CN118059137A - 植物乳杆菌zdy2013在制备缓解二型糖尿病的复合微生态制剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种植物乳杆菌ZDY2013在制备缓解二型糖尿病的复合微生态制剂中的应用。本发明还提供了一种缓解二型糖尿病的复合微生态制剂，包括植物乳杆菌ZDY2013、肠道微生物可获得性糖和冻干保护剂。通过肠道微生物可获得性糖和冻干保护剂的加入大大增加了植物乳杆菌在二型糖尿病大鼠肠道中的定植量，进一步地增强了降低空腹血糖，空腹胰岛素，糖化血红蛋白的水平，维持机体胰岛素稳态，改善患者的葡萄糖耐量及胰岛素抵抗状态并增强胰岛素敏感性的能力，从而有效维持糖尿病大鼠血糖水平，具有优异的降血糖效果，从而延缓二型糖尿病及其并发症的发生发展，并且安全可靠，无副作用，具有广阔的应用前景。

Description

植物乳杆菌ZDY2013在制备缓解二型糖尿病的复合微生态制 剂中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种植物乳杆菌ZDY2013在制备缓解二型糖尿病的复合微生态制剂中的应用。

背景技术

目前，大诸多证据表明，COVID-19在一型或二型糖尿病患者中的严重程度和死亡率显着增加。近年来，随着生物信息学和宏基因组学的快速发展，有诸多研究表明肠道菌群失调与二型糖尿病密切相关。人体肠道内产丁酸的细菌减少、条件致病菌增多，可增加肠道内的炎症反应，导致胰岛素抵抗，进而罹患二型糖尿病。

目前二型糖尿病现有的传统治疗药物为磺酰脲类、格列奈类、双胍类及α葡萄糖苷酶抑制剂类等。而长期服用这些药物会引起如腹泻、头晕、恶心、食欲不振、低血糖和肝功能损伤等副作用，严重威胁人们的健康。此外，每日多次注射胰岛素或胰岛素类似物给糖尿病患者带来了诸多痛苦，价格高昂且伴有低血糖的不良反应。

因此，探索更加安全、更加有效，同时又经济的方法缓解糖尿病的症状对于当前形势是十分必要的。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种植物乳杆菌ZDY2013在制备缓解二型糖尿病的复合微生态制剂中的应用，具体采用以下的技术方案：

本发明的第一方面，提供了植物乳杆菌ZDY2013在制备缓解二型糖尿病的复合微生态制剂中的应用。

本发明的第二方面，提供了一种缓解二型糖尿病的复合微生态制剂，其复合微生态制剂包括植物乳杆菌ZDY2013、肠道微生物可获得性糖和冻干保护剂。

本发明提供的复合微生态制剂补充益生菌的同时补充可增殖肠道有益菌的肠道微生物可获得性糖，双管齐下，效果更佳；与公布号为：CN 115737757 A的专利中高剂量的中药-益生菌组相比，该微生态制剂抑制二型糖尿病大鼠糖化血红蛋白升高的能力是高剂量的中药-益生菌组的2倍左右。本发明提供的复合微生态制剂中，在活菌菌粉中创新加入了肠道微生物可获得性糖，其不仅可以提高植物乳杆菌ZDY2013的存活率，而且增强其缓解二型糖尿病患者糖代谢异常，而起到辅助降糖的功效；同时，所采用的肠道微生物可获得性糖，不被人体吸收，且配方中所添加的配料均不会引起机体代谢异常，适于糖尿病患者使用；此外，本发明还加入了冻干保护剂，通过结合预冻、冷冻工艺，使得到的冻干植物乳杆菌菌粉活性高。

作为进一步优选的实施方式，复合微生态制剂中植物乳杆菌ZDY2013的活菌含量为1×10⁶cfu/g-1×10¹²cfu/g；所述植物乳杆菌ZDY2013于2014年4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2014170，名称为Lactobacillus plantarumZDY2013；地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号。本发明复合微生态制剂中益生菌活菌总含量达到10⁶-10¹²CFU/g，同时可以顺利通过消化道定植在盲肠中，且在持续服用3周达到稳定状态，其能显著降低血糖、维持胰岛素稳态及糖耐量等能力，具有显著的防治二型糖尿病的潜力。

