CN115595280A - 一种乳酸杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种乳酸杆菌及其应用，2022年6月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022918，该乳酸杆菌具有润肠通便的作用，可用于制备以润肠通便为目的的食品或药品，应用前景广阔，且安全、无毒复作用、生产成低，同时该乳酸杆菌可兼顾肠道菌群调节，预防其他因肠道菌群失调引发的疾病。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种乳酸杆菌及其应用。
背景技术
随着经济发展，人们的饮食习惯逐步发生改变，绿色、健康的生活方式越来越受到人们的追捧，但是受到生活节奏加快、精神压力增大以及不良生活习惯等因素的影响，消化道疾病的发生率也在逐年升高。作为消化系统疾病的重要组成部分，胃肠疾病已经成为影响人们生活质量的重要因素。影响慢性便秘的因素很多，如年龄、性别、饮食习惯、生活方式，其中年龄是绕不开的话题，随着年龄的增长，肠道中有益菌数量逐渐减少，加之各项功能器官退化，老年人慢性便秘患病率高达50％，在养老院中慢性便秘患病率更高，然而，目前人群对慢性便秘的重视度不高，缺乏科学认识，同时滥用泻药，致使慢性便秘病反复迁延。
现有治疗方法中，许多促排的药物在长期使用后与耐药性以及较大的副作用，严重影响肠道功能给患者带来更大的病痛。另有一些中药效果较佳且副作用较小，然其他药理作用及成分较为复杂，对于一些特殊人群（婴儿、老人、孕妇、哺乳）是慎用的。另外，现在还有以膳食纤维为主的一类功能性食品应用于便秘，但由于发展相对较晚，教育成本较高，普及率不高，而益生菌的应用（婴幼儿常用）时间长且效果较佳，故其应用范围广。
因此，寻找出润肠通便效果显著的益生菌对于改善肠道环境、促进人体健康十分重要。
发明内容
有鉴于此，本申请提供一种乳酸杆菌及其应用，具备润肠通便作用，且兼顾肠道菌群的调节。
为达到上述技术目的，本申请采用以下技术方案：
第一方面，本申请提供一种乳酸杆菌，2022年6月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022918。
第二方面，本申请提供一种包含乳酸杆菌和/或其后代的组合物。
优选的，所述组合物为食品组合物或药品组合物。
优选的，还包括乳酸杆菌和/或其后代的代谢产物。
优选的，所述代谢产物选自酶、胞外多糖、细菌素，或其任何组合。
优选的，所述乳酸杆菌包括乳酸杆菌活体菌和/或乳酸杆菌死体菌。
优选的，所述乳酸杆菌包括乳酸杆菌活体菌和乳酸杆菌死体菌的混合物，所述乳酸杆菌活体菌的数量大于所述乳酸杆菌死体菌的数量。
优选的，所述乳酸杆菌在所述组合物中的用量为106-1011CFU/g或106-1011CFU/ml。
优选的，所述乳酸杆菌在所述组合物中的用量为107-1010CFU/g或107-1010CFU/ml。
第三方面，本申请提供一种乳酸杆菌在制备用于润肠通便药物和/或食品制品中的应用。
本申请的有益效果如下：本方案中的乳酸杆菌具有润肠通便的作用，可用于制备以润肠通便为目的的食品或药品，应用前景广阔；本方案的乳酸杆菌安全、无毒复作用、生产成低；本方案的乳酸杆菌可兼顾肠道菌群调节，预防其他因肠道菌群失调引发的疾病。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本申请提供一种乳酸杆菌，2022年6月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022918，本申请的乳酸杆菌为乳杆菌 YNL0001（Lactobacillussp.YNL0001），保藏日期为2022年06月17日，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。
