CN110835615B - 乳双歧杆菌gkk2的活性物质、含其的组合物及其促进长寿的用途 - Google Patents

乳双歧杆菌gkk2的活性物质、含其的组合物及其促进长寿的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种乳双歧杆菌GKK2的活性物质、含其的组合物及其促进长寿的用途。具体而言本发明提供一种促进长寿的组合物，其包含乳双歧杆菌，其中该乳双歧杆菌以保藏编号CGMCC No.15205保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明的组合物可特别用于增加Cisd2基因表达量、降低线粒体破损、延缓神经退化与肌肉萎缩等老化现象。

Description

乳双歧杆菌GKK2的活性物质、含其的组合物及其促进长寿的 用途
技术领域
本发明关于一种用于促进长寿的乳酸菌的活性物质、含其的组合物及其用途；更明确地说，是关于一种以乳双歧杆菌GKK2的活性物质，制造包含该活性物质的组合物，并将该组合物施予受施者，以用于增加Cisd2基因表达量、降低线粒体破损、延缓神经退化与肌肉萎缩等老化现象。
背景技术
长寿基因
科学家一直想找到长寿的秘密。科学家推测若能适应环境而生存的更久，就能更长寿。因此，着眼于环境压力(像是酷热的天气等严苛的气候条件，或是食物、饮水稀少时的饥饿状态)，发现有一群基因与其相关。这些基因不论年龄多大，都可发挥维持天然保护个体和修复活性的效果。这些基因强化着生物的生存能力，使得个体得以度过危机。这些基因被认定为长寿基因，若其能长期保持活性，就可大幅增进个体的健康并延长寿命。
另一群科学家则从人瑞着手，对人瑞进行基因检测。科学家发现相较于平均寿命者，人瑞存在一些特定基因显著高度表达，进而推测寿命长短可能与这些基因相关。
Cisd2基因
Cisd2基因是一个在演化过程中被高度留存的基因，从低等无脊椎动物、脊椎动物，到高等哺乳类等生物都拥有该基因。从这一点来看，显示Cisd2基因可能掌管着重要的生物功能。Cisd2基因所表达出来的蛋白质位于线粒体的外膜上。若缺少Cisd2基因会导致线粒体破损，而会影响其构造和功能，使得老化症状接踵而至。在关于Cisd2基因的研究论文指出，剔除Cisd2基因的老鼠的体型相较于未剔除Cisd2基因的对照组明显较为瘦小，其平均寿命也仅有对照组老鼠寿命的一半不到。在实验的观察过程中，Cisd2基因剔除鼠在3周左右(对应人类年龄约10至12岁)开始出现神经退化、肌肉萎缩等现象；在4周左右(对应人类年龄约15岁)，其体重明显下降；在8周左右(对应人类年龄约18至20岁)，眼睛凸出且呈现白浊色、并有骨质疏松；在12周至48周(对应人类年龄约30至45岁)，Cisd2基因剔除鼠先后出现驼背、眼盲、发苍、皮肤松弛等早衰现象。进一步观察正常老鼠自然衰老的过程中，Cisd2基因的表达量随着年龄增加而有下降的趋势；在14个月左右(对应人类年龄约60岁)下降至年轻时的60％，在28个月左右(对应人类年龄约90岁)下降到老鼠年轻时的30％。从以往的研究与上述列举的报告，证实Cisd2基因是维持正常寿命所必需的基因，而与老化息息相关。
乳酸杆菌属
乳酸杆菌属(Lactobacillus spp.)存在于一般环境中，其能将碳水化合物发酵成乳酸，因此多应用于发酵食品的制造。早在1900年代，就已发现此菌对于人体健康具有多重益处，具有帮助消化、改善肠道健康的功效，而被提倡多食用乳酸菌以改善消化环境、促进肠道蠕动。经研究后又发现，由于乳酸菌能分解糖类(举例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖)，因此可产生乳酸和醋酸，并藉此酸化肠道的环境，而达到抑制害菌于肠道中增殖，以及调整肠内菌丛平衡的有益效果。
纵使同为乳酸杆菌属，若为不同种、或甚至是同种但不同菌株也具有不一样的特征，对人体亦会有不同的影响。举例来说，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)已被研究出具有改善人体健康的功效，如L.plantarum PH04具降低血中胆固醇能力；L.plantarum299V可减轻IL-10缺乏型小鼠的结肠炎症状；L.plantarum 10hk2可提高前发炎介质，如IL-1β、IL-6和TNF-α，及抗发炎白介素-10(IL-10)，达到抗发炎效果；L.plantarum K21具有降低血中胆固醇、三酸甘油脂含量，以及具有抗发炎的功效。
双歧杆菌属
双歧杆菌属(Bifidobacterium)广泛存在于人和动物的消化道、阴道和口腔等环境中。其为革兰氏阳性、不运动、细胞呈杆状、一端有时呈分叉状且严格厌氧。此细菌早在1899年就从健康应而的粪便中分离出来，随后的研究发现此细菌的部分特定菌株可作为益生菌以应用于食品、医药和饲料等领域。
然而，却没有相关的研究述及乳酸菌对于寿命长短的影响，亦无实验验证乳酸菌是否会藉由对Cisd2基因的表达量，进而改变个体的生理环境，并决定了个体的寿命长短。
