CN114774313A - 鼠李糖乳杆菌LRa05在制备缓解便秘制品或调解肠道菌群制品方面的用途 - Google Patents

鼠李糖乳杆菌LRa05在制备缓解便秘制品或调解肠道菌群制品方面的用途 Download PDF

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Abstract

本发明“鼠李糖乳杆菌LRa05在非治疗目的地抑制病原菌和/或制备缓解便秘制品或调解肠道菌群制品方面的用途”属于微生物技术领域。本发明提供保藏号为CGMCC No.24377的鼠李糖乳杆菌LRa05在非治疗目的地抑制病原菌和/或制备缓解便秘制品或调解肠道菌群制品方面的用途。基于所述鼠李糖乳杆菌LRa05，本发明还提供一种抑菌剂、一种缓解便秘制品和一种调节肠道菌群制品。本发明的鼠李糖乳杆菌LRa05安全无致病性，通过体外试验、小鼠实验、人体试食试验证明其具有调节肠道菌群、缓解便秘功效。

Description

鼠李糖乳杆菌LRa05在制备缓解便秘制品或调解肠道菌群制 品方面的用途
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其是涉及鼠李糖乳杆菌LRa05在制备缓解便秘制品或调解肠道菌群制品方面的用途。
背景技术
鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)多存在于人和动物的肠道内，细菌分类学属于乳杆菌属，是厌氧耐酸、不产芽孢的一种革兰氏阳性益生菌。鼠李糖乳杆菌不能利用乳糖，可发酵多种单糖(葡萄糖、阿拉伯糖、麦芽糖等)，大多数菌株能产生少量的可溶性氨，但不产生吲哚和硫化氢，它具有耐酸、耐胆汁盐、耐多种抗生素等生物学特点。
便秘(chronic constipation，CC)是一种临床常见的下消化道功能性紊乱疾病，主要表现为排便次数减少，粪便干硬和(或)排便困难。随着生活节奏的加快，越来越多的人受到便秘的困扰，随着年龄的增加，越来越容易发生便秘，女性发病率高于男性。临床上通常采用泻剂来实现通便，但是一种治标不治本的方法，并且长期使用还会出现腹痛、电解质紊乱等副作用，并非十分安全。不论是功能性便秘还是肠易激综合征便秘都会出现患者肠道微生物群的中乳酸杆菌和双歧杆菌等有益细菌的相对减少，潜在病原体的相对增加，以及物种丰富程度的降低。肠道微生物群可以通过有益细菌发酵的代谢物调节肠道功能，其中短链脂肪酸(SCFA)、二级胆汁盐(BAs)和甲烷占据更重要的位置，并可能触发肠内分泌细胞(EECs)释放肠道激素，如5-羟基三聚氰胺(5-HT)、肽YY(PYY)和葡萄糖素样肽-1(GLP-1)。随后，这些肠道激素可以影响肠道感觉功能、分泌和活动，主要是通过激活分布在平滑肌肉细胞、肠道神经元和上皮细胞的特定受体。
鼠李糖乳杆菌已被报道具有缓解便秘、调节肠道菌群、提升机体免疫力、防治腹泻等功效。例如，发明专利申请202110795438.3披露了一种鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)菌株LR3001及其应用，保藏编号为：CCTCC NO：M 2020705，所述鼠李糖乳杆菌LR3001可应用于制备降血糖产品和减肥减脂产品中。
然而，本领域亟需开发更多鼠李糖乳杆菌新菌株用于缓解便秘、调节肠道菌群。
发明内容
基于本领域的上述需求，本发明提供另一株全新的鼠李糖乳杆菌LRa05菌株及其在缓解便秘、调节肠道菌群方面的应用。
本发明的技术方案如下：
保藏号为CGMCC No.24377的鼠李糖乳杆菌LRa05在非治疗目的地抑制病原菌和/或制备缓解便秘制品或调解肠道菌群制品方面的用途。
所述病原菌选自：大肠杆菌、沙门氏菌或金黄色葡萄球菌；
所述肠道菌群选自：肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌、乳杆菌或产气荚膜梭菌；
优选地，所述制品选自：药物或食品；
优选地，所述制品的剂型选自：粉剂或片剂。
一种抑菌剂，其特征在于，所述抑菌的活性成分包括：保藏号为CGMCC No.24377的鼠李糖乳杆菌LRa05。
所述抑菌指抑制病原菌；所述病原菌优选：大肠杆菌、沙门氏菌或金黄色葡萄球菌；
优选地，所述抑菌剂的剂型选自粉剂或片剂。
一种缓解便秘制品，其特征在于，其缓解便秘的活性成分包括：包括保藏号为CGMCC No.24377的鼠李糖乳杆菌LRa05。
所述缓解便秘制品选自药物或食品；所述食品优选保健食品；
优选地，所述保健食品包括：压片糖果、发酵饮料、软糖、调制乳粉、发酵乳、固体饮料；
优选地，所述缓解便秘制品的剂型选自粉剂或片剂。
一种调节肠道菌群制品，其特征在于，其调节肠道菌群的活性成分包括：包括保藏号为CGMCC No.24377的鼠李糖乳杆菌LRa05。
所述肠道菌群包括：肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌、乳杆菌和/或产气荚膜梭菌；