乳酸杆菌是存在于人体肠道中的一种重要的有益菌群，对促进人体健康、改善免疫功能等具有重要意义，乳酸杆菌在体内定殖后可产生有机酸促进肠壁蠕动，吸附更多水分，促进毒素、垃圾顺畅地排出体外；同时抑制腐败菌生长，减少体内腐败菌产生的胺酚、吲哚类代谢产物堆积和吸收，改善肠道环境。
本申请中的乳酸杆菌从肠道疾病患者的粪便中分离得到，具有较强的润肠通便能力，且安全无毒副作用。
本申请提供一种包含乳酸杆菌和/或其后代的组合物，即将保藏编号为CCTCC NO：M 2022918的乳酸杆菌经常规的活化培养或扩大发酵培养作为添加剂加入目标制品的组合物中。所述药物组合物可以根据给药途径不同而制备成不同形式，例如，可制备成散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂等形式，所述药物组合物中还可包括药学上可接受的佐剂；所述食品组合物包括任意类型的食品，例如固体饮料、豆制品、果汁、乳制品、冰淇淋、糖果、饼干等，所述食品中还可含有常规的添加剂、营养强化剂、原辅料，例如香精香料、稳定剂、增稠剂、防腐剂、矿物质、维生素、麦芽糊精等。
在一些实施例中，上述组合物中还包括乳酸杆菌和/或其后代的代谢产物，所述代谢产物选自酶、胞外多糖、细菌素，或其任何组合。
本方案中，乳酸杆菌作为活性成分添加于组合物中，活性成分可以为乳酸杆菌活菌、乳酸杆菌死菌、乳酸杆菌活菌及乳酸杆菌死菌的混合物，当所述乳酸杆菌为乳酸杆菌活体菌和乳酸杆菌死体菌的混合物时，所述乳酸杆菌活体菌的数量大于所述乳酸杆菌死体菌的数量。所述乳杆菌的死菌体制备方法业内常规，例如，将上述培养后的乳杆菌活菌体加热致死，或将其辐射致死。
为进一步加强润肠通便效果，本方案对乳酸杆菌的用量做了限定，当组合物为固体形式时，所述乳酸杆菌在所述组合物中的用量为106-1011CFU/g，优选的，所述乳酸杆菌在所述组合物中的用量为107-1010CFU/g，当组合物为液体形式时，所述乳酸杆菌在所述组合物中的用量为106-1011CFU/ml，优选的，所述乳酸杆菌在所述组合物中的用量为107-1010CFU/ml。
同时，本申请提供一种乳酸杆菌在制备用于润肠通便药物和/或食品制品中的应用。
以下通过具体实施例对本方案进行进一步说明。
实施例中所涉及到的物料如下：
乳酸细菌培养基(MRS)：蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、葡萄糖20.0g、吐温80.0mL、乙酸钠5.0g、磷酸氢二钾2 .0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、琼脂18.0g、蒸馏水1000mL、调pH至6.4，121℃灭菌15min，冷却备用；
乳果糖口服液，购于雅培；
阿拉伯树胶，购于天津科密欧；
活性碳粉，购于巩义市嵩山滤材活性碳厂；
脱脂乳，购于广东燕塘乳业股份有限公司；
无乳杆菌小鼠饲料来源于武汉轻工大学实验室饲养，饲喂前经辐射灭菌；
嗜酸乳杆菌购自汤臣倍健，作为实验的阳性对照菌株。
墨汁配制：准确称取阿拉伯树胶100g，加水800mL，煮沸至溶液透明，称取活性碳(粉状)50g加至上述溶液中煮沸3次，待溶液凉后加水定容到1000mL，于冰箱中4℃保存，用前摇匀。
乳酸杆菌活菌体菌悬液的制备：将乳酸杆菌按照106 CFU/ml的接种量分别接种于1000ml的MRS液体培养基中，37℃厌氧培养48h，5000r/min离心10min收集菌体，菌体沉淀重悬于质量分数15％的脱脂乳中，分别配制成2×105 CFU/ml的低剂量菌悬液L1、2 ×107CFU/ml的中剂量菌悬液M1、2×1010CFU/ml的高剂量菌悬液H1。
嗜酸乳杆菌活菌体菌悬液的制备：将嗜酸乳杆菌按照106CFU/ml的接种量分别接种于1000ml的MRS液体培养基中，37℃厌氧培养48h，5000r/min离心10min收集菌体，菌体沉淀重悬于质量分数15％的脱脂乳中配置成2×108 CFU/ml的对照菌悬液C1。