发明内容
本发明的目的在于提供一种促进长寿的组合物，其包含乳双歧杆菌，其中该乳双歧杆菌以保藏编号CGMCC NO.15205保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏日期：2018年01月12日，分类命名：乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)(保藏编号BCRC910826保藏于财团法人食品工业发展研究所)。
本发明的另一个目的在于提供一种促进长寿的组合物，其包含有效量的乳双歧杆菌的活性物质，其中所述乳双歧杆菌以保藏编号CGMCC NO.15205保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏编号BCRC910826保藏于财团法人食品工业发展研究所)。
较佳地，所述活性物质是以下列方法制备：
(a)取乳酸菌菌落(colony)接种于培养基以进行固态培养，形成乳酸菌菌体；及
(b)将步骤(a)培养的乳酸菌菌体接种于液体培养基以进行液态培养。
较佳地，该方法进一步包含下列步骤：
(c)将步骤(b)培养的含乳酸菌菌体的液态培养基离心以获得菌泥；及
(d)将步骤(c)所得的菌泥进行冷冻干燥。
较佳地，步骤(b)的温度为35至50℃、通气量为0至1vvm氮气或二氧化碳、转速为10至100rpm及/或培养时数16至24小时。
较佳地，步骤(d)的冷冻干燥的预冻温度为-196至-40℃。
较佳地，上述组合物包含一种选自下列群组的添加剂：赋型剂、防腐剂、稀释剂、填充剂、吸收促进剂、甜味剂或其组合。
较佳地，上述组合物为药品、饲料、饮料、营养补充品、乳制品、食品或保健食品。
较佳地，上述组合物形态为粉剂、锭剂、造粒、栓剂、微胶囊、安瓶、液剂喷剂或塞剂。
本发明的再一个目的为提供一种乳酸菌的组合物用于促进长寿的用途。
较佳地，所述促进长寿是相对于未施予活性物质的受施者，施予活性物质的受施者的Cisd2基因表达量增加。
较佳地，所述促进长寿是相对于未施予活性物质的受施者，施予活性物质的受施者的线粒体破损降低、线粒体破损延后发生。
较佳地，所述促进长寿是相对于未施予活性物质的受施者，施予活性物质的受施者的神经退化、肌肉萎缩或其组合的老化延后发生。
附图说明
图1显示耐酸试验结果的菌落数目。
图2显示耐胆盐试验的菌落数目。
图3显示耐热试验结果的菌落数目。
图4显示，以不同剂量的编号A至J的乳酸菌的活性物质，处理含有Cisd2基因的启动子所控制的荧光素酶(Luciferase)报导基因的HEK293细胞后所诱发的荧光表达量。
图5显示以不同剂量的编号A、B、C、D、H与I的乳酸菌的活性物质处理HEK293细胞，其内生性的Cisd2信息RNA(mRNA)的表达量的胶图。
图6显示图5的Cisd2信息RNA(mRNA)的表达量统计结果。
图7显示动物实验流程。
图8显示雄性小鼠的前肢抓力测试的抓力强度。
图9显示雌性小鼠的单次被动回避试验的滞留时间。
图10显示雄性小鼠的单次被动回避试验的滞留时间。
图11显示雌性小鼠的主动回避试验结果的回避反应次数。
图12显示雄性小鼠的主动回避试验的回避反应次数。
用于专利程序的微生物保存：
(1)乳双歧杆菌GKK2：
保藏日期：2018年01月12日；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；
保藏编号：CGMCC No.15205；
分类命名：乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)。
(2)植物乳杆菌GKM3：
保藏日期：2017年08月25日；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；
保藏编号：CGMCC No.14565；
分类命名：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。
(3)副干酪乳杆菌GKS6：
保藏日期：2017年08月25日；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；
保藏编号：CGMCC No.14566；
分类命名：副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)。
具体实施方式
菌种来源
本实验中所使用的乳酸菌，包含乳酸杆菌与双歧杆菌。在一较佳的实施态样中，乳酸菌的菌种是选购自财团法人食品工业发展研究所的生物资源研究中心(BCRC)。在一较佳的实施态样中，于下述实验使用的乳酸菌编号A至J，其种类与其保藏编号表列如下表1。编号A与H的乳酸菌的菌种采集与分离纯化过程以及基因分析与鉴定结果，可参考中国台湾专利申请案第106137773号申请案与第106136134号申请案。
表1、乳酸菌的编号、种类及保藏编号：
表现型分析
