF027接种量为8~12%。
优选的,所述发酵温度为35~39℃,至pH值下降到3.7~3.9时发酵结束。
优选的,所述脱脂乳粉:海藻糖:抗性淀粉的质量比为80~120:40~60:40~60。
优选的,所述冻干保护剂的添加量为发酵培养基质量的10~15%。
本发明还提供了上述制备方法制备得到的副干酪乳杆菌GF027冻干粉。
本发明还提供了上述副干酪乳杆菌GF027冻干粉在制备具有DPPH自由基清除功效的产品中的应用。
本发明还提供了上述副干酪乳杆菌GF027冻干粉在制备缓解便秘的药物中的应用。
本发明还提供了一种预防和/或缓解便秘的药物,以上述副干酪乳杆菌GF027冻干粉为活性成分。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
本发明针对副干酪乳杆菌GF027的发酵瓶颈,对副干酪乳杆菌GF027进行进一步优化,采用改进的半固体发酵培养基进行发酵,省去了发酵后离心获得菌体的步骤,可以在发酵产物中直接加入冻干保护剂,得到副干酪乳杆菌GF027冻干粉。并且,本发明优化后的发酵培养基成分均为食品级原料,可以直接得到口感较佳的食品级副干酪乳杆菌GF027冻干粉。
本发明制备得到的副干酪乳杆菌GF027冻干粉的活菌含量高,并且副干酪乳杆菌GF027代谢产物具有良好的清除DPPH自由基的功效,清除率可达57.92%,副干酪乳杆菌GF027冻干粉可用于制备具有DPPH自由基清除功效的产品。同时该副干酪乳杆菌GF027冻干粉具有预防和/或缓解便秘的功效,可以缩短便秘小鼠排黑便时间,增加排便粒数,提高粪便含水率。
具体实施方式
本发明提供了一种副干酪乳杆菌GF027冻干粉的制备方法,包括以下步骤:副干酪乳杆菌GF027接种到半固体发酵培养基中,发酵结束后,直接加入冻干保护剂,充分混匀后进行冷冻干燥。
本发明所述副干酪乳杆菌GF027保藏编号为CGMCC NO .22831。
本发明所述半固体发酵培养基按质量份数计,包括以下组分:600~800份β-环糊精、80~120份麦芽粉、80~120份葡萄糖、80~120份玉米胚芽粉和400~600份大枣清汁。所述组分优选为:650~750份β-环糊精、90~110份麦芽粉、90~110份葡萄糖、90~110份玉米胚芽粉和450~550份大枣清汁。所述组分更优选为:700份β-环糊精、100份麦芽粉、100份葡萄糖、100份玉米胚芽粉和500份大枣清汁。
本发明所述大枣清汁由大枣熬煮后去渣得到,优选为大枣去核后,加入2~4倍体积的水进行熬煮,冷却至室温,去渣后留上清即为大枣清汁。所述熬煮优选为煮沸后转小火熬煮50~70min,更优选为1h;所述大枣优选为新疆大枣。
本发明所述半固体发酵培养基成分中,β-环糊精不溶于水,具有孔腔结构,对菌体具有保护作用。在发酵过程中,菌体进入β-环糊精孔腔内,提高菌体的耐热、耐冷冻、耐干燥性能,避免了发酵过程中环境对菌体的不利影响。同时,麦芽粉、玉米胚芽粉、葡萄糖作为碳氮源,大枣清汁可以提供大量的微量元素和营养成分,在满足菌体生长需求的同时,可以直接食用,避免了非食品级原料的添加。
本发明所述半固体发酵培养基的制备方法为:将β-环糊精、麦芽粉、葡萄糖、玉米胚芽粉按比例混匀,干热灭菌后,待温度降低后加入大枣清汁,无菌条件下混匀即可。所述干热灭菌优选为80~90℃灭菌50~70min。
本发明将副干酪乳杆菌GF027接种到半固体发酵培养基中,以半固体发酵培养基的体积计,所述副干酪乳杆菌GF027的接种量为8~12%,优选为9~11%,更优选为10%。
本发明所述发酵温度为35~39℃,优选为36~38℃,更优选为37℃;所述发酵时间优选为22~26h,在发酵期间取样检测pH,至pH值下降到3.7~3.9时发酵结束,所述pH值更优选为3.8。