所述调节肠道菌群制品选自药物或食品；所述食品优选保健食品；
优选地，所述保健食品包括：压片糖果、发酵饮料、软糖、调制乳粉、发酵乳、固体饮料；
优选地，所述调节肠道菌群制品的剂型选自粉剂或片剂。
在一些国家或地区专利法允许的前提下，本发明还请求保护保藏号为CGMCCNo.24377的鼠李糖乳杆菌LRa05在非治疗目的地抑制病原菌和/或缓解便秘和/或调解肠道菌群方面的用途。
本发明提供鼠李糖乳杆菌LRa05在缓解便秘和调节肠道菌群的药物或食品中的应用。
本发明涉及的鼠李糖乳杆菌，其分类命名为鼠李糖乳杆菌Lactobacillusrhamnosus，该菌株于2022年1月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，CGMCC No.24377，菌株编号为LRa05。
本发明的体外实验证明，本发明所述的鼠李糖乳杆菌，具有较好的耐受性、自聚集能力、共聚集能力和黏附能力。
所述的鼠李糖乳杆菌LRa05显著提高小鼠小肠墨汁推进率，缩短排首粒黑便时间，显著提高便秘小鼠粪便含水量、排便粒数、排便量，鼠李糖乳杆菌LRa05可有效改善便秘小鼠排便状况。
所述的鼠李糖乳杆菌LRa05显著提高便秘小鼠肠道中双歧杆菌、乳杆菌数量，鼠李糖乳杆菌LRa05能够有效调节便秘小鼠肠道菌群。
所述的鼠李糖乳杆菌LRa05菌剂，人体试食15天后，试食组排便次数显著性增加、排便状况评分和粪便形状评分均显著性降低，鼠李糖乳杆菌能够显著改善人体便秘情况。
所述的鼠李糖乳杆菌LRa05菌剂，人体试食15天后，试食后试食组与对照组相比，双歧杆菌和乳杆菌显著增加，产气荚膜梭菌减少，拟杆菌、肠杆菌、肠球菌无明显变化；试食鼠李糖乳杆菌后比试食前双歧杆菌和乳杆菌显著增加，产气荚膜梭菌减少，拟杆菌、肠杆菌、肠球菌无明显变化。可见，鼠李糖乳杆菌具有调剂肠道菌群的功能。
所述的鼠李糖乳杆菌LRa05菌粉发酵工艺：将保存于甘油管中的鼠李糖乳杆菌菌株经过两级活化，接种到发酵罐中发酵。在发酵温度为35℃、搅拌转速100rpm、初始pH调节为6.5的条件下开始发酵，发酵过程中用23％(m/v)碳酸钠维持pH为5.8，维持罐压为0.03MPa，培养10h。
所述的鼠李糖乳杆菌LRa05菌粉制备工艺：
(1)将通过上述鼠李糖乳杆菌发酵液4℃、8000rpm离心10min，去上清，收集菌泥。
(2)按照菌泥与冻干保护剂质量比1:1-1.2将两者混合均匀，进行真空冷冻干燥得到鼠李糖乳杆菌冻干菌粉。所述的真空冷冻干燥的条件为：预冻温度为-42～-45℃，真空度10-20pa，时间24-28h。
所述的冻干保护剂包含如下按质量百分比计的组分：15％海藻糖，5％脱脂奶粉，2％蔗糖，2％甘油，0.5％山梨醇。
本发明提供了鼠李糖乳杆菌LRa05在缓解便秘、调节肠道菌群保健食品中的应用。
所述保健食品，包括压片糖果、发酵饮料、软糖、调制乳粉、发酵乳、固体饮料。
本发明还提供了鼠李糖乳杆菌LRa05在制备缓解便秘、调节肠道菌群药物上的应用，所述药物包括但不限于微生态制剂。
本发明所采用的鼠李糖乳杆菌LRa05来自健康婴儿肠道，安全无致病性，通过体外试验、人体试食试验证明其具有调节肠道菌群、缓解便秘功效。将其广泛应用到食品领域，增大消费者摄入的可能性，通过日常摄入就可以达到调节肠道菌群、缓解便秘的目的。当然，所采用的鼠李糖乳杆菌LRa05也可以用于制备调节肠道菌群、缓解便秘的药物中。
本发明鼠李糖乳杆菌LRa05的保藏信息如下：
菌种保藏名称：LRa05
保藏号：CGMCC No.24377
分类命名：鼠李糖乳杆菌
拉丁名：Lactobacillus rhamnosus
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2022年1月24日
附图说明
图1为实验例7中各组小鼠排首粒黑便时间对比图。
具体实施方式
以下由特定的具体实验例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。以下实验例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
生物材料的来源
实验例2和5使用的大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌购自广东微生物菌种保藏中心。实验例6使用的HT-29细胞购自中国典型微生物培养中心。实验例7使用的小鼠购自华中农业大学动物中心。实验例8的受试者来自社会招募的志愿者，男女比例1∶1，且均签署有关试验的知情同意书。
第1组实施例、本发明鼠李糖乳杆菌LRa05的抑菌或生产用途
本组实施例提供保藏号为CGMCC No.24377的鼠李糖乳杆菌LRa05在非治疗目的地抑制病原菌和/或制备缓解便秘制品或调解肠道菌群制品方面的用途。
在具体的实施例中，所述病原菌选自：大肠杆菌、沙门氏菌或金黄色葡萄球菌。