以耐酸、耐胆盐与耐热试验比较编号I的乳酸菌和其他菌种间表现型差异的研究。
耐酸试验
将GKK2、从食品工业发展研究所生物资源保存与研究中心购入的BCRC 17394、动物双歧杆菌乳酸亚种Bi 04(B.animalis subsp.LactisBi 04，以编号ATCC SD 5219保藏于美国典型菌种保存中心)、动物双歧杆菌乳亚种BB-12(B.animalis subsp.Lactis BB-12，以编号DSM 15954保藏于德国微生物菌种保存中心)与动物双歧杆菌乳亚种Bi07(B.animalis subsp.Lactis Bi07，以编号ATCC SD 5220保藏于美国典型菌种保存中心)共5种菌株活化。藉由添加HCl至MRS液态培养基中，将酸碱值约为pH 6.5的原始MRS液态培养基，调整该培养基的酸碱度为另3种不同酸碱度：约pH 3.2、pH 2.4与pH 2.0。将菌株接种在这些不同酸碱值的培养基，于37℃下培养3小时后，计数菌落形成数目。
结果如图1所示，于原始pH培养下(约pH 6.5)，GKK2与其他4种菌株的菌数皆可达到5x109cfu/ml。于酸碱值为pH 3.2时，全部菌株的菌数略为下降，GKK2与其他4种菌株相较未出现显著差异。当酸碱值下降至pH 2.4跟pH 2.0时，BCRC 17394、BB-12与Bi07菌数降至约6～7次方，都显著低于菌数维持于8次方以上的GKK2(P<0.05)。据此，在酸性环境下GKK2的活菌数显著多于他种菌株，此实验结果说明GKK2的耐酸能力相较于其他菌株更佳，故GKK2通过胃部时抵御胃酸的能力更佳。
耐胆盐试验
将GKK2、从食品工业发展研究所生物资源保存与研究中心购入的BCRC 17394、动物双歧杆菌乳酸亚种Bi 04(B.animalis subsp.LactisBi 04，以编号ATCC SD 5219保藏于美国典型菌种保存中心)、动物双歧杆菌乳亚种BB-12(B.animalis subsp.Lactis BB-12，以编号DSM 15954保藏于德国微生物菌种保存中心)与动物双歧杆菌乳亚种Bi07(B.animalis subsp.Lactis Bi07，以编号ATCC SD 5220保藏于美国典型菌种保存中心)共5种菌株活化。将这些菌种接种于含0.3％胆盐的MRS液态培养基中，于37℃下浸泡半小时后，观察并计数菌数。
结果如图2所示，于原始MRS液态培养基培养下，GKK2与其他4种菌株的菌数皆可达到5x109cfu/ml。在添加有0.3％胆盐的MRS中，BCRC 17394、Bi 04与Bi07的菌数都显著低于GKK2菌数(P<0.05)，BB-12的菌数则与GKK2统计上无显著差异。据此，在胆盐环境下GKK2的活菌数显著多于他种菌株，此实验结果说明GKK2的耐胆盐能力相较于其他菌株更佳，故GKK2通过体内消化道时抵御胆盐的能力更佳。
耐热试验
将GKK2、从食品工业发展研究所生物资源保存与研究中心购入的BCRC 17394、动物双歧杆菌乳酸亚种Bi 04(B.animalis subsp.LactisBi 04，以编号ATCC SD 5219保藏于美国典型菌种保存中心)、动物双歧杆菌乳亚种BB-12(B.animalis subsp.Lactis BB-12，以编号DSM 15954保藏于德国微生物菌种保存中心)与动物双歧杆菌乳亚种Bi07(B.animalis subsp.Lactis Bi07，以编号ATCC SD 5220保藏于美国典型菌种保存中心)共5种菌株活化。将这些菌种接种于MRS液态培养基中，分别于70℃下加热5、10、15分钟后，观察并计数菌数。
结果如图3所示，于未加热情况下(0分钟)，GKK2与其他4种菌株的菌数皆可达到5x109cfu/ml。在70℃下加热5分钟后，BCRC 17394、Bi 04与Bi07的菌数都显著低于GKK2菌数(P<0.05)，BB-12的菌数则与GKK2统计上无显著差异。而在70℃下加热15分钟后，其他4株菌的菌数都显著低于GKK2菌数(P<0.05)。据此，在高温环境下GKK2的活菌数显著多于他种菌株，此实验结果说明GKK2的耐热能力较好。况且，乳酸菌普遍都不耐热而须保存于低温下维持活性，此试验甚至显示GKK2具有耐高温并于常温下久放的特性，而对于将GKK2应用于工艺开发非常有帮助。
菌种培养
将上述编号A至J共10种乳酸菌，勾取其菌落(colony)接种于固态培养基上以活化菌种。在一较佳的实施态样中，固态培养基为MRS琼脂。待乳酸菌的菌体生长完成后，将新鲜的菌体连同固态培养基接入于含有液态培养基的锥形瓶中进行液态培养。在一较佳的实施态样中，于温度35至50℃下、通气量0至1vvm氮气或二氧化碳、速率10至100rpm的条件下液态培养。在一较佳的实施态样中，液态培养的时间为16至24小时，更佳为18小时。在一较佳的实施态样中，液态培养基为MRS液态培养基。在一较佳的实施态样中，液态培养基的配方如下表2所示。
表2、液态培养基的配方：
成分 比例
葡萄糖 1～10％
酵母萃出物 0.1～5％