作为进一步优选的实施方式，上述肠道微生物可获得性糖的质量分数为20%-80%，当含量过低时，会影响植物乳杆菌ZDY2013在肠道的定植量及肠道固有乳酸菌的丰富度，同时也不利于微生态制剂在冻干过程中菌株活性的保护；进一步地，上述肠道微生物可获得性糖为低聚木糖、低聚半乳糖、低聚乳果糖、棉子糖、水苏糖中的至少一种。当质量分数20%-80%时，肠道微生物可获得性糖可以增强植物乳杆菌ZDY2013的消化道存活率并增强植物乳杆菌ZDY2013缓解糖代谢异常的能力，促进植物乳杆菌ZDY2013在肠道的定植量的复合微生态制剂，以使得其可以更好地发挥降糖作用。其中，低聚木糖能特异性地促进植物乳杆菌ZDY2013代谢及在消化道内的定植，同时能被乳酸菌、双歧杆菌等肠道益生菌利用，改善肠道菌群结构，从而影响影响机体代谢。

作为进一步优选的实施方式，上述冻干保护剂质量分数为1%-20%，其中，冻干保护剂在菌株冻干成粉剂时对菌株进行保护，提高冻干菌株的存活率，从而增强复合微生态制剂的有效性；上述冻干保护剂包括海藻酸钠、乳清蛋白和维生素E，其中海藻酸钠及乳清蛋白可以显著增强菌株的存活率，维生素E具有良好的抗氧化能力，可以增加复合微生态制剂的抗氧化能力，从而应对肠道中微量的过氧化氢对菌株的胁迫。更优选地，海藻酸钠、乳清蛋白和维生素E的质量分数分别为0.4%-8%、0.4%-8%、0.2%-4%。

作为进一步优选的实施方式，复合微生态制剂的剂型包括口服制剂，包括粉剂、片剂或胶囊剂，可用于营养补充剂、功能食品、保健食品及特殊医学用途食品中。其中，上述的制剂中还包括药学上可以接受的辅料。

本发明的第三方面，还提供了上述缓解二型糖尿病的复合微生态制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将植物乳杆菌ZDY2013置于MRS培养基中培养12-24 h，离心，得到植物乳杆菌ZDY2013菌体；然后加入冻干保护剂进行重悬，冷冻干燥，磨粉，过筛，得到植物乳杆菌ZDY2013冻干菌粉；最后将植物乳杆菌ZDY2013冻干菌粉和肠道微生物可获得性糖混合，最终得到复合微生态制剂。本发明所制得的复合制剂可用于即食服用，能显著降低大鼠的血糖水平，并维持胰岛素稳态及糖耐量，具有良好的防治二型糖尿病的功能，且该复合制剂相比于服用植物乳杆菌ZDY2013裸菌，服用复合制剂可以大大提高植物乳杆菌ZDY2013在盲肠中的定植量，并在第三周达到稳定状态；所述定植量的为10⁹-10¹⁰CFU/g

本发明的有益效果为：本发明提供了植物乳杆菌ZDY2013在制备缓解二型糖尿病的复合微生态制剂中的应用。且本发明还提供了一种复合微生态制剂，该复合微生态制剂不仅可以促进益生菌株-植物乳杆菌ZDY2013在肠道的定植作用，同时可降低空腹血糖及空腹胰岛素水平，调节糖代谢，并显著维持胰岛素稳态，改善患者的糖耐量，延缓二型糖尿病及其并发症的发生发展，且该复合微生态制剂安全可靠，无副作用。且该复合微生态制剂创新地添加了肠道微生物可获得性糖，可起到辅助降糖作用。本发明所制得的复合微生态制剂与使用药物相比，在改善糖尿病的同时，毒副作用小、安全性好，且复合制剂原材料容易获得，制备方法简单，成本低，易于工业化生产。

附图说明

图1所示为本发明复合微生态制剂对二型糖尿病大鼠空腹血糖的测定结果图；

图2所示为本发明复合微生态制剂对二型糖尿病大鼠空腹胰岛素的测定结果图；

图3所示为本发明复合微生态制剂对二型糖尿病大鼠血清中糖化血红蛋白的测定结果图；

图4所示为本发明复合微生态制剂对二型糖尿病大鼠胰岛素稳态的测定结果图；

图5所示为本发明复合微生态制剂对二型糖尿病大鼠口服糖耐量实验中各时间点血糖的变化；

图6所示为本发明复合微生态制剂对二型糖尿病大鼠口服糖耐量曲线下面积的影响；

图7所示为本发明复合微生态制剂及植物乳杆菌ZDY2013裸菌在二型糖尿病大鼠粪便中的检出量。

具体实施方式

以下将结合实施例和附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果进行清楚、完整的描述，以充分地理解本发明的目的、方案和效果。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1

