TW202008996A - 乳雙歧桿菌gkk2之活性物質、含其之組合物及其促進長壽之用途 - Google Patents

乳雙歧桿菌gkk2之活性物質、含其之組合物及其促進長壽之用途 Download PDF

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Abstract

本發明提供一種乳酸菌之活性物質、含其之組合物及其促進長壽之用途，特別用於增加Cisd2基因表現量、降低粒線體破損、延緩神經退化與肌肉萎縮等老化現象。

Description

乳雙歧桿菌GKK2之活性物質、含其之組合物及其促進長壽之用途
本發明關於一種用於促進長壽的乳酸菌之活性物質、含其之組合物及其用途；更明確地說，係關於一種以乳雙歧桿菌GKK2之活性物質，製造包含該活性物質之組合物，並將該組合物施予一受施者，以用於增加Cisd2基因表現量、降低粒線體破損、延緩神經退化與肌肉萎縮等老化現象。
長壽基因
科學家一直想找到長壽的秘密。科學家推測若能適應環境而生存的更久，就能更長壽。因此，著眼於環境壓力（像是酷熱的天氣等嚴苛的氣候條件，或是食物、飲水稀少時的飢餓狀態），發現有一群基因與其相關。該等基因不論年齡多大，都可發揮維持天然保護個體和修復活性的效果。這些基因強化著生物的生存能力，使得個體得以度過危機。這些基因被認定為長壽基因，若其能長期保持活性，就可大幅增進個體的健康並延長壽命。
另一群科學家則從人瑞著手，對人瑞進行基因檢測。科學家發現相較於平均壽命者，人瑞存在一些特定基因顯著高度表現，進而推測壽命長短可能與這些基因相關。
Cisd2 基因
Cisd2基因是一個在演化過程中被高度留存的基因，從低等無脊椎動物、脊椎動物，到高等哺乳類等生物都擁有該基因。從這一點來看，顯示Cisd2基因可能掌管著重要的生物功能。Cisd2基因所表現出來的蛋白質位於粒線體的外膜上。若缺少 Cisd2基因會導致粒線體破損，而會影響其構造和功能，使得老化症狀接踵而至。在關於Cisd2基因的研究論文指出，剔除Cisd2基因的老鼠的體型相較於未剔除Cisd2基因的對照組明顯較為瘦小，其平均壽命也僅有對照組老鼠壽命的一半不到。在實驗的觀察過程中，Cisd2基因剔除鼠在3週左右（對應人類年齡約10至12歲）開始出現神經退化、肌肉萎縮等現象；在4週左右（對應人類年齡約15歲），其體重明顯下降；在8週左右（對應人類年齡約18至20歲），眼睛凸出且呈現白濁色、並有骨質疏鬆；在12週至48週（對應人類年齡約30至45歲），Cisd2基因剔除鼠先後出現駝背、眼盲、髮蒼、皮膚鬆弛等早衰現象。進一步觀察正常老鼠自然衰老的過程中，Cisd2基因的表現量隨著年齡增加而有下降的趨勢；在14個月左右（對應人類年齡約60歲）下降至年輕時的60%，在28個月左右（對應人類年齡約90歲）下降到老鼠年輕時的30%。從以往的研究與上述列舉之報告，證實Cisd2基因是維持正常壽命所必需的基因，而與老化息息相關。
乳酸桿菌屬
乳酸桿菌屬（Lactobacillus spp. ） 存在於一般環境中，其能將碳水化合物發酵成乳酸，因此多應用於發酵食品的製造。早在1900年代，就已發現此菌對於人體健康具有多重益處，具有幫助消化、改善腸道健康的功效，而被提倡多食用乳酸菌以改善消化環境、促進腸道蠕動。經研究後又發現，由於乳酸菌能分解醣類（舉例如乳糖、葡 萄糖、蔗糖、果糖），因此可產生乳酸和醋酸，並藉此酸化腸道的環境，而達到抑制害菌於腸道中增殖，以及調整腸內菌叢平衡的有益效果。
縱使同為乳酸桿菌屬，若為不同種、或甚至是同種但不同菌株也具有不一樣的特徵，對人體亦會有不同的影響。舉例來說，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum ）已被研究出具有改善人體健康之功效，如L. plantarum PH04 具降低血中膽固醇能力；L.plantarum 299V 可減輕IL-10缺乏型小鼠之結腸炎症狀；L.plantarum 10hk2 可提高前發炎介質，如IL-1β、IL-6和TNF-α，及抗發炎介白素-10（IL-10），達到抗發炎效果；L. plantarum K21 具有降低血中膽固醇、三酸甘油脂含量，以及具有抗發炎之功效。
雙歧桿菌屬
雙歧桿菌屬（Bifidobacterium ）廣泛存在於人和動物的消化道、陰道和口腔等環境中。其為革蘭氏陽性、不運動、細胞呈杆狀、一端有時呈分叉狀且嚴格厭氧。此細菌早在1899年就從健康應而的糞便中分離出來，隨後的研究發現此細菌的部分特定菌株可作為益生菌以應用於食品、醫藥和飼料等領域。