蛋白胨 0.1～5％
微量元素 0.01～2％
半胱氨酸 0.01～0.1％
Tween-80 0.05～1％
冻干粉制备
待乳酸菌的菌种于液态培养完成生长后，收集包含有乳酸菌菌体的液态培养基进行离心以获得菌泥。在一较佳的实施态样中，包含有乳酸菌菌体的液态培养基以速率1000至15000rpm进行离心。将取得的菌泥与保护剂(保护剂为6-30％的脱脂奶粉)混合后冷冻干燥，冻干后置于低温保存。在一较佳的实施态样中，冷冻干燥的预冻温度设定于-196至-40℃。在一较佳的实施态样中，冷冻干燥时间为16至72小时。在一较佳的实施态样中，保存温度为-30℃至0℃。保存的乳酸菌冻干粉作为用于以下细胞实验的原料，意即为本案所请求保护的乳酸菌的活性物质的其中一态样。本案所请求保护的乳酸菌活性物质的态样，亦包含前述将菌体进行液态培养后所得的含菌体的培养液状态。
Cisd2荧光素酶报导基因检测
以Cisd2基因作为标靶，利用Cisd2基因的启动子来控制荧光素酶(Luciferase)报导基因的人类胚胎肾细胞HEK293细胞平台(取自阳明大学)，测试乳酸菌的活性物质是否会影响Cisd2基因的表达。将带有荧光素酶报导基因的HEK293细胞2x105cell/mL种于96孔盘中，并于培养箱以温度37℃，气体环境为5％CO2，培养一天。接着，将上述备用的编号A至J共10种的乳酸菌的冻干粉，以载体0.1％DMSO回溶，配制为如下表3的不同浓度，再将其加入于HEK293细胞的培养液中。对照组则仅于HEK293细胞的培养液中加入载体0.1％DMSO。使HEK293细胞与乳酸菌的活性物质或载体于培养箱以温度37℃，气体环境为5％CO2，共同培养24小时。最后，测量HEK293细胞的荧光素酶的活性，并进行定量分析。针对不同浓度的不同种类的乳酸菌的活性物质，重复上述实验三次。实验结果绘制如图4。
表3、编号A至J的乳酸菌的冻干粉的浓度：
编号 浓度1(μg/ml) 浓度2(μg/ml)
A 12.5 25
B 5 10
C 0.25 0.5
D 0.75 1.5
E 1.25 2.5
F 0.75 1.5
G 6.25 12.5
H 0.75 1.5
I 2.5 5
J 25 50
内生性Cisd2表达量
为进一步确认乳酸菌的活性物质对于Cisd2基因的表达的影响，侦测细胞内生性Cisd2的基因活性。首先，将一般人类胚胎肾细胞HEK2932x105cell/mL种于96孔盘中，并于培养箱以温度37℃，气体环境为5％CO2，培养一天。接着，将编号A、B、C、D、H与I共6种的乳酸菌的冻干粉，以载体0.1％DMSO回溶，配制为如下表4的不同浓度，再将其加入于HEK293细胞的培养液中。对照组则仅于HEK293细胞的培养液中加入载体0.1％DMSO。使HEK293细胞与乳酸菌的活性物质或载体于培养箱以温度37℃，气体环境为5％CO2，共同培养24小时。于冰上将细胞刮下，利用市售RNA纯化套组(GeneJET RNA Purification Kit,Thermo)抽出mRNA。将所得的mRNA配置为适当浓度后，再利用RNA反转录套组(RevertAid H Minus FirstStrand cDNA Synthesis Kit,Thermo)将mRNA反转录成cDNA。最后，以PCR分析内生性Cisd2的表达量。实验结果的胶图如图5，统计图5的数据如图6。
表4、编号A、B、C、D、H与I的乳酸菌的冻干粉的浓度：
编号 浓度1(μg/ml) 浓度2(μg/ml) 浓度3(μg/ml)
A 12.5 25 N/A
B 5 10 N/A
C 0.25 0.5 N/A
D 0.75 1.5 N/A
H 0.75 1.5 5
I 2.5 5 10
Cisd2实验的统计分析方法
所有结果数据皆为平均值±标准差(mean±SD)。倍数变化为比较控制组与实验组之间基因活性的变化。当分析实验组与控制组之间统计上的差异时，*p<0.05被定义为具显著差异，**p<0.01为极显著差异。
Cisd2实验的实验结果
针对Cisd2荧光素酶报导基因检测的实验结果如图4，编号A至J的十种乳酸菌的活性物质中，以编号A、C、H与I的乳酸菌的活性物质处理的HEK293细胞，其荧光量高于对照组。此结果说明，编号A、C、H与I的乳酸菌的活性物质对于Cisd2基因表达有促进的趋势。针对编号A的实验组的结果，不论以浓度12.5μg/ml或更高浓度的25μg/ml来刺激细胞，荧光素酶表达量皆高于对照组。该结果说明编号A的乳酸菌的活性物质对于Cisd2基因有活化作用，且可刺激Cisd2基因的表达。针对编号C的实验组的结果，以浓度0.25μg/ml或0.5μg/ml来刺激细胞，显示与编号A相类似的结果，两种浓度下的荧光素酶表达量皆高于对照组。该结果同样说明编号C的乳酸菌的活性物质对于Cisd2基因有活化作用，也可刺激Cisd2基因的表达。针对编号H的实验组的结果，当其以浓度1.5μg/ml来刺激细胞，相较于对照组产生约1.14倍的荧光素酶表达量。该结果同样证实编号H的乳酸菌的活性物质对于Cisd2基因有显著的活化作用(p<0.05)，且具有刺激Cisd2基因表达的潜力。编号I于浓度2.5μg/ml及5μg/ml的荧光素酶表达量亦高于对照组，说明编号I的乳酸菌也有活化Cisd2基因表达的潜力。