本发明在发酵结束后直接加入冻干保护剂。本发明所述冻干保护剂包括脱脂乳粉、海藻糖和抗性淀粉,所述脱脂乳粉:海藻糖:抗性淀粉的质量比为80~120:40~60:40~60,优选为90~110:45~55:45~55;更优选为100:50:50。本发明所述冻干保护剂的添加量为发酵培养基质量的10~15%,优选为11~14%,更优选为12~13%。
本发明制备得到的冻干粉成品质量较大,是常规液体发酵后再制备得到的冻干粉产品的10倍~20倍。
本发明在发酵结束后,无需经过离心获得菌体,可以直接在发酵产物中加入冻干保护剂,冻干保护剂干粉直接包裹在β-环糊精外侧,更有利于菌体存活,所得副干酪乳杆菌GF027冻干粉可以直接食用。
本发明将冻干保护剂充分混匀后进行冷冻干燥,得到副干酪乳杆菌GF027冻干粉。所述冷冻干燥条件优选为-80℃冷冻干燥48h。
本发明还提供了上述制备方法制备得到的副干酪乳杆菌GF027冻干粉。所得副干酪乳杆菌GF027冻干粉以β-环糊精为载体,β-环糊精孔腔内载有菌体,β-环糊精外侧包裹有冻干保护剂和菌体发酵产生的蛋白质和糖类物质等代谢产物。本发明制备得到的副干酪乳杆菌GF027冻干粉的活菌含量为1~3×1011cfu/g。
由于副干酪乳杆菌GF027代谢产物的DPPH清除率可达57.92%,制备得到副干酪乳杆菌GF027冻干粉中含有副干酪乳杆菌GF027代谢产物,本发明所述副干酪乳杆菌GF027冻干粉可用于制备具有DPPH自由基清除功效(有助于抗氧化)的产品中的应用,所述产物为药品、食品或保健品。
本发明还提供了上述副干酪乳杆菌GF027冻干粉在制备缓解便秘的药物中的应用,所述副干酪乳杆菌GF027冻干粉可以缩短便秘小鼠排黑便时间,增加排便粒数,提高粪便含水率。
本发明还提供了一种预防或缓解便秘的药物,以上述副干酪乳杆菌GF027冻干粉为活性成分。本发明所述药物包括但不限于颗粒剂、散剂、片剂、口服液。本发明所述药物还包括药物学上可接受的载体。本发明对于药物中所含有的其他辅料成分没有特殊限定,采用本领域药物常用辅料即可。在本发明所述药物中,所述副干酪乳杆菌GF027冻干粉的含量为30~98wt%,优选为60~95%。
下面将结合本发明中的实施例,对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
在本发明具体实施例中,副干酪乳杆菌L. CASEI431购自丹麦科汉森;副干酪乳杆菌ADP-1购自中国台湾景岳生物。
实施例1
一种副干酪乳杆菌GF027冻干粉的制备方法,包括以下步骤:
副干酪乳杆菌GF027冻存管从-80℃取出,室温解冻后以3%接种量接种到MRS培养基中进行复壮,37℃静置培养18h至OD600为7.88后,作为副干酪乳杆菌GF027种液保存。
制备半固体发酵培养基:新疆大枣去核后加入3倍纯化水进行熬煮,煮沸后小火熬煮1h。待室温后,无菌条件下去渣留上清,上清液即为大枣清汁。700g β-环糊精、100g麦芽粉、100g葡萄糖、100g玉米胚芽粉混匀后80℃干热灭菌1h,待温度降低后加入500g大枣清汁,无菌条件下混匀。
副干酪乳杆菌GF027种液按接种量10%(体积)加入到半固体发酵培养基中,混匀,37℃条件下静置培养24h,期间取样检测pH,当pH下降到3.8时,发酵结束。
发酵结束后,加入干热灭菌的100g脱脂乳,50g海藻糖,50g抗性淀粉,对其进行充分混匀。混匀后对其进行-80℃冷冻干燥48h,得到副干酪乳杆菌GF027冻干粉。
实施例2
一种副干酪乳杆菌GF027冻干粉的制备方法,与实施例1的区别仅在于:
制备半固体发酵培养基:新疆大枣去核后加入2倍纯化水进行熬煮,煮沸后小火熬煮1h。待室温后,无菌条件下去渣留上清,上清液即为大枣清汁。600g β-环糊精、80g麦芽粉、80g葡萄糖、80g玉米胚芽粉混匀后80℃干热灭菌1h,待温度降低后加入400g大枣清汁,无菌条件下混匀。