然而，卻沒有相關的研究述及乳酸菌對於壽命長短的影響，亦無實驗驗證乳酸菌是否會藉由對Cisd2基因的表現量，進而改變個體的生理環境，並決定了個體的壽命長短。
本發明的目的在於提供一種促進長壽之組合物，其包含一乳雙歧桿菌，其中該乳雙歧桿菌以寄存編號BCRC910826寄存於財團法人食品工業發展研究所。
本發明的另一個目的在於提供 一種促進長壽之組合物，其包含一有效量之乳雙歧桿菌之活性物質，其中該乳雙歧桿菌寄存於財團法人食品工業發展研究所，其寄存編號為BCRC910826。
較佳地，該活性物質其以下列方法製備： （a）取一乳酸菌菌落（colony）接種於培養基以進行固態培養，形成乳酸菌菌體；及 （b）將步驟（a）培養的乳酸菌菌體接種於液體培養基以進行液態培養。
較佳地，該方法進一步包含下列步驟： （c）將步驟（b）培養的含乳酸菌菌體之液態培養基離心以獲得菌泥；及 （d）將步驟（c）所得的該菌泥進行冷凍乾燥。
較佳地，該步驟（b）的溫度為35至50℃、通氣量為0至1vvm氮氣或二氧化碳、轉速為10至100rpm及/或培養時數16至24小時。
較佳地，該步驟（d）的冷凍乾燥之預凍溫度為-196至-40℃。
較佳地，其包含一種選自下列群組的添加劑：賦型劑、防腐劑、稀釋劑、填充劑、吸收促進劑、甜味劑或其組合。
較佳地，其為一藥品、飼料、飲料、營養補充品、乳製品、食品或保健食品。
較佳地，其形態為粉劑、錠劑、造粒、栓劑、微膠囊、安瓶、液劑噴劑或塞劑。
本發明的再一個目的為提供一種乳酸菌之組合物用於促進長壽的用途。
較佳地，該促進長壽係相對於未施予活性物質之受施者，施予活性物質之受施者的Cisd2基因表現量增加。
較佳地，該促進長壽係相對於未施予活性物質之受施者，施予活性物質之受施者的粒線體破損降低、粒線體破損延後發生。
較佳地，該促進長壽係相對於未施予活性物質之受施者，施予活性物質之受施者的神經退化、肌肉萎縮或其組合之老化延後發生。
菌種來源
本實驗中所使用的乳酸菌，包含乳酸桿菌與雙歧桿菌。在一較佳的實施態樣中，乳酸菌之菌種係選購自財團法人食品工業發展研究所之生物資源研究中心（BCRC）。在一較佳的實施態樣中，於下述實驗使用的乳酸菌編號A至J，其種類與其寄存編號表列如下表1。編號A與H之乳酸菌的菌種採集與分離純化過程以及基因分析與鑑定結果，可參考中華民國專利申請案第106137773號申請案與第106136134號申請案。
表1、乳酸菌之編號、種類及寄存編號：
Figure 107128656-A0304-0001
表現型分析
以耐酸、耐膽鹽與耐熱試驗比較編號I的乳酸菌和其他菌種間表現型差異的研究。
耐酸試驗
將GKK2、從食品工業發展研究所生物資源保存與研究中心購入的BCRC 17394、動物雙歧桿菌乳酸亞種Bi 04 （B. animalis subsp. Lactis Bi 04，以編號ATCC SD 5219寄存於美國典型菌種保存中心）、動物雙歧桿菌乳亞種BB-12（B.animalis subsp. Lactis BB-12，以編號DSM 15954寄存於德國微生物菌種保存中心）與動物雙歧桿菌乳亞種Bi07（B.animalis subsp. Lactis Bi07，以編號ATCC SD 5220寄存於美國典型菌種保存中心）共5種菌株活化。藉由添加HCl 至MRS液態培養基中，將酸鹼值約為pH 6.5的原始MRS液態培養基，調整該培養基的酸鹼度為另3種不同酸鹼度：約pH 3.2、pH 2.4與pH 2.0。將菌株接種在該等不同酸鹼值的培養基，於37℃下培養3小時後，計數菌落形成數目。
結果如圖1所示，於原始pH培養下（約pH 6.5），GKK2與其他4種菌株的菌數皆可達到5x109 cfu/ml。於酸鹼值為pH 3.2時，全部菌株的菌數略為下降，GKK2與其他4種菌株相較未出現顯著差異。當酸鹼值下降至pH 2.4跟pH 2.0時，BCRC 17394、BB-12與Bi07菌數降至約6~7次方，都顯著低於菌數維持於8次方以上的GKK2（P ＜0.05）。據此，在酸性環境下GKK2的活菌數顯著多於他種菌株，此實驗結果說明GKK2的耐酸能力相較於其他菌株更佳，故GKK2通過胃部時抵禦胃酸的能力更佳。
耐膽鹽試驗