针对内生性Cisd2基因表达量的实验结果如图5与图6。编号A与C的Cisd2基因的mRNA的表达量并未明显高于对照组，其中编号C甚至低于对照组。编号H与I的Cisd2基因的mRNA的表达量则皆显著高于对照组，其中编号H于浓度1.5μg/ml与5μg/ml及编号I于浓度2.5μg/ml下的Cisd2的表达量相较于对照组有统计学上的意义，显示编号H与I的乳酸菌对于Cisd2基因的mRNA的表达量有显著促进的趋势。具体来说，编号H在浓度1.5μg/ml可以刺激约1.15倍表达(p<0.05)，在浓度5μg/ml可以刺激约1.37倍表达(p<0.01)，随着乳酸菌的活性物质的浓度升高，其表达量也随之提升，显示具有浓度-效应关系(concentration-effect relation)。编号I在浓度2.5μg/ml则可刺激约1.21倍表达(p<0.05)。
经上述实验结果，证实特定乳酸菌的活性物质(较佳为副干酪乳杆菌、植物乳杆菌或乳双歧杆菌)具有提高Cisd2基因表达量而延长寿命的功效，开发出乳酸菌于医药领域中另一新颖用途。据此，为使乳酸菌的活性物质得以具体应用，制造一种包含乳酸菌的活性物质的组合物，并以有效量施予个体所述组合物来达到所欲效果。
以下实验是以乳酸菌编号I(GKK2)为对象进行延缓老化进而促进长寿的功效评估。乳酸菌编号H(GKM3)及乳酸菌编号A(GKS6)将分别于另案申请。
实验动物的老化评估
本动物实验流程概要请参见图7。本实验的实验动物选用基因遗传型老化动物的老化促进小鼠(senescence-accelerated mouse；SAM)，其是由日本京都大学以AKR/J系小鼠进行同胞兄妹相互交配繁殖，所培育出来的加速老化动物的模型。本实验所采用的SAM-P8(SAMP8)品系的小鼠，其表征为脑部神经元细胞丧失、皮质萎缩、脂褐质、脑干网状组织海绵样变性与类淀粉蛋白沉积，且其他脏器快速老化、生命期短，故适合作为延缓衰老及生殖机能的相关研究的实验动物模型。小鼠饲养于30(W)×20(D)×10(H)cm3的透明塑胶笼中，动物房的温度维持在25±2℃、相对湿度维持在65±5％，且为无尘自动控制室中。光照周期以自动定时器来控制，07:00至19:00属于黑暗期(dark period)，19:00至07:00属于光照期(light period)。
本实验的实验设计参考「健康食品的延缓衰老保健功效评估方法」，选用3月龄的雌雄SAM-P8小鼠作为实验动物，分为对照组及乳酸菌编号I的实验组，再以雌、雄分组，共4组，每组10只，共40只；对照组管灌样品为ddH2O；实验组则是管灌以乳酸菌I(GKK2)冻干粉回溶于ddH2O且配置为所欲剂量的样品。分组及其样品剂量详如下表5：
表5
组别 样品(乳酸菌I(GKK2)) 剂量
对照组 ddH2O 10ml/天
实验组 乳酸菌编号I 5.1×109cfu/kgBW/天
实验进行时程为期13周，各组每日管灌样品一次，实验期间纪录小鼠摄食、饮水量。在第12周进行老化指数(aging score)评估，以及单次被动回避试验(single-trialpassive avoidance test)。第13周则进行前肢抓力测试与主动回避试验(active shuttleavoidance test)。小鼠于行为测试完成后，以二氧化碳昏迷，采用断头采血方式牺牲(牺牲前禁食8小时)，取血液及器官进行分析。
老化指数
老化指数是由Takeda等学者于1981年订定，用来评估SAM品系小鼠的衰老程度。从评估项目中选择以下六项以评估小鼠老化程度，包含毛发光泽度、粗造度、毛发稀疏脱落情况、皮肤溃疡情形、眼睛周围的红肿发炎、脊椎前后弯曲程度。该评估测试中，依衰老程度由低到高分为0、1、2、3、4等级。将逐项评估后所得分数累积，分数愈高者表示小鼠的老化程度越高。
前肢抓力测试
在老化的过程中生理机能逐渐退化，再加上可能患有多重慢性疾病，而导致活动量下降的不动(disuse)，进而加速肌肉量的减少。一般而言，在30岁以后每年减少1-2％的肌肉量，60岁以后减少的速度遽增，肌肉量每年减少甚至达到约15％。肌肉量的减少亦是后续不良健康事件，如失能、跌倒、功能退化、长期卧床、甚至死亡的危险因子。
伴随老化所带来的骨骼肌流失，演变为肌少症，又称「骨骼肌衰老症」或「老年性骨骼肌减少症」。肌少症的症状从三方面探讨：(1)肌肉量减少(low muscle mass)；(2)肌力减弱(lowmuscle strength)；(3)行动能力降低(low physical performance)。对此，2010欧洲老年医学联盟针对老化造成的肌少症，提出其诊断方式及定义。65岁以上老年人，若每秒钟正常行走速度小于1米或手握力差，且肌肉量小于特定临界值，即判定为肌少症。根据台大医院内科和家医科门诊中老年人的收案资料统计，随着年龄的增长男性肌少症盛行率从18％增加至64％；女性肌少症盛行率则从9％上升至41％。肌少症与身体衰弱在临床上可经由有效的介入与诊断，延缓病况恶化，以避免后续所引发的不良健康事件。