在更具体的实施例中，所述肠道菌群选自：肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌、乳杆菌或产气荚膜梭菌；
优选地，所述制品选自：药物或食品；
优选地，所述制品的剂型选自：粉剂或片剂。
任何使用、生产、制备、销售、许诺销售、扩繁、培养、发酵保藏号为CGMCC No.24377的鼠李糖乳杆菌LRa05并将其用于抑制病原菌和/或制备缓解便秘制品或调解肠道菌群制品的行为均落入本发明的保护范围。
第2组实施例、本发明鼠李糖乳杆菌LRa05的适应症用途
本组实施例提供保藏号为CGMCC No.24377的鼠李糖乳杆菌LRa05在缓解便秘和/或调解肠道菌群方面的用途。
在一些实施例中，所述肠道菌群选自：肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌、乳杆菌或产气荚膜梭菌。
任何使用、生产、制备、销售、许诺销售、扩繁、培养、发酵保藏号为CGMCC No.24377的鼠李糖乳杆菌LRa05并将其用于缓解便秘或调解肠道菌群的行为均落入本发明的保护范围。
第2组实施例、本发明的抑菌剂
本组实施例提供一种抑菌剂。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述抑菌的活性成分包括：保藏号为CGMCC No.24377的鼠李糖乳杆菌LRa05。
在一些实施例中，所述抑菌指抑制病原菌；所述病原菌优选：大肠杆菌、沙门氏菌或金黄色葡萄球菌；
优选地，所述抑菌剂的剂型选自粉剂或片剂。
第3组实施例、本发明的缓解便秘制品
本组实施例提供一种缓解便秘制品。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述一种缓解便秘制品的缓解便秘的活性成分包括：包括保藏号为CGMCC No.24377的鼠李糖乳杆菌LRa05。
在一些实施例中，所述缓解便秘制品选自药物或食品；所述食品优选保健食品；
优选地，所述保健食品包括：压片糖果、发酵饮料、软糖、调制乳粉、发酵乳、固体饮料；
优选地，所述缓解便秘制品的剂型选自粉剂或片剂。
在一些具体的实施例中，所述制品除了保藏号为CGMCC No.24377的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株LRa05这一缓解便秘的活性成分以外，还包括药用辅料或食用辅料。
在更具体的实施例中，所述药用辅料选自：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。
在另一些实施例中，所述食用辅料选自：漂白剂、防腐剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂、酸味剂、增味剂、护色剂等。
根据本发明的内容，出于实际生产应用中的不同需求，再结合药物制备或食品生产加工工艺领域的常规技术手段(例如，《食品生产概论》、《食品与食品生产百科全书》、《食品加工技术》、《制剂技术百科全书》、《药物制剂技术》等)，本领域技术人员可对上述药用辅料或食用辅料进行选择和调配，并将CGMCC No.24377的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)菌株LRa05制成不同的剂型，例如粉剂、片剂、注射剂、口服液等。
第4组实施例、本发明的调节肠道菌群制品
本组实施例提供一种调节肠道菌群制品。本组所有的实施例都具备如下共同特征：其调节肠道菌群的活性成分包括：包括保藏号为CGMCC No.24377的鼠李糖乳杆菌LRa05。
在一些实施例中，所述肠道菌群包括：肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌、乳杆菌和/或产气荚膜梭菌。
在另一些实施例中，所述调节肠道菌群制品选自药物或食品；所述食品优选保健食品；
优选地，所述保健食品包括：压片糖果、发酵饮料、软糖、调制乳粉、发酵乳、固体饮料；
优选地，所述调节肠道菌群制品的剂型选自粉剂或片剂。
在一些具体的实施例中，所述制品除了保藏号为CGMCC No.24377的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株LRa05这一调节肠道菌群的活性成分以外，还包括药用辅料或食用辅料。
在更具体的实施例中，所述药用辅料选自：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。
在另一些实施例中，所述食用辅料选自：漂白剂、防腐剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂、酸味剂、增味剂、护色剂等。