將GKK2、從食品工業發展研究所生物資源保存與研究中心購入的BCRC 17394、動物雙歧桿菌乳酸亞種Bi 04 （B. animalis subsp. Lactis Bi 04，以編號ATCC SD 5219寄存於美國典型菌種保存中心）、動物雙歧桿菌乳亞種BB-12（B.animalis subsp. Lactis BB-12，以編號DSM 15954寄存於德國微生物菌種保存中心）與動物雙歧桿菌乳亞種Bi07（B.animalis subsp. Lactis Bi07，以編號ATCC SD 5220寄存於美國典型菌種保存中心）共5種菌株活化。將該等菌種接種於含0.3%膽鹽的MRS液態培養基中，於37℃下浸泡半小時後，觀察並計數菌數。
結果如圖2所示，於原始MRS 液態培養基培養下，GKK2與其他4種菌株的菌數皆可達到5x109 cfu/ml。在添加有0.3%膽鹽的MRS中，BCRC 17394、Bi 04與Bi07的菌數都顯著低於GKK2菌數（P ＜0.05），BB-12的菌數則與GKK2統計上無顯著差異。據此，在膽鹽環境下GKK2的活菌數顯著多於他種菌株，此實驗結果說明GKK2的耐膽鹽能力相較於其他菌株更佳，故GKK2通過體內消化道時抵禦膽鹽的能力更佳。
耐熱試驗
將GKK2、從食品工業發展研究所生物資源保存與研究中心購入的BCRC 17394、動物雙歧桿菌乳酸亞種Bi 04 （B. animalis subsp. Lactis Bi 04，以編號ATCC SD 5219寄存於美國典型菌種保存中心）、動物雙歧桿菌乳亞種BB-12（B.animalis subsp. Lactis BB-12，以編號DSM 15954寄存於德國微生物菌種保存中心）與動物雙歧桿菌乳亞種Bi07（B.animalis subsp. Lactis Bi07，以編號ATCC SD 5220寄存於美國典型菌種保存中心）共5種菌株活化。將該等菌種接種於 MRS液態培養基中，分別於70℃下加熱5、10、15分鐘後，觀察並計數菌數。
結果如圖3所示，於未加熱情況下（0分鐘），GKK2與其他4種菌株的菌數皆可達到5x109 cfu/ml。在70℃下加熱5分鐘後，BCRC 17394、Bi 04與Bi07的菌數都顯著低於GKK2菌數（P ＜0.05），BB-12的菌數則與GKK2統計上無顯著差異。而在70℃下加熱15分鐘後，其他4株菌的菌數都顯著低於GKK2菌數（P ＜0.05）。據此，在高溫環境下GKK2的活菌數顯著多於他種菌株，此實驗結果說明GKK2的耐熱能力較好。況且，乳酸菌普遍都不耐熱而須保存於低溫下維持活性，此試驗甚至顯示GKK2具有耐高溫並於常溫下久放的特性，而對於將GKK2應用於製程開發非常有幫助。
菌種培養
將上述編號A至J共10種之乳酸菌，勾取其菌落（colony）接種於固態培養基上以活化菌種。在一較佳的實施態樣中，該固態培養基為MRS agar。待乳酸菌的菌體生長完成後，將新鮮的菌體連同固態培養基接入於含有液態培養基的錐形瓶中進行液態培養。在一較佳的實施態樣中，於溫度35至50℃下、通氣量0至1vvm氮氣或二氧化碳、速率10至100rpm的條件下液態培養。在一較佳的實施態樣中，液態培養的時間為16至24小時，更佳為18小時。在一較佳的實施態樣中，液態培養基為MRS液態培養基。在一較佳的實施態樣中，液態培養基的配方如下表2所示。
表2、液態培養基的配方：
Figure 107128656-A0304-0002
凍乾粉製備
待乳酸菌的菌種於液態培養完成生長後，收集包含有乳酸菌菌體之液態培養基進行離心以獲得菌泥。在一較佳的實施態樣中，包含有乳酸菌菌體之液態培養基以速率1000至15000rpm進行離心。將取得之菌泥與保護劑（保護劑為6-30%的脫脂奶粉）混合後冷凍乾燥，凍乾後置於低溫保存。在一較佳的實施態樣中，冷凍乾燥的預凍溫度設定於-196至-40℃。在一較佳的實施態樣中，冷凍乾燥時間為16至72小時。在一較佳的實施態樣中，保存溫度為-30℃至0℃。保存之乳酸菌凍乾粉作為用於以下細胞實驗之原料，意即為本案所請之乳酸菌之活性物質的其中一態樣。本案所請之乳酸菌活性物質之態樣，亦包含前述將菌體進行液態培養後所得之含菌體之培養液狀態。
Cisd2 螢光素酶報導基因檢測
以Cisd2 基因作為標靶，利用Cisd2基因之啟動子來控制螢光素酶（Luciferase）報導基因之人類胚胎腎細胞HEK293細胞平台（取自陽明大學），測試乳酸菌之活性物質是否會影響Cisd2基因的表現。將帶有螢光素酶報導基因的HEK293細胞2x105 cell/mL種於96孔盤中，並於培養箱以溫度37℃，氣體環境為5% CO2 ，培養一天。接著，將上述備用的編號A至J共10種的乳酸菌之凍乾粉，以載體 0.1% DMSO回溶，配製為如下表3之不同濃度，再將其加入於HEK293細胞的培養液中。對照組則僅於HEK293細胞的培養液中加入載體 0.1% DMSO。使HEK293細胞與乳酸菌之活性物質或載體於培養箱以溫度37℃，氣體環境為5% CO2 ，共同培養24小時。最後， 測量HEK293細胞之螢光素酶的活性，並進行定量分析。針對不同濃度之不同種類的乳酸菌之活性物質，重複上述實驗三次。實驗結果繪製如圖4。