一种缓解二型糖尿病的复合微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）植物乳杆菌ZDY2013菌株的活化

从-80℃冰箱中取出冻存菌株，用接种环进行划线至MRS平板中，37℃静置培养36h，取活化后的单菌落接种于5 mL MRS肉汤培养基，37℃静置培养12 h，传代培养两次，接种量为1%；

（2）植物乳杆菌ZDY2013菌液的制备

取上述活化后的植物乳杆菌ZDY2013在MRS培养基中培养12 h；在6000 rpm条件下离心5 min，得到植物乳杆菌ZDY2013菌体；

（3）复合微生态制剂的制备

将植物乳杆菌ZDY2013菌体用PBS缓冲液清洗3次后加入10 mL质量浓度分别为5%、5%、2%的海藻酸钠、乳清蛋白及维生素E等三种冻干保护剂及质量浓度为78%的肠道微生物可获得糖重悬，将重悬液采用真空冷冻法进行冷冻干燥，得到冻干品，将冻干品进行磨粉，过筛，即得目标产品合微生态制剂粉剂。

实施例2

糖尿病大鼠模型的建立及给药方法

选取3周龄的SD雄鼠18只，适应环境后，根据所测量的体重进行随机、合理地分笼。18只大鼠随机分为对照组，二型糖尿病组及微生态制剂组3组。二型糖尿病组及微生态制剂组，持续饲喂高脂饲料，在第7周对二型糖尿病组及微生态制剂组通过腹腔注射接受两次-三次链脲佐菌素（30 mg/kg）；正常组，持续饲喂普通饲料，在第7周接受两次-三次腹腔注射柠檬酸盐缓冲液，在第八周观察模型的稳定性，空腹血糖水平≥11.1 mmol/L则确定造模成功。

动物分组及给药方法：上述得到的3组，其中，微生态制剂组灌胃给予微生态制剂，每日给药剂量设为1 g/kg，对照组及二型糖尿病组灌胃相同体积的生理盐水。根据体重调整用药剂量，连续给予8周。

实施例3

检测复合微生态制剂对二型糖尿病大鼠空腹血糖的影响

选取3周龄的SD雄鼠18只，适应环境后，根据所测量的体重进行随机、合理地分笼。18只大鼠随机分为对照组，二型糖尿病组及微生态制剂组3组。二型糖尿病组及微生态制剂组，持续饲喂高脂饲料，在第7周对二型糖尿病组及微生态制剂组通过腹腔注射接受两次-三次链脲佐菌素（30 mg/kg），正常组腹腔注射柠檬酸盐缓冲液，在第八周观察模型的稳定性，空腹血糖水平≥11.1 mmol/L则确定造模成功。微生态制剂组，持续灌胃1 g/kg微生态制剂，持续干预8周；对照组及二型糖尿病组，持续灌胃8周生理盐水。实验结束后，对大鼠进行眼球取血，颈椎脱臼法处死大鼠。将眼球采集的血液置于室温过夜凝血，4℃，8000 r/min离心10 min获得血清，测定血清样本中葡萄糖水平，测定结果如图1所示。

由图1可知，在实验的第八周，二型糖尿病组检测空腹血糖≥11.1mmol/L，血糖达到糖尿病标准，造模成功。由图中可以看出复合微生态制剂微生态制剂组，空腹血糖显著低于二型糖尿病组（p<0.01），发挥了其降血糖的作用。

实施例4

检测复合微生态制剂对二型糖尿病大鼠空腹胰岛素的影响

选取3周龄的SD雄鼠18只，适应环境后，根据所测量的体重进行随机、合理地分笼。18只大鼠随机分为对照组，二型糖尿病组及微生态制剂组3组。二型糖尿病组及微生态制剂组，持续饲喂高脂饲料，在第7周对二型糖尿病组及微生态制剂组通过腹腔注射接受两次-三次链脲佐菌素（30 mg/kg），正常组腹腔注射柠檬酸盐缓冲液，在第八周观察模型的稳定性，空腹血糖水平≥11.1 mmol/L则确定造模成功。微生态制剂组，持续灌胃1 g/kg微生态制剂，持续干预8周；对照组及二型糖尿病组，持续灌胃8周生理盐水。实验结束后，对大鼠进行眼球取血，颈椎脱臼法处死大鼠。将眼球采集的血液置于室温过夜凝血，4℃，8000 r/min离心10 min获得血清，通过ELISA试剂盒测定血清样本中胰岛素水平，测定结果如图2所示。