根据本发明的内容，出于实际生产应用中的不同需求，再结合药物制备或食品生产加工工艺领域的常规技术手段(例如，《食品生产概论》、《食品与食品生产百科全书》、《食品加工技术》、《制剂技术百科全书》、《药物制剂技术》等)，本领域技术人员可对上述药用辅料或食用辅料进行选择和调配，并将CGMCC No.24377的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)菌株LRa05制成不同的剂型，例如粉剂、片剂、注射剂、口服液等。
实验例1、鼠李糖乳杆菌LRa05的耐受性试验
菌株活化：从-80℃冰箱取出甘油管，解冻后，以2％接种量接种于MRS培养基置于37℃培养12h-24h，生长至菌液浑浊为活化一代。
MRS培养基成分：蛋白胨10g、牛肉浸粉5g、酵母浸粉4g、K2HPO4 2g、柠檬酸三铵2g、乙酸钠5g、葡萄糖20g、吐温80 1mL、MgSO4·7H2O 0.58g、MnSO4·4H2O 0.25g、蒸馏水1000mL；pH值6.2±0.2
模拟人工胃液：配制PBS溶液，加入0.3％胃蛋白酶，用1mol/L HCL调节pH值至2.5，然后充分溶解后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌备用。
模拟人工肠液：配制PBS溶液，加入0.1％胰蛋白酶和0.3％的牛胆粉，用0.1mol/LNaOH调节pH值至8.0，然后充分溶解后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌备用。
鼠李糖乳杆菌LRa05在MRS液体培养基中37℃过夜培养，活化培养2代。将活化后的鼠李糖乳杆菌菌液离心，弃上清，收集菌体，调整菌液浓度是108CFU/mL。取1mL菌体悬液离心，收集菌体后，分别接入1mL配制好的pH2.5的模拟人工胃液和pH8.0的模拟人工肠液中混匀，37℃条件下消化，同时分别取0h和3h的消化液检测活菌数，计算存活率，结果见表1。其中，菌株存活率(％)＝Nt/N0×100％，式中N0表示菌株0h的活菌数(CFU/mL)，Nt表示菌株3h的活菌数(CFU/mL)。
表1.模拟人工胃液和人工肠液试验数据表
Figure BDA0003593477860000071
实验例2、鼠李糖乳杆菌LRa05抑制病原菌试验
取拮抗菌株按2％(V/V)接种至MRS液体培养基中，37℃恒温静置培养16-24h。将致病菌株大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌分别接种于液体牛肉膏蛋白胨培养基中，37℃、转数250rpm、恒温摇床过夜培养，然后制备病原菌悬液。将MRS固体培养基冷却至55℃左右，与病原菌悬液按一定比例混匀，使体系病原菌活菌数在106CFU/mL数量级，取上清液然后迅速倾注于预先放置牛津杯的平板中，待培养基冷却凝固后，取出牛津杯，于每孔注入200μL拮抗菌株发酵上清液，将平皿轻盖后正置于37℃恒温培养箱，培养适宜时间后观察，并用游标卡尺测量抑菌圈直径。
表2.鼠李糖乳杆菌LRa05发酵液对病原菌的抑制作用
指示菌株 抑菌圈直径(mm)
大肠杆菌 35±1.5
沙门氏菌 23±1.0
金黄色葡萄球菌 33±1.5
结果如表2所示，鼠李糖乳杆菌LRa05对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌拮抗直径分别是35mm、23mm、33mm。表现出对肠道致病菌极强的抑制作用，尤其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制能力。
实验例3、抗生素敏感性实验
将待测菌在MRS固体平板上划线活化后，制备菌悬液并调整菌悬液浓度为108CFU/mL，取100μL菌悬液加入MRS固体平板上，用无菌棉签将菌液均匀涂布在平板上，贴上抗生素药敏片，以无抗生素的纸片为空白对照。置于厌氧条件下，37℃正置培养，24h后用直尺测量菌株对抗生素敏感性直径，结果见表3。
表3.鼠李糖糖乳杆菌LRa05对抗生素敏感性数据(mm)
Figure BDA0003593477860000081
Figure BDA0003593477860000091
实验例4、鼠李糖乳杆菌LRa05的自聚集能力
(1)菌悬液制备：将活化的鼠李糖乳杆菌LRa05以5000×g，离心5min收集菌体，用PBS缓冲液冲洗2次后，再用PBS重悬，调至活菌数的数量标准大约为108CFU/mL。测定此时在波长600nm处的OD值OD初始；
(2)取40mL细胞悬浊液于50mL离心管中，涡旋充分混合后置于37℃条件下孵育，菌悬液孵育2h、5h、21h、24h时后，分别小心吸取上层菌液2.5mL，测定菌悬液在600nm处的吸光值ODt，计算菌株自聚集能力，以LGG为对照。
依据下列公式，计算不同时间菌株的自聚集能力
自聚集能力(％)＝[1-(At/A初始)]×100％(3)鼠李糖乳杆菌LRa05的自聚集能力
表4.鼠李糖乳杆菌LRa05的自聚集能力结果