表3、編號A至J的乳酸菌之凍乾粉之濃度：
Figure 107128656-A0304-0003
內生性 Cisd2 表現量
為進一步確認乳酸菌之活性物質對於Cisd2基因的表現之影響，偵測細胞內生性Cisd2的基因活性。首先，將一般人類胚胎腎細胞HEK293 2x105 cell/mL種於96孔盤中，並於培養箱以溫度37℃，氣體環境為5% CO2 ，培養一天。接著，將編號A、B、C、D、H與I共6種的乳酸菌之凍乾粉，以載體 0.1% DMSO回溶，配製為如下表4之不同濃度，再將其加入於HEK293細胞的培養液中。對照組則僅於HEK293細胞的培養液中加入載體 0.1% DMSO。使HEK293細胞與乳酸菌之活性物質或載體於培養箱以溫度37℃，氣體環境為5% CO2 ，共同培養24小時。於冰上將細胞刮下，利用市售RNA純化套組（GeneJET RNA Purification Kit, Thermo）抽出mRNA。將所得之mRNA配置為適當濃度後，再利用RNA反轉錄套組（RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit, Thermo）將mRNA反轉錄成cDNA。最後，以PCR分析內生性Cisd2的表現量。 實驗結果之膠圖如圖5，統計圖5之數據如圖6。
表4、編號A、B、C、D、H與I的乳酸菌之凍乾粉之濃度：
Figure 107128656-A0304-0004
Cisd2 實驗之 統計分析方法
所有結果數據皆為平均值±標準差（mean ± SD）。倍數變化為比較控制組與實驗組之間基因活性的變化。當分析實驗組與控制組之間統計上的差異時，*p＜0.05被定義為具顯著差異，**p＜0.01為極顯著差異。
Cisd2 實驗之 實驗結果
針對Cisd2螢光素酶報導基因檢測的實驗結果如圖4，編號A至J之十種乳酸菌之活性物質中，以編號A、C、H與I的乳酸菌之活性物質處理的HEK293細胞，其螢光量高於對照組。此結果說明，編號A、C、H與I的乳酸菌之活性物質對於Cisd2基因表現有促進的趨勢。針對編號A之實驗組的結果，不論以濃度12.5 μg/ml 或更高濃度的25 μg/ml來刺激細胞，螢光素酶表現量皆高於對照組。該結果說明編號A的乳酸菌之活性物質對於Cisd2基因有活化作用，且可刺激Cisd2基因的表現。針對編號C之實驗組的結果，以濃度0.25 μg/ml 或0.5 μg/ml來刺激細胞，顯示與編號A相類似的結果，兩種濃度下的螢光素酶表現量皆高於對照組。該結果同樣說明編號C的乳酸菌之活性物質對於Cisd2基因有活化作用，也可刺激Cisd2基因的表現。針對編號H之實驗組的結果，當其以濃度1.5 μg/ml來刺激細胞，相較於對照組產生約1.14倍之螢光素酶表現量。該結果同樣證實編號H的乳酸菌之活性物質對於Cisd2基因有顯著的活化作用（p＜0.05），且具有刺激Cisd2基因表現的潛力。編號I於濃度2.5 μg/ml及5 μg/ml的螢光素酶表現量亦高於對照組，說明編號I之乳酸菌也有活化Cisd2基因表現之潛力。
針對內生性Cisd2基因表現量的實驗結果如圖5與圖6。編號A與C之Cisd2基因的mRNA的表現量並未明顯高於對照組，其中編號C甚至低於對照組。編號H與I之Cisd2基因的mRNA的表現量則皆顯著高於對照組，其中編號H於濃度1.5 μg/ml與5 μg/ml及編號I於濃度2.5 μg/ml下的Cisd2之表現量相較於對照組有統計學上的意義，顯示編號H與I之乳酸菌對於Cisd2基因的mRNA的表現量有顯著促進的趨勢。具體來說，編號H在濃度1.5 μg/ml可以刺激約1.15倍表現（p＜0.05），在濃度5 μg/ml可以刺激約1.37倍表現（p＜0.01），隨著乳酸菌之活性物質的濃度升高，其表現量也隨之提升，顯示具有濃度-效應關係（concentration-effect relation）。編號I在濃度2.5 μg/ml則可刺激約1.21倍表現（p＜0.05）。
經上述實驗結果，證實特定乳酸菌之活性物質（較佳為副乾酪乳酸桿菌、胚芽乳酸桿菌或乳雙歧桿菌）具有提高Cisd2基因表現量而延長壽命的功效，開發出乳酸菌於醫藥領域中另一新穎用途。據此，為使乳酸菌之活性物質得以具體應用，製造一種包含乳酸菌之活性物質的組合物，並以一有效量施予一個體該組合物來達到所欲效果。