由图2可知，二型糖尿病组大鼠血清中空腹胰岛素含量显著升高（P＜0.01），而微生态制剂组的空腹胰岛素水平与模型组的结果相比均有显著的降低(P＜0.01)，表明二型糖尿病造模成功，且复合微生态制剂可以有效改善大鼠机体中胰岛素的分泌，预防二型糖尿病的发生。

实施例5

检测复合微生态制剂对二型糖尿病大鼠血清糖化血红蛋白水平的影响

选取3周龄的SD雄鼠18只，适应环境后，根据所测量的体重进行随机、合理地分笼。18只大鼠随机分为对照组，二型糖尿病组及微生态制剂组3组。二型糖尿病组及微生态制剂组，持续饲喂高脂饲料，在第7周对二型糖尿病组及微生态制剂组通过腹腔注射接受两次-三次链脲佐菌素（30 mg/kg），正常组腹腔注射柠檬酸盐缓冲液，在第八周观察模型的稳定性，空腹血糖水平≥11.1 mmol/L则确定造模成功。微生态制剂组，持续灌胃1 g/kg微生态制剂，持续干预8周；对照组及二型糖尿病组，持续灌胃8周生理盐水。实验结束后，对大鼠进行眼球取血，颈椎脱臼法处死大鼠。将眼球采集的血液置于室温过夜凝血，4℃，8000 r/min离心10 min获得血清，测定血清样本中糖化血红蛋白的水平，测定结果如图3所示。

由图3可知，二型糖尿病组大鼠血清中糖化血红蛋白的水平显著升高（P＜0.01），表明出现糖尿病症状；微生态制剂组，呈现出显著降低(P＜0.01)。以上结果同样说明复合微生态制剂可以有效维持大鼠机体糖代谢的稳定，有效抑制高脂饮食及链脲佐菌素诱导的糖化血红蛋白水平的升高。

实施例6

检测复合微生态制剂对二型糖尿病大鼠胰岛素抵抗指数的影响

选取3周龄的SD雄鼠18只，适应环境后，根据所测量的体重进行随机、合理地分笼。18只大鼠随机分为对照组，二型糖尿病组及微生态制剂组3组。二型糖尿病组及微生态制剂组，持续饲喂高脂饲料，在第7周对二型糖尿病组及微生态制剂组通过腹腔注射接受两次-三次链脲佐菌素（30 mg/kg），正常组腹腔注射柠檬酸盐缓冲液，在第八周观察模型的稳定性，空腹血糖水平≥11.1 mmol/L则确定造模成功。微生态制剂组，持续灌胃1 g/kg微生态制剂，持续干预8周；对照组及二型糖尿病组，持续灌胃8周生理盐水。实验结束后，对大鼠进行眼球取血，颈椎脱臼法处死大鼠。将眼球采集的血液置于室温过夜凝血，4℃，8000 r/min离心10 min获得血清，采用稳态模式评估法计算胰岛素抵抗指数，即胰岛素抵抗指数=(空腹胰岛素×空腹血糖)/22.51，结果如图4所示。

由图4可知，二型糖尿病组胰岛素抵抗指数显著升高（P＜0.01），表明二型糖尿病造模成功；微生态制剂组，呈现出显著降低(P＜0.01)。以上结果同样说明复合微生态制剂可以有效维持大鼠的胰岛素稳态的稳定。

实施例7

检测复合微生态制剂对二型糖尿病大鼠葡萄糖耐量的影响

选取3周龄的SD雄鼠18只，适应环境后，根据所测量的体重进行随机、合理地分笼。18只大鼠随机分为对照组，二型糖尿病组及微生态制剂组3组。二型糖尿病组及微生态制剂组，持续饲喂高脂饲料，在第7周对二型糖尿病组及微生态制剂组通过腹腔注射接受两次-三次链脲佐菌素（30 mg/kg），正常组腹腔注射柠檬酸盐缓冲液，在第八周观察模型的稳定性，空腹血糖水平≥11.1 mmol/L则确定造模成功。微生态制剂组，持续灌胃1 g/kg微生态制剂，持续干预8周；对照组及二型糖尿病组，持续灌胃8周生理盐水。在灌胃的第八周进行口服糖耐量实验，在实验过程中各个时间点所对应的血糖值如图5所示，曲线下面积如图6所示。