实施例中所涉及的有关筛选方法，缓冲液配置和常见培养基配方等可参考陈雯莉主编的《微生物学》第七版以及《分子克隆实验指南》描述的内容（参见J.萨姆布鲁克等，2002，分子克隆实验指南，第三版，金东雁等（译），科学出版社，北京）。
本发明中涉及的其他各种实验操作均为本领域的常规技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等予以实施。
实施例1
保藏编号为CCTCC NO：M 2022918乳酸杆菌的筛选与分离
将采集的粪便样品经梯度稀释后，接种于MRS固体培养基中，37℃厌氧培养48h。随机挑取符合乳酸菌菌落形态特征的菌落，划线分离得到纯菌落。挑取各平板上的纯菌落于MRS液培养基中，37℃厌氧培养48h后，4℃冰箱冷藏备用或冻干保藏。
将上述步骤得到的菌株进行耐酸耐胆盐试验以及葡萄糖发酵产酸产气试验，挑选耐酸耐胆盐能力强，同时产酸产气较多的菌株，得到最优势菌株。
将多次复筛分离的单一乳酸杆菌菌株寄送中国典型培养物保藏中心鉴定保存。
实施例2
乳酸杆菌的功效验证
将实验小鼠按照每笼10只饲养，保持饲养动物房温度25±2℃，湿度40-50％，每天12h光照交替。自由摄入饲料，自由饮水，适应性饲养1周后，按照体重随机分为6组，每组16只，每组分为两笼。
首先，取6组小鼠，第一组到第三组为实验组，第四组为对照菌组，第五组为便秘模型组，第六组为空白对照组，第一组灌服乳酸杆菌活菌体低剂量菌悬液 L1、第二组灌服乳酸杆菌活菌体中剂量菌悬液 M1、第三组灌服乳酸杆菌活菌体高剂量菌悬液H1、第四组灌服嗜酸乳杆菌菌悬液C1、第五组灌服15%脱脂乳（灌胃量为 0.1ml/kg/d）、第六组不干预，以小鼠体重计；每组中的其中一笼小鼠连续灌服7d，另一笼小鼠连续灌服14d，实验期间实验小鼠自由饮食，12小时灯照/黑暗循环。
接着取每组中（除第六组外）连续灌服菌体7d的实验动物，对其进行禁食不禁水16小时，之后分别给其灌服10mg/kg小鼠体重的乳果糖口服液，0.5小时后再分别灌服0.1ml/kg小鼠体重的墨汁，然后将每只实验动物进行单笼饲养，正常饮水进食。从灌胃墨汁开始，记录每只动物排首粒黑便的时间、5h内排黑便粒数、5h排便质量。将收集的粪便在105 ℃烘干至质量恒定，按式计算粪便的含水率，结果如表1所示。
含水率=（1-烘干后/烘干前）*100%。
再取每组中连续灌服菌体14d的实验动物，对其进行禁食不禁水16小时，然后分别给其灌服5mg/kg小鼠体重的乳果糖口服液，0.5小时后再分别给其灌服0 .1ml/kg小鼠体重的墨汁，25min后立即脱颈椎处死小鼠，打开腹腔分离肠系膜，剪取上端自幽门、下端至回盲肠部的肠管，置于托盘上，轻轻将小肠拉成直线，定义肠管长度为“小肠总长度”，定义从幽门至墨汁前沿为“墨汁推进长度”，结果如表1所示。
推进率=（墨汁长度/小肠总长度）*100%。
表1 各组小鼠通便情况测试数据
| 编号 | 首粒黑便时间（min） | 5h排便粒数 | 5h排便质量（kg） | 含水率（%） | 墨汁推进率（%） |
| 第一组 | 85.6±11.3 | 12.1±6.2 | 0.072±0.005 | 44.2±7.3 | 49.8±6.8 |
| 第二组 | 69.6±8.3 | 17.5±8.3 | 0.128±0.008 | 47.5±5.9 | 65.6±10.2 |
| 第三组 | 50.6±5.6 | 20.3±11.6 | 0.159±0.004 | 49.8±9.2 | 67.9±5.6 |
| 第四组 | 80.3±10.2 | 14.6±6.7 | 0.089±0.002 | 45.8±6.3 | 52.3±8.3 |
| 第五组 | 99.6±10.9 | 10.9±6.9 | 0.065±0.007 | 40.9±8.5 | 45.3±5.6 |