以下實驗係以乳酸菌編號I（GKK2）為對象進行延緩老化進而促進長壽之功效評估。乳酸菌編號H（GKM3）及乳酸菌編號A（GKS6）將分別於另案申請。
實驗動物之老化評估
本動物實驗流程概要請參圖7。本實驗的實驗動物選用基因遺傳型老化動物的老化促進小鼠（senescence-accelerated mouse; SAM） ，其係由日本京都大學以AKR/J系小鼠進行同胞兄妹相互交配繁殖，所培育出來的加速老化動物的模型。本實驗所採用的SAM-P8 （SAMP8） 品系之小鼠，其表徵為腦部神經元細胞喪失、皮質萎縮、脂褐質、腦幹網狀組織海綿樣變性與類澱粉蛋白沉積，且其他臟器快速老化、生命期短，故適合作為延緩衰老及生殖機能之相關研究之實驗動物模型。小鼠飼養於30（W）×20（D）×10（H）cm3 之透明塑膠籠中，動物房之溫度維持在25±2℃、相對濕度維持在65±5%，且為無塵自動控制室中。光照週期以自動定時器來控制，07:00至19:00屬於黑暗期（dark period），19:00至07:00屬於光照期（light period）。
本實驗的實驗設計參考衛生署「健康食品之延緩衰老保健功效評估方法」，選用3月齡的雌雄SAM-P8小鼠作為實驗動物，分為對照組及乳酸菌編號I之實驗組，再以雌、雄分組，共4組，每組10隻，共40隻；對照組管灌樣品為ddH2 O；實驗組則是管灌以乳酸菌I（GKK2）凍乾粉回溶於ddH2 O且配置為所欲劑量的樣品。分組及其樣品劑量詳如下表5：
表5
Figure 107128656-A0304-0005
實驗進行時程為期13週，各組每日管灌樣品一次，實驗期間紀錄小鼠攝食、飲水量。在第12週進行老化指數（aging score）評估，以及單次被動迴避試驗（single-trial passive avoidance test）。第13週則進行前肢抓力測試與主動迴避試驗（active shuttle avoidance test）。小鼠於行為測試完成後，以二氧化碳昏迷，採用斷頭採血方式犧牲（犧牲前禁食8小時），取血液及器官進行分析。
老化指數
老化指數是由Takeda等學者於1981年訂定，用來評估SAM品系小鼠的衰老程度。從評估項目中選擇以下六項以評估小鼠老化程度，包含毛髮光澤度、粗造度、毛髮稀疏脫落情況、皮膚潰瘍情形、眼睛周圍的紅腫發炎、脊椎前後彎曲程度。該評估測試中，依衰老程度由低到高分為0、1、2、3、4等級。將逐項評估後所得分數累積，分數愈高者表示小鼠的老化程度越高。
前肢抓力測試
在老化的過程中生理機能逐漸退化，再加上可能患有多重慢性疾病，而導致活動量下降的不動（disuse），進而加速肌肉量的減少。一般而言，在30歲以後每年減少1-2％的肌肉量，60歲以後減少的速度遽增，肌肉量每年減少甚至達到約15%。肌肉量的減少亦是後續不良健康事件，如失能、跌倒、功能退化、長期臥床、甚至死亡的危險因子。
伴隨老化所帶來的骨骼肌流失，演變為肌少症，又稱「骨骼肌衰老症」或「老年性骨骼肌減少症」。肌少症的症狀從三方面探討：（1）肌肉量減少 （low muscle mass）；（2） 肌力減弱 （lowmuscle strength）；（3） 行動能力降低 （low physical performance）。對此，2010 歐洲老年醫學聯盟針對老化造成的肌少症，提出其診斷方式及定義。65歲以上老年人，若每秒鐘正常行走速度小於1公尺或手握力差，且肌肉量小於特定臨界值，即判定為肌少症。根據台大醫院內科和家醫科門診中老年人的收案資料統計，隨著年齡的增長男性肌少症盛行率從18%增加至64%；女性肌少症盛行率則從9%上升至41%。肌少症與身體衰弱在臨床上可經由有效的介入與診斷，延緩病況惡化，以避免後續所引發之不良健康事件。
在小鼠實驗中，使用抓力計（GSM Grip Strength Meter Cat. No. 47200）來測試SAMP8小鼠前肢抓力，以評估肌肉強度。操作方式是以手固定小鼠尾巴末端處，使小鼠前肢握住拉環，並以水平方式將小鼠尾巴向後施力，直至小鼠前肢鬆開為止。由拉力機記錄連續三次，並取最大值進行統計。
單次被動迴避試驗
藉由古典制約原理與小鼠的趨暗特性，判斷乳酸菌對小鼠學習記憶能力的影響。利用一特殊盒子，其中央以一閘門分隔出明室與暗室，使兩室可相通，箱底設有平行排列且接上電流器的金屬桿。測試開始時，先將小鼠置於明室並打開閘門，使小鼠自由探索。若小鼠進入暗室，隨即關上閘門並給予0.5微安培0.5秒之電擊，以此作為小鼠的學習訓練。完成訓練後之24小時、48小時及72小時的記憶能力，分別採用同樣的方式操作測試，但此時不再給予電擊，並記錄小鼠在明室所滯留的時間，測試時間最長為180秒。此測試探討小鼠於系統下滯留明室的時間長短，來判定小鼠學習記憶的能力。若小鼠滯留於明室的時間越長，顯示小鼠的記憶能力越佳。