Figure BDA0003593477860000092
从表4中可以看出鼠李糖乳杆菌LRa05与对照菌株LGG的自聚集能力无差异性显著，说明鼠李糖乳杆菌LRa05具有与对照菌株LGG相当水平的自聚集能力。益生菌的自聚集在生物膜的形成中起着重要作用，有助于益生菌在肠道的定植和防止致病菌的黏附，有研究表明自聚集与益生菌的黏附能力呈正相关性。
菌株的自聚集能力(自聚集率)是评价菌株黏附能力的一项指标，是微生物领域的常用术语，本文中的“自聚集”一词具有与《肠炎沙门氏菌耐药性分析及环丙沙星诱导耐药对其毒力的影响》一文中记载的“自聚集”一词相同的含义。
实验例5、鼠李糖乳杆菌LRa05的共聚集能力测定
(1)病原菌活化：按1％接种量接种至LB液体培养基，37℃摇床180rmp过夜培养14h左右进行活化。
(2)菌悬液制备：将活化的病原菌及鼠李糖乳杆菌LRa05以5000rmp离心5min，收集菌体，用PBS缓冲液冲洗2次后，再用PBS重悬，调整病活菌数约108CFU/mL，即病原菌的OD600值为0.4左右，鼠李糖乳杆菌LRa05的OD600值为0.6左右。充分震荡混匀，分别测定初始OD600nm处的值Ax、Ay。
(3)共聚集能力测定：鼠李糖乳杆菌LRa05与病原菌各取20mL等体积至50mL离心管中混，涡旋震荡10s后37℃静置孵育，菌悬液孵育2h、5h、21h、24h时，分别小心吸取上层液体2.5mL，测定菌悬液在600nm处的吸光值(A)，计算菌株与病原菌的共聚力。
共聚力％＝[(Ax+Ay)/2-A(x+y)]/[Ax+Ay/2]×100
其中x和y分别代表两种菌株，(x+y)代表混合物。
(4)共聚集能力测定的结果
表5.鼠李糖乳杆菌LRa05与沙门氏菌的共聚能力
Figure BDA0003593477860000101
表6.鼠李糖乳杆菌LRa05与大肠杆菌的共聚能力
Figure BDA0003593477860000102
表7.鼠李糖乳杆菌LRa05与金葡萄球菌的共聚能力
Figure BDA0003593477860000103
Figure BDA0003593477860000111
从上表可看出鼠李糖乳杆菌LRa05与三种病原菌(沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌)的共聚能力与对照菌株LGG无显著性差异。益生菌与病原菌的共聚能力有助于其在肠道定植，进而发挥功效。有研究表明共聚集能力与益生菌的黏附能力呈正相关性。
菌株的共聚集能力(共聚集率)是评价菌株黏附能力的一项指标，是微生物领域的常用术语，本文中的“共聚集”一词具有与《羊奶源产细菌素乳酸菌筛选、鉴定及益生特性研究》一文中记载的“共聚集”一词相同的含义。
实验例6、鼠李糖乳杆菌LRa05的细胞粘附性
1)HT-29细胞复苏与活化：
(1)从液氮罐中取出保存的细胞冻存管，迅速置于37℃水浴锅中，摇动直至管中液体全部解冻，放入超净台中；
(2)将冻存液转至离心管中，加入2-3mL有三抗培养基，1000×g离心4min，弃上清；
(3)向离心管中加入3mL有三抗培养基，轻轻吹打均匀，使细胞分散均一，然后转至T25细胞培养瓶中，置37℃，5％CO2-95％空气的细胞培养箱中培养；
(4)次日换液继续培养；
(5)每日用倒置显微镜观察细胞，当细胞在细胞培养瓶底长满80％时，进行传代。
2)细胞传代与培养：
(1)待细胞长满培养瓶底80％左右，移弃培养基，用PBS漂洗细胞层2遍；
(2)加入0.5mL胰蛋白酶消化液，盖好盖子，放进细胞培养箱中孵育5min左右，取出细胞培养瓶，用倒置显微镜观察细胞形态，待大部分细胞变圆，细胞边缘略脱离细胞壁；
(3)向培养瓶中加入1mL有三抗培养基终止消化，轻轻吹打细胞培养瓶中的细胞，直至细胞分散均一，将消化下来的细胞转入离心管中，在1000×g离心4min；
(5)取出离心管，弃上清，向离心管中加入适量培养基，充分混匀后，转至多个细胞培养瓶中，37℃，5％CO2-95％空气培养箱中培养。
(6)根据实验需要，细胞需要在12孔板中进行培养时，操作如下：取出离心管，弃上清，向离心管中加入1mL含三抗培养基，充分混匀后，采用血球板计数，以接种量为2×105cells/well进行铺板，在每孔中补充含三抗培养基至1mL，混合均匀，置于37℃，5％CO2-95％空气培养箱中培养。每天换液至细胞长满底部面积的80％，获得单层细胞。
3)鼠李糖乳杆菌LRa05对细胞的黏附试验
(1)菌悬液制备：活化的鼠李糖乳杆菌LRa05以2％接种量接种于MRS培养基中，培养12h，6000r/min室温离心5min收集菌体，并用无菌PBS洗涤两次，最后重悬于DMEM培养基，并调节菌体浓度至108cfu/mL，采用MRS固体培养基对初始菌悬液进行平板菌落计数。
(2)移除12孔细胞培养板中的培养基，PBS漂洗2次，消化一个孔的细胞进行计数。
(3)向单细胞层的细胞培养板中加入制备好的菌悬液1mL/孔，置于37℃，5％CO2-95％空气培养箱中共孵育2h；
