TW202019449A - 發酵乳桿菌gkf3、含其之組合物及改善精神失調之用途 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種發酵乳桿菌GKF3、含其之組合物及其改善精神失調之用途，藉由提升腦組織中多巴胺及/或血清素的含量以改善精神失調。
Description
本發明關於一種用於改善精神失調的乳酸菌、含其之組合物及其用途；更明確地說，係關於一種包含發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum
）之組合物，並將該組合物施予一受施者，以用於提升腦組織中多巴胺及/或血清素之含量以改善精神失調。
精神失調
現代人課業、工作壓力大，使得越來越多人有焦慮問題，出現失眠、自律神經失調等症狀，引發專注力下降的問題，嚴重可能產生憂鬱問題。
多巴胺
多巴胺（dopamine）是一種刺激腦部動機、驅動力的腦內分泌物，能用來幫助細胞傳送脈衝，屬於神經傳導物質的一種，主要負責大腦的情慾、感覺，將興奮及開心的信息傳遞，也與上癮有關。多巴胺傳遞開心、興奮情緒的這功能，醫學上被用來治療抑鬱症。
多巴胺若不足或失調，則會令人缺乏動力、喪失活力、注意力不集中，或是失去控制肌肉的能力。更嚴重時會導致手腳不自主地顫動、乃至演變為帕金森氏症。但多巴胺若分泌過量，則會過度消耗體力和熱量因而導致早死。
血清素
血清素（Serotonin）的完整名稱為血清張力素，又稱5-羥色胺和血清胺，簡稱為5-HT，是一種單胺型神經遞質。血清素主要存在於動物的胃腸道、血小板和中樞神經系統中，在大腦中的含量為總量的2 %，有九成位於黏膜腸嗜鉻細胞和肌間神經叢，參與腸蠕動的調節。血清素給予人精神上的安定及平靜，控制人的情緒、壓力及專注力，普遍認為是幸福和快樂感覺的貢獻者。當血清素低落時，工作者容易焦慮不安、效率下降。
造成血清素減少的原因很多，包括壓力、缺乏睡眠、營養不良和缺乏鍛鍊等。在血清素含量降低到必需量以下時，就會出現注意力集中困難等問題，而會間接影響個人計劃和組織能力，故經常伴隨壓力和厭倦感。若血清素含量再進一步下降，還會引起抑鬱。其他和大腦血清素水平降低有關的症狀還包括易怒、焦慮、疲勞、慢性疼痛和焦躁不安等。若症狀惡化，最終還可能引起強迫症、慢性疲勞綜合症、關節炎、纖維肌痛和輕躁狂抑鬱症等疾病。
發酵乳桿菌
發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum
）是乳桿菌屬（Lactobacillus
）中的革蘭氏陽性菌種，常見於發酵動物和植物的材料中，最初是發現於酸麵團中。其中某些特定菌株被認定為動物的益生菌，且有幾種菌株被用於治療女性的泌尿生殖系統感染。
乳酸桿菌的應用
近年有少數文獻表明腸道微生物可能具有影響人的大腦發育、行為和情緒能力。有研究發現腸道微生物可藉由腦-腸軸線來影響老鼠的情緒，並引起其類焦慮（anxiety-like）或類憂慮（depression-like）的症狀（Fosterand McVey Neufeld, 2013）。也有研究顯示，以母子分離而引發類焦慮及類憂鬱行為的小鼠，若給予該小鼠植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum
），就會減少小鼠在強迫游泳試驗中的不動時間，並提高對糖水的偏好。此結果顯示植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum
）有助於改善小鼠的類憂鬱行為，且提升小鼠前額葉皮質中多巴胺總量及降低血清素代謝率（Liu et al., 2016）。其他實驗也發現將大鼠束縛21天以誘導憂鬱和焦慮行為後，給予瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus
）能改善大鼠的憂慮及焦慮問題（Liang et al., 2015）。然而，目前市場中仍有需求開發其他菌種以改善神經失調的相關疾病。
本發明提供一種發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum
）GKF3，該發酵乳桿菌GKF3以寄存編號BCRC910824寄存於財團法人食品工業發展研究所。
較佳地，該發酵乳桿菌GKF3具有耐酸、耐膽鹽及/或耐熱能力。
本發明為有效改善精神失調提供一種組合物，該組合物包含一發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum
）GKF3，其中該發酵乳桿菌GKF3以寄存編號BCRC910824寄存於財團法人食品工業發展研究所。
較佳地，該發酵乳桿菌GKF3係以下列方法製備： （a）取一發酵乳桿菌GKF3菌落（colony）接種於培養基進行固態培養，形成菌體； （b）將步驟（a）培養的菌體接種於液體培養基進行液態培養；及 （c）將步驟（b）培養的含菌體的液態培養基進行發酵培養，得到發酵全液。 較佳地，該方法進一步包含下列步驟： （d）將步驟（c）培養的發酵全液離心以獲得菌泥；及 （e）將步驟（d）所得的該菌泥進行冷凍乾燥。
較佳地，該步驟（b）的溫度為25至40℃、通氣量為0至1vvm氮氣或二氧化碳、轉速為250至1000rpm及/或培養時間16至24小時。
較佳地，該步驟（d）的菌泥與保護劑混合後再行冷凍乾燥。
較佳地，該步驟（e ）的冷凍乾燥的預凍溫度與時間為0至-20℃儲放1至4小時，接著-15至-40℃儲放4至8小時，最終冷凍於-196至-40℃超過8小時。
較佳地，該組合物包含一種以上選自下列群組的添加劑：賦型劑、防腐劑、稀釋劑、填充劑、吸收促進劑、甜味劑或其組合。
較佳地，該組合物為一藥品、飼料、飲料、營養補充品、乳製品、食品或保健食品。
較佳地，該組合物的形態為粉劑、錠劑、造粒、栓劑、微膠囊、安瓶、液劑噴劑或塞劑。
本發明經過實驗證實發酵乳桿菌GKF3可用於改善精神失調的用途。
較佳地，該改善精神失調係相對於未施予該發酵乳桿菌GKF3之受施者，施予該發酵乳桿菌GKF3之受施者的腦組織中的多巴胺含量提升。
較佳地，該改善精神失調係相對於未施予該發酵乳桿菌GKF3之受施者，施予該發酵乳桿菌GKF3之受施者的腦組織中的血清素含量提升。
較佳地，該精神失調的症狀包含失眠、自律神經失調、專注力下降、憂鬱症或其組合。
菌種來源
本實驗中所使用的乳酸菌是乳桿菌屬的發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum
）。在一較佳的實施態樣中，此菌種採集自台灣新竹北埔小販所販售的傳統醃製發酵泡菜。從天然發酵醃製30天以上的各種蔬果的泡菜產品中取樣，蒐集裝袋後標示，以冷藏箱低溫保存並於當天運送至實驗室進行菌株分離。
篩選培養
將檢體袋置於無菌操作台，以滅菌後的無菌吸管抽取濾液或蔬果葉片，再以檢體的十倍量無菌水進行鐵胃機均質處理。抽取1mL稀釋液放入含有0.1% 溴甲酚綠（bromocresol green）的MRS培養基中進行37℃、16小時的增菌培養，以增加檢品中內含的乳酸桿菌數量，強化篩選樣品中數量較少的乳酸菌菌株被分離的機率。取增菌培養後的樣品，進行序列稀釋操作。稀釋至十萬倍及一百萬倍的序列稀釋操作後，分別取出0.1 mL放到無菌培養皿中，在培養皿中分別放入Rogosa 培養基瓊脂、BIM-25 瓊脂、馬鈴薯澱粉+酵母萃取瓊脂、溴甲酚綠MRS 瓊脂及溴甲酚紫瓊脂。經過37℃、40 小時厭氧培養後，每種培養基各挑選單一菌落15至20個菌株。將分離後的單一菌株培養於MRS培養液中以特定溫度培養16小時後添加50 %菌種冷凍保存液（甘油）。以脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作為內毒素施予RAW 264.7細胞株的模式下誘導發炎反應，來測試分離所得的單一菌株對發炎反應的抑制效果，藉此篩選出得高效抑制RAW 264.7經LPS誘導所產生的一氧化氮、腫瘤壞死因子-α等發炎反應指標的菌株。將實驗中抑制率大於80%的高機能性菌株記錄，並凍藏於約-80 ℃冰箱中保存，以待後續實驗研究生理調節的機能性潛力。從所分離的高抗發炎活性菌株中，篩選具有色氨酸脱羧酶（Tryptophan decarboxylase）活性的菌株，以增加血清素前驅物色氨（Tryptamines）在生物體內的濃度，進而增加血清素酵素活性