主動迴避試驗
藉由古典制約原理與小鼠厭惡聲光刺激的特性，判斷乳酸菌對小鼠學習記憶能力的影響。利用一特殊盒子，其中央以一閘門分隔出明室與暗室，使兩室可相通，箱底設有平行排列且接上電流器的金屬桿。時間、聲光及電擊由電腦程式控制。首先給予小鼠10秒鐘的光及聲音刺激（conditioned stimulus；CS），若小鼠無迴避之反應，系統則給予電擊（unconditioned stimulus；UCS）；若小鼠迴避CS，則不給予電擊。試驗動物連續4天、每天4次、每次5回進行上述主動迴避的CS/UCS測試。此測試探討小鼠於系統下迴避反應的次數，判定小鼠學習記憶的能力。若小鼠迴避反應的次數越多，顯示小鼠的記憶能力越佳。
動物實驗之統計方法
本研究所得之資料以SPSS統計套裝軟體進行統計分析，實驗結果的數值皆以平均值±平均標準誤差（mean±SEM） 表示。實驗數據利用單因子變異數分析（one-way analysis of variance; one-way ANOVA），檢定多組間之差異，以Duncan’s Multiple Range Test多重全距檢定比較各組間差異。當p ＜ 0.05表示具有顯著性差異。
動物實驗之實驗結果
針對老化指數評估，各組的實驗結果顯示如表6與表7：
表6、雌性小鼠的老化指數
Figure 107128656-A0304-0006
 Values were expressed as mean ± S.E.M. and analyzed by one-way ANOVA.（ n = 10 ） ※相同上標字母表示組間統計無顯著差異
表7、雄性小鼠的老化指數
Figure 107128656-A0304-0007
 Values were expressed as mean ± S.E.M. and analyzed by one-way ANOVA.（ n = 10 ） ※相同上標字母表示組間統計無顯著差異
從上述小鼠在12週的老化指數所統計的總分來看，3月齡的雌、雄性SAMP8小鼠在餵食實驗樣品後，餵食乳酸菌編號I（GKK2）的實驗組與對照組相比皆達到顯著差異，其中雌性小鼠較為顯著（p ＜ 0.05）。由於老化指數越高（參表6及表7之總計值）顯示衰老的程度越高，故老化指數的實驗結果說明給予乳酸菌編號I（GKK2）的樣品有助於降低SAMP8小鼠之老化程度。乳酸菌編號I（GKK2）對於防止老化有明顯的功效。
針對前肢抓力測試，雄性小鼠各組的實驗結果顯示如表8並統計如圖8：
表8、雄性小鼠的前肢抓力測試
Figure 107128656-A0304-0008
 Values were expressed as mean ± S.E.M. and analyzed by one-way ANOVA. （n = 10）* 表示與對照組統計上具顯著差異（p＜0.05）
從上述小鼠在13週的前肢抓力測試中的抓力強度來看，3月齡雌、雄性SAMP8小鼠在餵食樣品後，乳酸菌編號I（GKK2）的實驗組顯著高於對照組（p ＜ 0.05）。由於小鼠的抓力強度越強表示其肌肉強度越佳，故從結果可知餵食乳酸菌編號H的樣品的小鼠肌肉強度較好。乳酸菌編號I（GKK2）對於減緩老化所引發之肌肉弱化的症狀有明顯的功效。
針對單次被動迴避試驗，雌性小鼠各組的實驗結果顯示如表9並統計如圖9，雄性小鼠各組的實驗結果顯示如表10並統計如圖10：
表9、雌性小鼠的單次被動迴避試驗
Figure 107128656-A0304-0009
 Values were expressed as mean ± S.E.M. and analyzed by one-way ANOVA.（ n = 10 ） * 表示與對照組統計上具顯著差異（p＜0.05）
表10、雄性小鼠的單次被動迴避試驗
Figure 107128656-A0304-0010
 Values were expressed as mean ± S.E.M. and analyzed by one-way ANOVA.（ n = 10 ） * 表示與對照組統計上具顯著差異（p＜0.05）
從上述小鼠在13週的單次被動迴避試驗中的滯留時間來看，3月齡雌、雄性SAMP8小鼠在餵食樣品後，餵食乳酸菌編號I（GKK2）的實驗組與對照組相比皆有差異，其中小鼠在第24小時的滯留時間的差異較為明顯。由於小鼠的滯留時間越長表示其學習記憶力越佳，故從結果可知，餵食乳酸菌編號I（GKK2）的樣品的小鼠學習記憶力越好。乳酸菌編號I（GKK2）對於防止老化有明顯的功效。