在小鼠实验中，使用抓力计(GSM Grip Strength Meter Cat.No.47200)来测试SAMP8小鼠前肢抓力，以评估肌肉强度。操作方式是以手固定小鼠尾巴末端处，使小鼠前肢握住拉环，并以水平方式将小鼠尾巴向后施力，直至小鼠前肢松开为止。由拉力机记录连续三次，并取最大值进行统计。
单次被动回避试验
藉由古典制约原理与小鼠的趋暗特性，判断乳酸菌对小鼠学习记忆能力的影响。利用一特殊盒子，其中央以一闸门分隔出明室与暗室，使两室可相通，箱底设有平行排列且接上电流器的金属杆。测试开始时，先将小鼠置于明室并打开闸门，使小鼠自由探索。若小鼠进入暗室，随即关上闸门并给予0.5微安培0.5秒的电击，以此作为小鼠的学习训练。完成训练后的24小时、48小时及72小时的记忆能力，分别采用同样的方式操作测试，但此时不再给予电击，并记录小鼠在明室所滞留的时间，测试时间最长为180秒。此测试探讨小鼠于系统下滞留明室的时间长短，来判定小鼠学习记忆的能力。若小鼠滞留于明室的时间越长，显示小鼠的记忆能力越佳。
主动回避试验
藉由古典制约原理与小鼠厌恶声光刺激的特性，判断乳酸菌对小鼠学习记忆能力的影响。利用一特殊盒子，其中央以一闸门分隔出明室与暗室，使两室可相通，箱底设有平行排列且接上电流器的金属杆。时间、声光及电击由电脑程式控制。首先给予小鼠10秒钟的光及声音刺激(conditioned stimulus；CS)，若小鼠无回避的反应，系统则给予电击(unconditioned stimulus；UCS)；若小鼠回避CS，则不给予电击。试验动物连续4天、每天4次、每次5回进行上述主动回避的CS/UCS测试。此测试探讨小鼠于系统下回避反应的次数，判定小鼠学习记忆的能力。若小鼠回避反应的次数越多，显示小鼠的记忆能力越佳。
动物实验的统计方法
本研究所得的资料以SPSS统计套装软件进行统计分析，实验结果的数值皆以平均值±平均标准误差(mean±SEM)表示。实验数据利用单因子变异数分析(one-way analysisof variance；one-way ANOVA)，检定多组间的差异，以Duncan’s Multiple Range Test多重全距检定比较各组间差异。当p<0.05表示具有显著性差异。
动物实验的实验结果
针对老化指数评估，各组的实验结果显示如表6与表7：
表6、雌性小鼠的老化指数
项目 对照组 实验组
皮肤
光泽度 1.00±0.00a 0.30±0.15d
粗糙度 0.90±0.10a 0.60±0.16c
脱毛 0.50±0.17a 0.00±0.00b
溃疡 0.00±0.00 0.00±0.00
眼睛
眼周发炎 1.50±0.22a 0.90±0.18b
脊椎
脊椎弯曲 1.00±0.00a 0.50±0.17b
总计 4.90±0.23a 2.30±0.37b
Values were expressed as mean±S.E.M.and analyzed by one-way ANOVA.(n＝10)
※相同上标字母表示组间统计无显著差异
表7、雄性小鼠的老化指数
项目 对照组 实验组
皮肤
光泽度 0.50±0.17 0.20±0.13
粗糙度 0.80±0.13 0.50±0.17
脱毛 0.20±0.13 0.00±0.00
溃疡 0.00±0.00 0.00±0.00
眼睛
眼周发炎 0.80±0.13 0.30±0.15
脊椎
脊椎弯曲 0.70±0.15 0.40±0.16
总计 3.00±0.33a 1.40±0.34b
Values were expressed as mean±S.E.M.and analyzed by one-way ANOVA.(n＝10)
※相同上标字母表示组间统计无显著差异
从上述小鼠在12周的老化指数所统计的总分来看，3月龄的雌、雄性SAMP8小鼠在喂食实验样品后，喂食乳酸菌编号I(GKK2)的实验组与对照组相比皆达到显著差异，其中雌性小鼠较为显著(p<0.05)。由于老化指数越高(参见表6及表7的总计值)显示衰老的程度越高，故老化指数的实验结果说明给予乳酸菌编号I(GKK2)的样品有助于降低SAMP8小鼠的老化程度。乳酸菌编号I(GKK2)对于防止老化有明显的功效。
针对前肢抓力测试，雄性小鼠各组的实验结果显示如表8并统计如图8：
表8、雄性小鼠的前肢抓力测试
组别 抓力强度(Grip strengh)(g)
对照组 114.4±5.43
实验组 137.04±6.26
Values were expressed as mean±S.E.M.and analyzed by one-way ANOVA.(n＝10)
*表示与对照组统计上具显著差异(p<0.05)