(4)小心移去培养上清，加入无菌PBS漂洗5次；
(5)加入胰蛋白酶细胞消化液0.2mL/孔，消化10min以使细胞从细胞培养板孔壁上脱离下来，加0.8mL PBS终止消化，收集溶液即为样品；
(6)将收集的样品进行梯度稀释，采用MRS固体培养基进行平板菌落计数。
黏附能力(CFU/cells)＝黏附在细胞上的的菌数(CFU)/加入孔中的细胞数
表8.鼠李糖乳杆菌LRa05对HT-29细胞的黏附能力结果
菌株 黏附能力(CFU/cell)
鼠李糖乳杆菌LRa05 9.27
嗜酸乳杆菌NCFM 2.85
菌株的黏附能力有助于其在肠道定植，通常认为黏附是定植的关键步骤，益生菌在肠道定植后，能够增强与肠道细胞之间的信号交流、抑制病原菌在肠道的定植，调节肠道菌群。益生菌在肠道定植是发挥功效的前提和基础。
实验例7、鼠李糖乳杆菌LRa05缓解小鼠便秘
1)实验分组及喂养方式
昆明(KM)小鼠(雄性，18-22g)，饲养条件：动物房温度为(22±2)℃，相对湿度为40％～70％，严格按照12h光照/黑暗循环，保证动物自由饮水和充分进食。适应性喂养一周后，将KM小鼠按体质量(bw)随机分为3组，每组15只，分别为对照组(ND)、便秘模型组(复方地芬诺酯组)、鼠李糖乳杆菌LRa05组(1×109CFU/kg bw d))。采用等体积(20mL/(kg bwd))灌胃法，对照组和便秘模型组溶剂用蒸馏水代替。各实验组连续灌胃14d，期间自由饮水、自由进食标准饲料。
标准饲料：购自万千佳兴生物科技有限公司。
2)小肠推进实验
墨汁配制方法：准确称取阿拉伯树胶100g，加水800mL，煮沸至溶液透明，称取活性炭粉末50g加至上述溶液中煮沸三次，待溶液凉后加水定容至1000mL，置于冰箱中4℃保存，用前摇匀。
复方地芬诺酯溶液：复方地芬诺酯片每片含复方地芬诺酯2.5mg，小鼠便秘模型灌胃复方地芬诺酯溶液的质量分数为5mg/kg·d·bw。
给受试样品第7天和14天后，各组小鼠禁食不禁水16小时。便秘模型组和鼠李糖乳杆菌LRa05组灌胃给予复方地芬诺酯(5mg/kg·d·BW)，对照组给予蒸馏水。第14天，给复方地芬诺酯后0.5h后，鼠李糖乳杆菌LRa05组给予含相应受试样品的墨汁，对照组和便秘模型组给墨汁灌胃。小鼠均单笼饲养，正常饮水进食。计时25min后，处死小鼠，解剖，测量小肠全长及自胃部下端幽门处到墨水运动前沿的距离，并计算墨汁推进率，其计算公式如下：
墨汁推进率＝墨汁推进长度(cm)/小肠总长度(cm)×100％
3)指标测定
(1)小鼠粪便粒数、重量、含水量测定
实验期间，在灌胃6h后收集各组小鼠粪便，称量粪便体重、计数粪便粒数，新鲜粪便于60℃烘箱中烘干后计算粪便含水率。
(2)肠道菌群的检测
灌胃第0天及第14天，无菌收集各组小鼠新鲜粪便。分别称取小鼠粪便0.1g混匀于10mL无菌生理盐水中，制成粪便混悬液。10倍系列稀释，选择合适的稀释度分别接种在各培养基上，计数菌落，计算出每克湿便中的菌数。各种肠道菌群的培养基及培养条件见表9。
表9.肠道菌群培养条件及培养基
肠道菌群 培养条件 培养基
拟杆菌 37℃、48h厌氧培养 改良GAM琼脂
肠杆菌 37℃、24h厌氧培养 EMB培养基
肠球菌 37℃、48h厌氧培养 叠氮钠－结晶紫－七叶苷培养基
双歧杆菌 37℃、72h厌氧培养 BBL培养基
乳杆菌 37℃、48h厌氧培养 LBS培养基
产气荚膜梭菌 37℃、24h厌氧培养 TSC培养基
4)数据处理
每组实验数据以平均数±标准差(x±δ)表示，多组间比较采用单因素方差分析最小显著差别(least significant difference，LSD)法，P<0.05为差异有统计学意义。
5)结果分析
(1)鼠李糖乳杆菌LRa05对小鼠小肠墨汁推进率的影响
表10.鼠李糖乳杆菌LRa05对小鼠小肠墨汁推进率的影响
组别 墨汁推进率/％
对照组 62±2.5<sup>c</sup>
便秘模型组 24±1.8<sup>a</sup>
鼠李糖乳杆菌LRa05组 50±2.7<sup>b</sup>
由表10可知，与对照组相比，便秘模型组小肠墨汁推进率显著降低，说明小鼠便秘模型构建成功。与模型组相比，鼠李糖乳杆菌LRa05组小肠推进率显著提高，说明鼠李糖乳杆菌LRa05对便秘小鼠有明显的促进肠蠕动作用。
(2)鼠李糖乳杆菌LRa05对便秘小鼠排便的影响
鼠李糖乳杆菌LRa05显著缩短了便秘小鼠排首粒黑便的时间。
表11.鼠李糖乳杆菌LRa05对便秘小鼠排便的影响
组别 粪便含水量/％ 6h排便粒数 6h排便量/mg
对照组 65±2<sup>c</sup> 52±7<sup>c</sup> 1258±21<sup>c</sup>
便秘模型组 38±1<sup>a</sup> 15±5<sup>a</sup> 435±17<sup>a</sup>
鼠李糖乳杆菌LRa05组 53±2<sup>b</sup> 29±5<sup>b</sup> 776±15<sup>b</sup>