实施例3
一种副干酪乳杆菌GF027冻干粉的制备方法,与实施例1的区别仅在于:
制备半固体发酵培养基:新疆大枣去核后加入4倍纯化水进行熬煮,煮沸后小火熬煮1h。待室温后,无菌条件下去渣留上清,上清液即为大枣清汁。800g β-环糊精、120g麦芽粉、120g葡萄糖、120g玉米胚芽粉混匀后80℃干热灭菌1h,待温度降低后加入600g大枣清汁,无菌条件下混匀。
实施例4
一种副干酪乳杆菌GF027冻干粉的制备方法,与实施例1的区别仅在于:
副干酪乳杆菌GF027种液按接种量12%(体积)加入到半固体发酵培养基中,混匀,37℃条件下静置培养24h,期间取样检测pH,当pH下降到3.8时,发酵结束。
实施例5
一种副干酪乳杆菌GF027冻干粉的制备方法,与实施例1的区别仅在于:
发酵结束后,加入干热灭菌的80g脱脂乳,40g海藻糖,40g抗性淀粉,对其进行充分混匀。混匀后对其进行-80℃冷冻干燥48h,得到副干酪乳杆菌GF027冻干粉。
实施例6
一种副干酪乳杆菌GF027冻干粉的制备方法,与实施例1的区别仅在于:
发酵结束后,加入干热灭菌的120g脱脂乳,60g海藻糖,60g抗性淀粉,对其进行充分混匀。混匀后对其进行-80℃冷冻干燥48h,得到副干酪乳杆菌GF027冻干粉。
对实施例1~实施例6制备得到的副干酪乳杆菌GF027冻干粉进行活菌检测,活菌数分别为1.5×1011cfu/g、2.8×1011cfu/g、1.1×1011cfu/g、1.9×1011cfu/g、2.4×1011cfu/g、1.3×1011cfu/g。
对比例1
一种副干酪乳杆菌GF027冻干粉的制备方法:
副干酪乳杆菌GF027冻存管从-80℃取出,室温解冻后以3%接种量接种到MRS培养基中进行复壮,37℃静置培养18h至OD600为7.88后,作为副干酪乳杆菌GF027种液保存。
副干酪乳杆菌GF027发酵培养基为:葡萄糖20g/L、牛肉浸粉5g/L、酵母浸粉90210g/L、胰蛋白胨10g/L、玉米浆粉15g/L,乙酸钠5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸锰0.05g/L。
副干酪乳杆菌GF027种液按接种量10%(体积)加入到发酵培养基(1L)中,混匀,37℃条件下静置培养24h,期间取样检测pH,当pH下降到3.8时,发酵结束。
发酵结束后,对发酵液进行离心去弃上清得到30g菌泥,加入干热灭菌的20g脱脂乳,10g海藻糖,10g抗性淀粉,对其进行充分混匀。混匀后对其进行-80℃冷冻干燥48h,得到副干酪乳杆菌GF027冻干粉。
对副干酪乳杆菌GF027冻干粉进行检测活菌检测为6.9×1011cfu/g,对菌粉添加麦芽糊精稀释至1.8×1011cfu/g,用于下边实验保持菌体活菌数偏差不大。
对比例2
一种副干酪乳杆菌GF027冻干粉的制备方法,与实施例1的区别仅在于:
制备半固体发酵培养基:700g β-环糊精、100g麦芽粉、100g葡萄糖、100g玉米胚芽粉混匀后80℃干热灭菌1h,待温度降低后加入500g无菌水,无菌条件下混匀。
对比例3
一种副干酪乳杆菌GF027冻干粉的制备方法,与实施例1的区别仅在于:
制备半固体发酵培养基:新疆大枣去核后加入3倍纯化水进行熬煮,煮沸后小火熬煮1h。待室温后,无菌条件下去渣留上清,上清液即为大枣清汁。700g淀粉、100g麦芽粉、100g葡萄糖、100g玉米胚芽粉混匀后80℃干热灭菌1h,待温度降低后加入500g大枣清汁,无菌条件下混匀。
对比例4
一种副干酪乳杆菌GF027冻干粉的制备方法,与实施例1的区别仅在于:
制备半固体发酵培养基:新疆大枣去核后加入3倍纯化水进行熬煮,煮沸后小火熬煮1h。待室温后,无菌条件下去渣留上清,上清液即为大枣清汁。700g抗性淀粉、100g麦芽粉、100g葡萄糖、100g玉米胚芽粉混匀后80℃干热灭菌1h,待温度降低后加入500g大枣清汁,无菌条件下混匀。
对比例5
一种副干酪乳杆菌GF027冻干粉的制备方法,与实施例1的区别仅在于:
制备半固体发酵培养基:新疆大枣去核后加入3倍纯化水进行熬煮,煮沸后小火熬煮1h。待室温后,无菌条件下去渣留上清,上清液即为大枣清汁。700g多孔淀粉、100g麦芽粉、100g葡萄糖、100g玉米胚芽粉混匀后80℃干热灭菌1h,待温度降低后加入500g大枣清汁,无菌条件下混匀。
对比例6
一种副干酪乳杆菌GF027冻干粉的制备方法,与实施例1的区别仅在于:
制备半固体发酵培养基:新疆大枣去核后加入3倍纯化水进行熬煮,煮沸后小火熬煮1h。待室温后,无菌条件下去渣留上清,上清液即为大枣清汁。700g β-环糊精、100g葡萄糖、200g玉米胚芽粉混匀后80℃干热灭菌1h,待温度降低后加入500g大枣清汁,无菌条件下混匀。
对比例7
一种副干酪乳杆菌GF027冻干粉的制备方法,与实施例1的区别仅在于:
制备半固体发酵培养基:新疆大枣去核后加入3倍纯化水进行熬煮,煮沸后小火熬煮1h。待室温后,无菌条件下去渣留上清,上清液即为大枣清汁。700g β-环糊精、100g葡萄糖、200g麦芽粉混匀后80℃干热灭菌1h,待温度降低后加入500g大枣清汁,无菌条件下混匀。
对比例8
一种副干酪乳杆菌GF027冻干粉的制备方法,与实施例1的区别仅在于:
制备半固体发酵培养基:新疆大枣去核后加入3倍纯化水进行熬煮,煮沸后小火熬煮1h。待室温后,无菌条件下去渣留上清,上清液即为大枣清汁。700g β-环糊精、100g葡萄糖、200g大豆蛋白粉混匀后80℃干热灭菌1h,待温度降低后加入500g大枣清汁,无菌条件下混匀。
对比例9
一种副干酪乳杆菌L.CASEI431冻干粉的制备方法:
制备方法与实施例1相同,区别仅在于将副干酪乳杆菌GF027替换为副干酪乳杆菌L.CASEI431。
对比例10
一种副干酪乳杆菌ADP-1冻干粉的制备方法:
制备方法与实施例1相同,区别仅在于将副干酪乳杆菌GF027替换为副干酪乳杆菌ADP-1。
试验例1
对实施例1和对比例1分别制备得到的副干酪乳杆菌GF027冻干粉进行37℃恒温加速实验检测其活菌稳定性,结果见表1。
表1 不同发酵方法所得副干酪乳杆菌GF027冻干粉活菌稳定性
由表1可知,采用实施例1制备的副干酪乳杆菌GF027冻干粉在37℃条件下稳定性较方法对比例1制备的副干酪乳杆菌GF027冻干粉好,两者存活率相差25%左右。
试验例2
对实施例1和对比例2~10分别在半固体发酵培养基发酵后的发酵活菌数和制备得到的冻干粉的活菌数进行检测,并分别计算各组经冻干后的菌株存活率,结果见表2。
表2 不同副干酪乳杆菌GF027冻干粉的活菌数
由上表可知:在冻干过程中,对于菌体冷冻、冻干保护出现显著差异性:β-环糊精>抗性淀粉>多孔淀粉>淀粉,β-环糊精作为副干酪乳杆菌GF027的冻干保护载体效果更佳。麦芽粉、玉米胚芽粉、大豆蛋白粉氮源丰富,副干酪乳杆菌GF027活菌数提高,其中玉米胚芽粉活菌数最高,麦芽粉含有的糖和氮源非常适合副干酪乳杆菌GF027菌体生长,大豆蛋白粉加入后豆腥味略高,可能会对产品带来不好影响,所以舍去不添加。
副干酪乳杆菌GF027、副干酪乳杆菌L.CASEI431、副干酪乳杆菌ADP-1在相同条件下制备的冻干粉,冻干存活率无差异性,发酵与冻干活菌数存在不同,其中副干酪乳杆菌GF027发酵性能和冻干活菌数高于其他两个菌株。
试验例3
采用实施例1和对比例9~10分别制备得到的冻干粉进行缓解便秘小鼠实验。