从上述小鼠在13周的前肢抓力测试中的抓力强度来看，3月龄雌、雄性SAMP8小鼠在喂食样品后，乳酸菌编号I(GKK2)的实验组显著高于对照组(p<0.05)。由于小鼠的抓力强度越强表示其肌肉强度越佳，故从结果可知喂食乳酸菌编号I的样品的小鼠肌肉强度较好。乳酸菌编号I(GKK2)对于减缓老化所引发的肌肉弱化的症状有明显的功效。
针对单次被动回避试验，雌性小鼠各组的实验结果显示如表9并统计如图9，雄性小鼠各组的实验结果显示如表10并统计如图10：
表9、雌性小鼠的单次被动回避试验
Values were expressed as mean±S.E.M.and analyzed by one-way ANOVA.(n＝10)
*表示与对照组统计上具显著差异(p<0.05)
表10、雄性小鼠的单次被动回避试验
/>
Values were expressed as mean±S.E.M.and analyzed by one-way ANOVA.(n＝10)
*表示与对照组统计上具显著差异(p<0.05)
从上述小鼠在13周的单次被动回避试验中的滞留时间来看，3月龄雌、雄性SAMP8小鼠在喂食样品后，喂食乳酸菌编号I(GKK2)的实验组与对照组相比皆有差异，其中小鼠在第24小时的滞留时间的差异较为明显。由于小鼠的滞留时间越长表示其学习记忆力越佳，故从结果可知，喂食乳酸菌编号I(GKK2)的样品的小鼠学习记忆力越好。乳酸菌编号I(GKK2)对于防止老化有明显的功效。
针对主动回避试验，雌性小鼠各组的实验结果显示如表11并统计如图11，雄性小鼠各组的实验结果显示如表12并统计如图12：
表11、雌性小鼠的主动回避试验
Values were expressed as mean±S.E.M.and analyzed by one-way ANOVA.(n＝10)
*表示与对照组统计上具显著差异(p<0.05)
表12、雄性小鼠的主动回避试验
Values were expressed as mean±S.E.M.and analyzed by one-way ANOVA.(n＝10)
*表示与对照组统计上具显著差异(p<0.05)
从上述小鼠在14周的主动回避试验中的成功回避反应(avoidance respons)次数来看，3月龄雌、雄性SAMP8小鼠在喂食样品后，小鼠在实验第一天，由于仍处于学习阶段，因此各组间的结果没有明显的差异。但雌、雄性小鼠在试验第二至四天实验组相对于对照组皆明显增加回避次数，其中尤其是雌性小鼠第三天实验组的回避次数甚至为对照组的约两倍之多(p<0.05)。由于小鼠的成功回避反应(avoidance respons)次数越多表示其学习记忆力越佳，故从结果可知喂食乳酸菌编号I(GKK2)的样品的小鼠学习记忆力越好。纵上可知，乳酸菌编号I(GKK2)对于老化所引起的神经退化进而造成的学习与记忆能力变差，有明显的改善功效。
综上所述，经由前述各项实验结果可证，乳酸菌，尤指乳双歧杆菌，更佳是指乳酸菌编号I(GKK2)，对于促进长寿Cisd2基因的表限量、各项老化指数、抓力测试、学习与记忆能力等都具有明显改善的功效，因此，乳酸菌编号I(GKK2)的活性物质具有促进长寿的用途。
本文中所述「有效量」是指一使用量，其足以使前述预防及/或治疗的效果产生。基于活体外细胞培养实验，前述有效量定义为「μg/ml」，其是基于每一个培养中所用的细胞培养液的总体积。基于动物模型实验，前述有效量定义为「g/60kg体重/天」。此外，经由活体外细胞培养实验所得到的有效量数据可经下列计算公式而转换为一合理的供动物使用的有效量：
I.一般来说(Reagan-Shaw et al.,2008)，1「μg/ml」单位(基于活体外细胞培养实验所得的有效量)可等同于1「mg/kg体重/天」单位(基于老鼠模型实验所得的有效量)，并且，基于已知老鼠的新陈代谢率是人类的六倍，可进一步求得人类的有效剂量。
II.因此，若基于活体外细胞培养实验求得有效量为500μg/ml，则于老鼠中使用的有效量可计为500mg/kg体重/天(即，0.5g/kg体重/天)。进一步地，参酌前述新陈代谢率的差异，供人类使用的有效量则可计为5g/60kg体重/天。
III.根据上述段落中所记载的试验结果，基于活体外细胞培养实验的有效量为1.5μg/ml，推算老鼠实验的有效量应为1.5mg/kg体重/天，因此供人类使用的合理的有效剂量应为0.015g/60kg体重/天。
在一较佳的实施态样中，组合物中所含的乳酸菌的活性物质的有效量为10mg/60kg-1g/60kg体重/天。
所述组合物进一步包含添加剂。在一较佳的实施态样中，添加剂可为赋型剂、防腐剂、稀释剂、填充剂、吸收促进剂、甜味剂、或其组合。赋型剂可选自柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸钙、蔗糖或其组合。防腐剂可延长医药组合物的储藏期限，例如苯甲醇、对羟基苯甲酸(parabens)。稀释剂可选自水、乙醇、丙二醇、甘油或其组合。填充剂可选自乳糖、牛乳糖、高分子量聚乙二醇或其组合。吸收促进剂可选自二甲基亚砜(DMSO)、月桂氮卓酮、丙二醇、甘油、聚乙二醇或其组合。甜味剂可选自安塞蜜(Acesulfame K)、阿斯巴甜(aspartame)、糖精(saccharin)、三氯蔗糖/蔗糖素(sucralose)、纽甜(neotame)或其组合。除上述所列举的添加剂以外，在不影响乳酸菌的活性物质的医药效果前提下，可依需求选用适合的其他添加剂。