注：不同字母表示差异性显著，P＜0.05。
由表11可知，鼠李糖乳杆菌LRa05组小鼠粪便含水量、排便粒数、排便量均显著高于便秘模型组，说明鼠李糖乳杆菌LRa05可有效改善便秘小鼠排便状况。
(3)鼠李糖乳杆菌LRa05对便秘小鼠肠道菌群的影响
表12.鼠李糖乳杆菌LRa05对便秘小鼠肠道菌群的影响(Lg CFU/g)
Figure BDA0003593477860000141
注：不同字母为14d后各组相比，P＜0.05；#为同一分组0d和14d相比，P＜0.05
从表12中可以看出0d时三组之间肠道菌群没有显著差异，便秘模型造模成功后，肠道菌群均显著降低。14d时鼠李糖乳杆菌LRa05组双歧杆菌、乳杆菌显著高于便秘模型组，产气荚膜梭菌、肠球菌、肠杆菌变化不显著，可见鼠李糖乳杆菌LRa05能够有效调节便秘小鼠肠道菌群。
同时各组小鼠的首粒黑便排便时间对比情况如图1所示。
实验例8、鼠李糖乳杆菌LRa05缓解便秘，调节肠道人体试食试验
本实验例参照《保健食品检验与评价技术规范》进行下述实验操作：
1)受试者招募标准：
(1)排便次数减少和粪便硬度增加者；(2)大便一周少于3次者；(3)无器质性便秘者；(4)习惯性便秘者。
2)排除标准：
(1)患有严重肝功能不全，肾功能不全，心血管疾病，呼吸功能障碍，内分泌失调，或代谢功能障碍；
(2)存在可能导致其排便改变及腹痛的疾病，如胃肠道手术史、急慢性胃肠炎、急慢性胰腺炎等；
(3)精神不正常、痴呆、话语不清楚者；
(4)1月内有抗生素使用史；
(5)习惯性摄入益生菌补充剂或计划给服用其他益生菌、益生元补充剂者；
(6)8周内参加过其他临床试验的或正在参加其他药物临床试验。
3)试验设计与分组要求：
将符合标准的受试者随机分为对照组和试食组。每组60人，试食组每日服用2次鼠李糖乳杆菌LRa05菌剂，每次1克(含100亿CUF)；对照组每日服用等量的淀粉，连续服用15天，试验期间不改变原来的饮食习惯。
4)功效性指标：
每日对受试者进行询问并记录，同时记录受试者服用受试样品前6天及试验时的情况。记录有无不良反应(恶心、血压升高、胀气、腹泻、腹痛及粪便异常等)。
(1)每日排便次数
记录受试者试食前后排便次数的变化
(2)排便状况
据受试者的排便情况如不适感、肛门灼烧感、腹痛、下坠感、排便频率、排便量等状况，将功效性指标分为Ⅰ～Ⅳ级：
Ⅰ级(0分)：排便正常
Ⅱ级(1分)：仅有下坠感、不适感
Ⅲ级(2分)：下坠感、不适感明显、或有便频但排便困难而量少，较少出现腹痛或肛门灼烧感
Ⅳ级(3分)：经常出现腹痛或肛门灼烧感，影响排便。
(3)粪便形状
根据布里斯托(Bristol)粪便性状分类法将粪便性状分为Ⅰ～Ⅲ级：
Ⅰ级(0分)：像香肠或蛇、平滑而且软；像香肠，但它的表明有裂痕，软的团块，有明显的边缘(容易排除)
Ⅱ级(1分)：香肠形状，但有团块；松散的块状，边缘粗糙，像泥浆状的粪便
Ⅲ级(2分)：分离的硬团，像果核(不易排出)。
5)肠道菌群测定
无菌采取受试者服用前后的粪便1.0g。10倍系列稀释，选择合适的稀释度分别接种在各培养基上，计数菌落，计算出每克湿便中的菌数。各种肠道菌群的培养基及培养条件见表10。
6)数据处理：每组实验数据以平均数±标准差(x±δ)表示，多组间比较采用单因素方差分析最小显著差别(least significant difference，LSD)法，P<0.05为差异有统计学意义。
7)人体试食结果及分析
表13.试验组与对照组受试前后功效性指标比较
Figure BDA0003593477860000161
注：大写字母为试食后与对照组相比，P＜0.05；小写字母为试食组与试食前相比，P＜0.05。
如表13所示，对照组试食前后及试食前对照组与试验组的排便次数、排便状况及粪便形状均无显著性差异。试食组排便次数显著性增加、排便状况评分和粪便形状评分均显著性降低，说明鼠李糖乳杆菌LRa05能够显著改善人体便秘情况。
表14.人体试食前后肠道菌群变化(Lg cfu/g)
Figure BDA0003593477860000162
Figure BDA0003593477860000171
注：*为试食后与对照组相比，P＜0.05；#为试食组与试食前相比，P＜0.05
从表14中可以看出试食后试食组与对照组相比，双歧杆菌和乳杆菌显著增加，产气荚膜梭菌减少，拟杆菌、肠杆菌、肠球菌无明显变化；试食鼠李糖乳杆菌LRa05后比试食前双歧杆菌和乳杆菌显著增加，产气荚膜梭菌减少，拟杆菌、肠杆菌、肠球菌无明显变化。可见，鼠李糖乳杆菌LRa05具有调剂肠道菌群的功能。
实验例9、鼠李糖乳杆菌LRa05菌粉制备
1)鼠李糖乳杆菌LRa05发酵工艺：
将保存于甘油管中的鼠李糖乳杆菌LRa05菌株接入10mL种子培养基中，37℃静置培养6-8h即为一级种子；
将一级种子以5％的接种量接种于200mL种子培养基中，37℃静置培养5-6h即为二级种子；