針對主動迴避試驗，雌性小鼠各組的實驗結果顯示如表10並統計如圖10，雄性小鼠各組的實驗結果顯示如表11並統計如圖11：
表10、雌性小鼠的主動迴避試驗
Figure 107128656-A0304-0011
 Values were expressed as mean ± S.E.M. and analyzed by one-way ANOVA.（ n = 10 ） * 表示與對照組統計上具顯著差異（p＜0.05）
表11、雄性小鼠的主動迴避試驗
Figure 107128656-A0304-0012
 Values were expressed as mean ± S.E.M. and analyzed by one-way ANOVA.（ n = 10 ） * 表示與對照組統計上具顯著差異（p＜0.05）
從上述小鼠在14週的主動迴避試驗中的成功迴避反應（avoidance respons）次數來看，3月齡雌、雄性SAMP8小鼠在餵食樣品後，小鼠在實驗第一天，由於仍處於學習階段，因此各組間之結果沒有明顯的差異。但雌、雄性小鼠在試驗第二至四天實驗組相對於對照組皆明顯增加迴避次數，其中尤其是雌性小鼠第三天實驗組的迴避次數甚至為對照組的約兩倍之多（p ＜ 0.05）。由於小鼠的成功迴避反應（avoidance respons）次數越多表示其學習記憶力越佳，故從結果可知餵食乳酸菌編號I（GKK2）的樣品的小鼠學習記憶力越好。縱上可知，乳酸菌編號I（GKK2）對於老化所引起的神經退化進而造成的學習與記憶能力變差，有明顯的改善功效。
綜上所述，經由前述各項實驗結果可證，乳酸菌，尤指乳雙歧桿菌，更佳是指乳酸菌編號I（GKK2），對於促進長壽Cisd2基因的表限量、各項老化指數、抓力測試、學習與記憶能力等都具有明顯改善之功效，因此，乳酸菌編號I（GKK2）之活性物質具有促進長壽之用途。
本文中所述「有效量」係指一使用量，其足以使前述預防及/或治療的效果產生。基於活體外細胞培養實驗，前述有效量係定義為「μg/ml」，其係基於每一個培養中所用之細胞培養液的總體積。基於動物模型實驗，前述有效量係定義為「g/60 kg body weight/day」。此外，經由活體外細胞培養實驗所得到的有效量數據可經下列計算公式而轉換為一合理之供動物使用的有效量： I. 一般來說（Reagan-Shawet al ., 2008），1「μg/ml」單位（基於活體外細胞培養實驗所得之有效量）可等同於1「mg/kg body weight/day」單位（基於老鼠模型實驗所得之有效量），並且，基於已知老鼠的新陳代謝率是人類的六倍，可進一步求得人類的有效劑量。 II. 因此，若基於活體外細胞培養實驗求得有效量為500 μg/ml，則於老鼠中使用的有效量可計為500 mg/kg body weight/day（即，0.5 g/kg body weight/day）。進一步地，參酌前述新陳代謝率的差異，供人類使用的有效量則可計為5 g/60 kg body weight/day。 III. 根據上述段落中所記載的試驗結果，基於活體外細胞培養實驗的有效量為1.5 μg/ml，推算老鼠實驗的有效量應為1.5 mg/kg body weight/day，因此供人類使用之合理的有效劑量應為0.015 g/60 kg body weight/day。
在一較佳的實施態樣中，組合物中所含的乳酸菌之活性物質的有效量為10 mg/60 kg-1g/60 kg body weight/day。
該組合物進一步包含添加劑。在一較佳的實施態樣中，該添加劑可為賦型劑、防腐劑、稀釋劑、填充劑、吸收促進劑、甜味劑、或其組合。該賦型劑可選自檸檬酸鈉、碳酸鈣、磷酸鈣、蔗糖或其組合。該防腐劑可延長醫藥組合物的儲藏期限，例如苯甲醇、對羥基苯甲酸（parabens）。稀釋劑可選自水、乙醇、丙二醇、甘油或其組合。填充劑可選自乳糖、牛乳糖、高分子量舉乙二醇或其組合。吸收促進劑可選自二甲基亞碸（DMSO）、月桂氮卓酮、丙二醇、甘油、聚乙二醇或其組合。甜味劑可選自安塞甜（Acesulfame K）、阿斯巴甜（aspartame）、糖精（saccharin）、三氯蔗糖／蔗糖素（sucralose）、紐甜（neotame）或其組合。除上述所列舉的添加劑以外，在不影響乳酸菌之活性物質的醫藥效果前提下，可依需求選用適合的其他添加劑。
該組合物於醫藥領域中可開發為不同商品。在一較佳實施態樣中，該組合物為一藥品、飼料、飲料、營養補充品、乳製品、食品或保健食品。