所述组合物于医药领域中可开发为不同商品。在一较佳实施态样中，所述组合物为药品、饲料、饮料、营养补充品、乳制品、食品或保健食品。
所述组合物可根据受施予者的需要，而采用不同形态。在一较佳实施态样中，所述组合物的形态为粉剂、锭剂、造粒、栓剂、微胶囊、安瓶(ampoule/ampule)、液剂喷剂或塞剂。
本发明的组合物可使用于动物或是人类。在不影响乳酸菌的活性物质发挥效果的前提下，包含乳酸菌的活性物质的组合物可制为任何药物型态，并根据药物型态以适用的途径施予动物或人类。
组合物制备
本发明的乳酸菌活性物质若应用于食品用途，则以下组合物1的态样作为例示性实例。
组合物1：取乳酸菌编号I(GKK2)的冻干粉作为乳酸菌的活性物质(20wt％)，与作为防腐剂的苯甲醇(8wt％)、作为稀释剂的甘油(7wt％)充分混合，并溶于纯水(65wt％)中，存放于4℃备用。前述wt％是指各成分占组合物总重的比例。
本发明的乳酸菌活性物质若以液体剂型应用于医药用途，则以下组合物2的态样作为例示性实例。
组合物2：取乳酸菌编号I(GKK2)的冻干粉作为乳酸菌的活性物质(20wt％)，与作为防腐剂的苯甲醇(8wt％)、作为稀释剂的甘油(7wt％)、作为稀释剂的蔗糖(10wt％)充分混合，并溶于纯水(55wt％)中，存放于4℃备用。前述wt％是指各成分占组合物总重的比例。

Claims (12)

1. 一种乳双歧杆菌在制备用于促进长寿的组合物中的用途，其中，所述乳双歧杆菌的保藏编号为CGMCC No. 15205，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
其中所述促进长寿是相对于未施予活性物质的受施者，施予活性物质的受施者的Cisd2基因表达量增加；或者，其中所述促进长寿是相对于未施予活性物质的受施者，施予活性物质的受施者的线粒体破损降低、线粒体破损延后发生；或者，其中所述促进长寿是相对于未施予活性物质的受施者，施予活性物质的受施者的神经退化、肌肉萎缩或其组合的老化延后发生。
2. 一种乳双歧杆菌的活性物质在制备用于促进长寿的组合物中的用途，其中，所述乳双歧杆菌的保藏编号为CGMCC No. 15205，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
其中所述促进长寿是相对于未施予活性物质的受施者，施予活性物质的受施者的Cisd2基因表达量增加；或者，其中所述促进长寿是相对于未施予活性物质的受施者，施予活性物质的受施者的线粒体破损降低、线粒体破损延后发生；或者，其中所述促进长寿是相对于未施予活性物质的受施者，施予活性物质的受施者的神经退化、肌肉萎缩或其组合的老化延后发生；
其中所述活性物质是以下列方法制备得到的：
（a）取乳双歧杆菌CGMCC No. 15205的菌落接种于培养基以进行固态培养，形成乳双歧杆菌菌体；
（b）将步骤（a）培养的乳双歧杆菌菌体接种于液体培养基以进行液态培养；
（c）将步骤（b）培养的含乳双歧杆菌菌体的液态培养基离心以获得菌泥；及
（d）将步骤（c）所得的菌泥进行冷冻干燥。
3.如权利要求2所述的用途，其中步骤（b）的培养条件为：温度为35至50℃，通气量为0至1vvm氮气或二氧化碳，转速为10至100rpm及培养时间16至24小时。
4.如权利要求2所述的用途，其中步骤（d）的冷冻干燥的预冻温度为-196至-40℃。
5.如权利要求1或2所述的用途，其中，所述组合物包含一种选自下列群组的添加剂：赋型剂、防腐剂、稀释剂、填充剂、吸收促进剂、甜味剂或其组合。
6.如权利要求1或2所述的用途，其中，所述组合物为药品、饲料或食品。
7.如权利要求1或2所述的用途，其中，所述组合物为饮料。
8.如权利要求1或2所述的用途，其中，所述组合物为营养补充品。
9.如权利要求1或2所述的用途，其中，所述组合物为乳制品。
10.如权利要求1或2所述的用途，其中，所述组合物为保健食品。
11.如权利要求1或2所述的用途，其形态为粉剂、锭剂、造粒、栓剂、微胶囊、安瓶、液剂喷剂或塞剂。
12. 保藏编号为CGMCC No. 15205的乳双歧杆菌在制备用于促进长寿的医药组合物中的用途；
其中所述促进长寿是相对于未施予活性物质的受施者，施予活性物质的受施者的Cisd2基因表达量增加；或者
其中所述促进长寿是相对于未施予活性物质的受施者，施予活性物质的受施者的线粒体破损降低、线粒体破损延后发生；或者
其中所述促进长寿是相对于未施予活性物质的受施者，施予活性物质的受施者的神经退化、肌肉萎缩或其组合的老化延后发生。
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