发酵罐培养：发酵罐体积为15L，装入发酵培养基10L，灭菌温度为115℃，20min，以2％(v/v)的接种量将培养获得的二级种子全部接种到发酵罐，在发酵温度为35℃、搅拌转速100rpm、初始pH调节为6.5的条件下开始发酵，发酵过程中用23％(m/v)碳酸钠维持pH为5.8，维持罐压为0.03MPa，培养10h。
所述的种子培养基的配方为：20g/L葡萄糖，10g/L牛肉浸粉，5g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，5g/L乙酸钠，2g/L柠檬酸钠，3g/L磷酸氢二钾，0.5g/L酸镁，0.1g/L硫酸锰，1g/L吐温80，1g/L L-半光氨酸盐酸盐，115℃灭菌20min。
所述发酵培养基配方为：50g/L葡萄糖，15g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，5g/L牛肝浸粉，5g/L乙酸钠，3g/L柠檬酸钠，3g/L磷酸氢二钾，0.5g/L硫酸镁，0.1g/L硫酸锰，1g/L吐温80，1g/L L-半光氨酸盐酸盐，115℃灭菌20min。
2)所述的鼠李糖乳杆菌LRa05菌粉制备工艺：
(1)将通过上述鼠李糖乳杆菌LRa05高密度发酵的方法得到的发酵液离心，去上清，收集菌泥。所述的离心的方法优选为4℃、8000rpm离心10min。
(2)按照菌泥与冻干保护剂质量比1:1-1.2将两者混合均匀，进行真空冷冻干燥得到嗜酸乳杆菌冻干菌粉。所述的真空冷冻干燥的条件为：预冻温度为-42～-45℃，真空度10-20pa，时间24-28h。
所述的冻干保护剂包含如下按质量百分比计的组分：15％海藻糖，5％脱脂奶粉，2％蔗糖，2％甘油，0.5％山梨醇。
实验例10、鼠李糖乳杆菌LRa05在片剂食品中的应用
原料配比：以下原料按质量百分比计组分：淀粉62％、低聚木糖30％、木糖醇8％。
制粒：各原料过80目筛，按照比例混合均匀，加入6％水，制备软材，过20目筛进行制粒，制粒后60℃烘干2.5h，烘干后16目整粒，40目筛粉；
混合：按照原料配比加入4％鼠李糖乳杆菌LRa05菌粉，混合15min，再加入1％硬脂酸镁，再混合10min；
压片：混合好的颗粒进行压片，得到益生菌压片制剂。
片重0.5g/片，片重差异≤5％，益生菌数量≥1.0×1010CFU/g。硬度43N，所得压片外观完整、无碎片、掉粉现象，硬度佳，口感好。

Claims (10)

1.保藏号为CGMCC No.24377的鼠李糖乳杆菌LRa05在非治疗目的地抑制病原菌和/或制备缓解便秘制品或调解肠道菌群制品方面的用途。
2.根据权利要求1所述的保藏号为CGMCC No.24377的鼠李糖乳杆菌LRa05在非治疗目的地抑制病原菌和/或制备缓解便秘制品或调解肠道菌群制品方面的用途，其特征在于，所述病原菌选自：大肠杆菌、沙门氏菌或金黄色葡萄球菌。
3.根据权利要求1或2所述的保藏号为CGMCC No.24377的鼠李糖乳杆菌LRa05在非治疗目的地抑制病原菌和/或制备缓解便秘制品或调解肠道菌群制品方面的用途，其特征在于，所述肠道菌群选自：肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌、乳杆菌或产气荚膜梭菌；
优选地，所述制品选自：药物或食品；
优选地，所述制品的剂型选自：粉剂或片剂。
4.一种抑菌剂，其特征在于，所述抑菌的活性成分包括：保藏号为CGMCC No.24377的鼠李糖乳杆菌LRa05。
5.根据权利要求4所述的一种抑菌剂，其特征在于，所述抑菌指抑制病原菌；所述病原菌优选：大肠杆菌、沙门氏菌或金黄色葡萄球菌；
优选地，所述抑菌剂的剂型选自粉剂或片剂。
6.一种缓解便秘制品，其特征在于，其缓解便秘的活性成分包括：包括保藏号为CGMCCNo.24377的鼠李糖乳杆菌LRa05。
7.根据权利要求6所述的一种缓解便秘制品，其特征在于，所述缓解便秘制品选自药物或食品；所述食品优选保健食品；
优选地，所述保健食品包括：压片糖果、发酵饮料、软糖、调制乳粉、发酵乳、固体饮料；
优选地，所述缓解便秘制品的剂型选自粉剂或片剂。
8.一种调节肠道菌群制品，其特征在于，其调节肠道菌群的活性成分包括：包括保藏号为CGMCC No.24377的鼠李糖乳杆菌LRa05。
9.根据权利要求8所述的一种调节肠道菌群制品，其特征在于，所述肠道菌群包括：肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌、乳杆菌和/或产气荚膜梭菌。
10.根据权利要求8或9所述的一种调节肠道菌群制品，其特征在于，所述调节肠道菌群制品选自药物或食品；所述食品优选保健食品；
优选地，所述保健食品包括：压片糖果、发酵饮料、软糖、调制乳粉、发酵乳、固体饮料；
优选地，所述调节肠道菌群制品的剂型选自粉剂或片剂。
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