由图5可知，与对照组相比，二型糖尿病组葡萄糖耐量极显著升高（P＜0.01），表明二型糖尿病造模成功；微生态制剂组，呈现出显著降低（P＜0.01）。以上结果同样说明复合微生态制剂对大鼠体内胰岛素耐量的升高是有明显改善作用，有显著的预防效果。

实施例8

检测复合微生态制剂对二型糖尿病大鼠粪便中植物乳杆菌ZDY2013的检出量的影响

选取3周龄的SD雄鼠9只，适应环境后，根据所测量的体重进行随机、合理地分笼。9只大鼠随机分为植物乳杆菌ZDY2013裸菌组及微生态制剂组3组。植物乳杆菌ZDY2013裸菌组，持续灌胃植物乳杆菌与乳清蛋白粉冻干粉1 g/kg，微生态制剂组，持续灌胃1 g/kg微生态制剂，持续干预8周；在实验过程中每七天大鼠盲肠中的植物乳杆菌ZDY2013的检出量如图7所示。

由图7可知，与植物乳杆菌灌胃组相比，复合微生态制剂灌胃后，植物乳杆菌ZDY2013在盲肠中的定植量持续增加，并在第三周达到稳定状态，所述定植量高达10⁹-10¹⁰CFU/g。

尽管本发明的描述已经相当详尽且特别对几个所述实施例进行了描述，但其并非旨在局限于任何这些细节或实施例或任何特殊实施例，而是应当将其视作是通过参考所附权利要求考虑到现有技术为这些权利要求提供广义的可能性解释，从而有效地涵盖本发明的预定范围。此外，上文以发明人可预见的实施例对本发明进行描述，其目的是为了提供有用的描述，而那些目前尚未预见的对本发明的非实质性改动仍可代表本发明的等效改动。

Claims (10)

1.植物乳杆菌ZDY2013在制备防治和/或缓解二型糖尿病的复合微生态制剂中的应用。

2.一种缓解二型糖尿病的复合微生态制剂，其特征在于，所述复合微生态制剂包括植物乳杆菌ZDY2013、肠道微生物可获得性糖和冻干保护剂。

3.根据权利要求2所述的复合微生态制剂，其特征在于，所述复合微生态制剂中植物乳杆菌ZDY2013的活菌含量为1×10⁶ cfu/g-1×10¹² cfu/g；所述植物乳杆菌ZDY2013（Lactobacillus plantarum ZDY2013）于2014年4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2014170。

4.根据权利要求2所述的的复合微生态制剂，其特征在于，所述肠道微生物可获得性糖的质量分数为20%-80%；所述冻干保护剂质量分数为1%-20%。

5.根据权利要求2所述的的复合微生态制剂，其特征在于，所述肠道微生物可获得性糖为低聚木糖、低聚半乳糖、低聚乳果糖、棉子糖、水苏糖中的至少一种。

6.根据权利要求5所述的复合型微生态制剂，其特征在于，所述冻干保护剂包括海藻酸钠、乳清蛋白和维生素E。

7.根据权利要求6所述的复合微型生态制剂，其特征在于，海藻酸钠、乳清蛋白和维生素E的质量分数分别为0.4%-8%、0.4%-8%、0.2%-4%。

8.根据权利要求2所述的复合微生态制剂，其特征在于，复合微生态制剂可以为粉剂、片剂或胶囊剂。

9.权利要求8所述的复合微生态制剂可以应用在营养补充剂、功能食品、保健食品或特殊医学用途食品中。

10.一种权利要求2-8任一项所述的复合微生态制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将植物乳杆菌ZDY2013置于MRS培养基中培养12-24 h，离心，得到植物乳杆菌ZDY2013菌体；然后加入冻干保护剂进行重悬，冷冻干燥，磨粉，过筛，得到植物乳杆菌ZDY2013冻干菌粉；最后将植物乳杆菌ZDY2013冻干菌粉和肠道微生物可获得性糖混合，最终得到复合微生态制剂。