該組合物可根據受施予者之需要，而採用不同形態。在一較佳實施態樣中，該組合物的形態為粉劑、錠劑、造粒、栓劑、微膠囊、安瓶（ampoule/ampule）、液劑噴劑或塞劑。
本發明的組合物可使用於動物或是人類。在不影響乳酸菌之活性物質發揮效果的前提下，包含乳酸菌之活性物質的組合物可製為任何藥物型態，並根據藥物型態以適用的途徑施予該動物或人類。
組合物製備
本發明之乳酸菌活性物質若應用於食品用途，則以下組合物1之態樣作為例示性實例。
組合物1：取乳酸菌編號I（GKK2）的凍乾粉作為乳酸菌之活性物質（20 wt%），與作為防腐劑之苯甲醇（8wt%）、作為稀釋劑之甘油（7 wt%）充分混合，並溶於純水（65 wt%）中，存放於4℃備用。前述wt%係指各成分佔組合物總重之比例。
本發明之乳酸菌活性物質若以液體劑型應用於醫藥用途，則以下組合物2之態樣作為例示性實例。
組合物2：取乳酸菌編號I（GKK2）的凍乾粉作為乳酸菌之活性物質（20 wt%），與作為防腐劑之苯甲醇（8wt%）、作為稀釋劑之甘油（7 wt%）、作為稀釋劑之蔗糖（10 wt%）充分混合，並溶於純水（55 wt%）中，存放於4℃備用。前述wt%係指各成分佔組合物總重之比例。
無
圖1顯示耐酸試驗結果的菌落數目。
圖2顯示耐膽鹽試驗的菌落數目。
圖3顯示耐熱試驗結果的菌落數目。
圖4顯示，以不同劑量之編號A至J的乳酸菌之活性物質，處理含有Cisd2基因之啟動子所控制的螢光素酶（Luciferase）報導基因之HEK293細胞後所誘發的螢光表現量。
圖5顯示以不同劑量之編號A、B、C、D、H與I的乳酸菌之活性物質處理HEK293細胞，其內生性的Cisd2 訊息RNA（mRNA）之表現量的膠圖。
圖6顯示圖5之Cisd2 訊息RNA（mRNA）之表現量統計結果。
圖7顯示動物實驗流程。
圖8顯示雄性小鼠的前肢抓力測試的抓力強度 。
圖9顯示雌性小鼠的單次被動迴避試驗的滯留時間。
圖10顯示雄性小鼠的單次被動迴避試驗的滯留時間。
圖11顯示雌性小鼠的主動迴避試驗結果的迴避反應次數。
圖12顯示雄性小鼠的主動迴避試驗的迴避反應次數。
乳酸菌編號H的GKM3：BCRC910787
乳酸菌編號I的GKK2： BCRC-910826
乳酸菌編號A的GKS6：BCRC-910788

Claims (13)

  1. 一種促進長壽之組合物，其包含一乳雙歧桿菌，其中該乳雙歧桿菌以寄存編號BCRC910826寄存於財團法人食品工業發展研究所。
  2. 一種促進長壽之組合物，其包含一有效量之乳雙歧桿菌之活性物質，其中該乳雙歧桿菌寄存於財團法人食品工業發展研究所，其寄存編號為BCRC910826。
  3. 如請求項2所述之組合物，其中該活性物質係以下列方法製備： （a）取一乳酸菌菌落（colony）接種於培養基以進行固態培養，形成乳酸菌菌體；及 （b）將步驟（a）培養的乳酸菌菌體接種於液體培養基以進行液態培養。
  4. 如請求項3所述之組合物，其中該方法進一步包含下列步驟： （c）將步驟（b）培養的含乳酸菌菌體之液態培養基離心以獲得菌泥；及 （d）將步驟（c）所得的該菌泥進行冷凍乾燥。
  5. 如請求項3所述之組合物，其中該步驟（b）的溫度為35至50℃、通氣量為0至1vvm氮氣或二氧化碳、轉速為10至100rpm及/或培養天數16至24小時。
  6. 如請求項4所述之組合物，其中該步驟（d）的冷凍乾燥之預凍溫度為-196至-40℃。
  7. 如請求項1或2所述之組合物，其包含一種選自下列群組的添加劑：賦型劑、防腐劑、稀釋劑、填充劑、吸收促進劑、甜味劑或其組合。
  8. 如請求項1或2所述之組合物，其為一藥品、飼料、飲料、營養補充品、乳製品、食品或保健食品。
  9. 如請求項1或2所述之組合物，其形態為粉劑、錠劑、造粒、栓劑、微膠囊、安瓶、液劑噴劑或塞劑。
  10. 一種如請求項1至8中任一項之活性物質用於促進長壽之用途。
  11. 如請求項9所述之用途，其中該促進長壽係相對於未施予活性物質之受施者，施予活性物質之受施者的Cisd2基因表現量增加。
  12. 如請求項9所述之用途，其中該促進長壽係相對於未施予活性物質之受施者，施予活性物質之受施者的粒線體破損降低、粒線體破損延後發生。
  13. 如請求項9所述之用途，其中該促進長壽係相對於未施予活性物質之受施者，施予活性物質之受施者的神經退化、肌肉萎縮或其組合之老化延後發生。
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