| 第六组 | 30.6±9.7 | 19.8±5.9 | 0.185±0.006 | 50.2±9.2 | 70.7±8.5 |
通过表可看出，第五组比第六组中的小鼠首次排黑便时间延长了接近3倍，5h内排黑便颗粒数大幅下降5h排便质量也大幅降低，同时粪便含水率降低约10%，说明第五组的便秘模型组中的小鼠较第六组的空白对照组中的小鼠通便能力明显下降，证明便秘小鼠造模成功。
在灌胃有本方案的乳酸杆菌的第一组到第三组中，及灌胃有嗜酸乳杆菌对照菌的第四组中，小鼠排首粒黑便时间均显著低于第五组，5h排便质量、5h排便粒数和粪便含水率均显著高于第五组，说明本发明中乳杆菌及对照菌嗜酸乳杆菌均有通肠润便的作用。
随着灌胃浓度增加，第一组、第二组、第三组中，小鼠排首粒黑便时间依次减少，5h排便质量、 5h排便粒数和粪便含水率依次增加，说明浓度越高通肠润便效果越好；且与对照菌组即第四组相比，本发明乳酸杆菌的通便效果要更好。
墨汁推进率可从侧面反映小鼠通便情况，墨汁推进率越高说明小鼠肠道通便情况越好。通过表1可看出，便秘模型组的墨汁推进率较空白对照组明显降低，即第六组中小鼠的肠道通便情况好于第五组，说明墨汁推进实验中小鼠便秘模型造模成功。
第一组到第三组中小鼠的墨汁推进率均显著高于第五组，说明本发明中灌胃乳杆菌具有一定的通便的作用；第三组与第四组相比，墨汁推进率明显提高约15.6%，说明同一浓度下的本发明菌株乳杆菌润肠通便效果远远优于嗜酸乳杆菌。
以上，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种乳酸杆菌，其特征在于，2022年6月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022918。
2.一种包含有权利要求1所述的乳酸杆菌和/或其后代的组合物。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物为食品组合物或药品组合物。
4.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，还包括权利要求1所述的乳酸杆菌和/或其后代的代谢产物。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述代谢产物选自酶、胞外多糖、细菌素，或其任何组合。
6.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述乳酸杆菌包括乳酸杆菌活体菌和/或乳酸杆菌死体菌。
7.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述乳酸杆菌包括乳酸杆菌活体菌和乳酸杆菌死体菌的混合物，所述乳酸杆菌活体菌的数量大于所述乳酸杆菌死体菌的数量。
8.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述乳酸杆菌在所述组合物中的用量为106-1011CFU/g或106-1011CFU/ml。
9.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述乳酸杆菌在所述组合物中的用量为107-1010CFU/g或107-1010CFU/ml。
10.一种如权利要求1所述的乳酸杆菌在制备用于润肠通便药物和/或食品制品中的应用。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211063542.4A CN115595280A (zh) | 2022-08-31 | 2022-08-31 | 一种乳酸杆菌及其应用 |
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2022
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