制备复方地芬诺酯(康普药业)混悬液:2片复方地芬诺酯片(2.5mg/片)研磨成粉,加入2.5ml水均匀混合。
SPF级(无特定病原体动物)昆明小鼠(Kunming,KM小鼠)60只(河北医科大学动物实验中心提供),18.0~22.0g,雌雄各半,随机分成6组,每组10只,其中一组为对照组,其余5组为实验组。对照组:生理盐水0.1ml/只灌胃,1次/天;实验组:复方地芬诺酯混悬液10.0mg/kg灌胃1次/天。
各组小鼠在给药前一天和最后一次灌胃30min后分别给与碳粉液(0.1ml/10g)测定粪便参数,建立小鼠功能性便秘模型。用碳粉指示液记录首粒黑便时间,收集4h后粪便数量,用电子秤称其湿重。每次收集的粪便称重后烘干,称其干重。含水量=(湿重-干重)/湿重×100%。结果见表3。
表3 小鼠造模实验结果
注:*与造模前对比,P<0.05;#与对照组对比P<0.05。
由上表可知:采用复方地芬诺酯灌胃小鼠后,首粒黑便时间显著延长,粪便含水量、4h粪便数量显著减少,小鼠功能性便秘模型造模成功,可进行缓解便秘实验。
各组以常规饲料继续喂养,实验组分别为模型组、阳性对照组、副干酪乳杆菌GF027组、副干酪乳杆菌L.CASEI431组、副干酪乳杆菌ADP-1组。阳性对照组灌胃培菲康1g/kg;副干酪乳杆菌GF027组、副干酪乳杆菌L.CASEI431组、副干酪乳杆菌ADP-1组分别灌胃由各乳酸菌冻干粉制备的活菌量1.0×1011cfu/ml悬浊液,灌胃剂量1ml/kg;对照组和模型组灌胃等剂量的生理盐水,1次/d。喂食3天后,各组小鼠灌胃碳末混悬液(10mL/kg),再灌胃相应药物或产品,记录每只小鼠首粒黑便的时间,4h内排便总数和黑便数,测定粪便含水率,具体结果见表4。
表4 不同组对便秘小鼠的排便情况影响
注:#与模型组对比,P<0.05。
由上表可知,阳性对照组、副干酪乳杆菌GF027组在灌胃3天相应产品后,小鼠排黑便时间缩短,排便粒数增加,粪便含水率提高,接近正常组水平,与模型组有显著差异性;副干酪乳杆菌L. CASEI431组、副干酪乳杆菌ADP-1组,与模型组相比较对缓解小鼠便秘效果无差异性,可见副干酪乳杆菌GF027冻干粉能有效缓解小鼠便秘。
试验例4
采用实施例1和对比例9~10分别制备得到的冻干粉进行便秘人群试服试验,考察缓解便秘功能的副干酪乳杆菌GF027的功效,具体方法如下:
S1.确定入选标准
年龄18~60岁;符合便秘罗马III标准;病程最少半年;近一周内未服用影响胃肠道动力药物;诊断IBS依据不足;结肠镜或结肠造影检查排除肠道器质性病变及由全身性疾病引起的便秘;近三月满足以下两项或两项以上症状:至少25%的排便感到费力;至少25%的排便为干球状便或硬便;至少25%的排便有不尽感;至少25%的排便有肛门直肠的阻塞感;排便次数每周少于3次。
S2.试服方法
选取符合入选标准的试服人员130人,随机分4组,4组受试者每天早饭30min后温水冲服:Ⅰ组(45人,副干酪乳杆菌GF027冻干粉),Ⅱ组(32人,副干酪乳杆菌L. CASEI431冻干粉),Ⅲ组(37人,副干酪乳杆菌ADP-1冻干粉),Ⅳ组(16人,麦芽糊精),每次3g,连续服用14天。试服期间要求受试者每天根据自身情况填写试服情况记录表。
S3.结果分析
通过试服后,受试者每周排便次数大于3次,每次排便时间小于15min,粪便硬度偏软,排便感觉轻松,视为试服有效结果;试服人员的试服结果经统计见表5。
表5 便秘人群试服结果统计表
由表可知,通过人群试服,排除各组因其他原因引起的干扰,Ⅰ组副干酪乳杆菌GF027效果比Ⅱ组副干酪乳杆菌L.CASEI431、Ⅲ组副干酪乳杆菌ADP-1效果有显著作用,说明副干酪乳杆菌GF027具有显著的功能性缓解便秘的作用。
试验例5
对副干酪乳杆菌GF027的代谢产物功效进行进一步研究:
分别将副干酪乳杆菌GF027种液、副干酪乳杆菌L.CASEI431种液、副干酪乳杆菌ADP-1种液按照3%接种量接种到MRS培养基,37℃静置培养18h后,采用低温高速离心机,在4℃、8000rpm、20min条件下对三菌株培养液进行离心,上清液保存到4℃冰箱用于DPPH自由基清除实验。
对照样品为无菌纯化水,样品为副干酪乳杆菌GF027上清液、副干酪乳杆菌L.CASEI431上清液、副干酪乳杆菌ADP-1上清液。
分别取2mL 0.2mmol/L DPPH乙醇溶液与2mL样品待测液,混合避光反应30min后在517nm处测吸光度值。空白组用无水乙醇代替DPPH溶液;对照组为无水乙醇代替样品与DPPH乙醇溶液混合。
计算公式如下:
DPPH自由基清除率/%=[1-(A1-A2)/A3]×100%
式中:A1为试验组吸光度;A2为空白组吸光度;A3为对照组吸光度。
结果见表6:
表6 不同菌种的DPPH清除率
由表可知:副干酪乳杆菌GF027、副干酪乳杆菌L.CASEI431、副干酪乳杆菌ADP-1上清液均有清除DPPH自由基的作用,其中副干酪乳杆菌L.CASEI431、副干酪乳杆菌ADP-1两菌株清除DPPH自由基的效果无显著差异;副干酪乳杆菌GF027效果最好,其效果超出其他两菌株的1倍以上,说明制备得到的副干酪乳杆菌GF027上清液(代谢产物)具有清除DPPH自由基的功效。表明含有副干酪乳杆菌GF027代谢产物的副干酪乳杆菌GF027冻干粉也具有清除DPPH自由基的功效。
综上结果表明,本发明制备得到的副干酪乳杆菌GF027冻干粉可以清除DPPH自由基,缓解便秘。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种副干酪乳杆菌GF027冻干粉的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:副干酪乳杆菌GF027接种到半固体发酵培养基中,发酵结束后,直接加入冻干保护剂,充分混匀后进行冷冻干燥;
所述半固体发酵培养基按质量份数计,包括以下组分:600~800份β-环糊精、80~120份麦芽粉、80~120份葡萄糖、80~120份玉米胚芽粉和400~600份大枣清汁;所述冻干保护剂包括脱脂乳粉、海藻糖和抗性淀粉。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述大枣清汁由大枣熬煮后去渣得到。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述副干酪乳杆菌GF027接种量为8~12%。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述发酵温度为35~39℃,至pH值下降到3.7~3.9时发酵结束。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述脱脂乳粉:海藻糖:抗性淀粉的质量比为80~120:40~60:40~60。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述冻干保护剂的添加量为半固体发酵培养基质量的10~15%。
7.权利要求1~6任意一项所述的制备方法制备得到的副干酪乳杆菌GF027冻干粉。
8.权利要求7所述的副干酪乳杆菌GF027冻干粉在制备具有DPPH自由基清除功效的产品中的应用。
9.权利要求7所述的副干酪乳杆菌GF027冻干粉在制备缓解便秘的药物中的应用。
10.一种预防和/或缓解便秘的药物,其特征在于,以权利要求7所述的副干酪乳杆菌GF027冻干粉为活性成分。
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