基因型分析
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演化樹
為研究GKF3菌株在菌種演化上的獨特性，自食品工業發展研究所生物資源保存與研究中心購入L. fermentum
BCRC 10260、BCRC 12190、BCRC 12194、BCRC 14056、BCRC 23271，共五種菌株，將該等菌株與GKF3比較基因序列。將GKF3與該等購入的五種菌株活化，並在放大後抽取gDNA，分別以如下表1的引子對，在下述條件下進行聚合酶鏈反應：94℃反應3分鐘、94℃反應30秒、58℃反應30秒、72℃反應1分鐘10秒，以此 35 個循環，最後以72℃反應5分鐘。 表1：rec
N於聚合酶鏈反應的引子對 
將反應完成之樣品送件定序，取得GKF3（SEQ ID NO：03）與該等購入的五種菌株的共6種菌株的recN
序列，以MEGA X軟體之Neighbor-Joining模式繪製演化樹，比對結果顯示於圖1。在recN
基因之演化樹中，GKF3在演化樹中的位置可與其他菌株區隔，而自成一線。此結果說明GKF3從基因上的差異性來看，與現有乳酸桿菌品系間存在明顯的差異，而為一新穎的乳酸桿菌菌株。確認GKF3為新穎菌種後，於2018年2月12日以「發酵乳桿菌Lactobacillus fermentum
GKF3」的名稱，在寄存於食品工業發展研究所完成寄存並取得寄存編號BCRC 910824，且於2018年3月1日確認該菌株存活。
表現型分析
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耐酸試驗
將GKF3及從食品工業發展研究所生物資源保存與研究中心購入的BCRC23271、BCRC12190、BCRC12194與BCRC10360，共5種菌株活化。原始MRS液態培養基的酸鹼值為pH 6.5，藉由添加HCl至MRS液態培養基中，調整該培養基的酸鹼度為pH 3.2、pH 2.4、pH 2.0的3種不同酸鹼度。將菌株接種在不同酸鹼值的培養基中，於37℃下培養3小時後，計數菌落形成數目。
結果如表2與圖2所示，於原始約pH 6.5的培養下，GKF3與其他4種菌株的菌數皆可達到10次方。於酸鹼值為pH 3.2時，全部菌株的菌數略為下降，GKF3與其他4種菌株相較未出現顯著差異。當酸鹼值下降至pH 2.4跟pH 2.0時，BCRC23271、BCRC12194與BCRC10360的菌數下降至約4次方，顯著低於菌數維持於5次方的GKF3（P ＜0.05）。據此，在酸性環境下GKF3的活菌數顯著多於他種菌株，此實驗結果說明GKF3的耐酸能力相較於其他菌株更好，故GKF3通過胃部時抵禦胃酸的能力更佳。 表2：GKF3與其他品系菌株的耐酸試驗的菌落數目 
數值以平均值±標準差呈現，n=3，單位CFU/g *與GKF3組（pH 2.4）相比有顯著差異（P＜0.05） #與GKF3組（pH 2.0）相比有顯著差異（P＜0.05）
表現型分析
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耐膽鹽
試驗
將GKF3、從食品工業發展研究所生物資源保存與研究中心購入的BCRC 23271、BCRC12190、BCRC12194與BCRC10360共5種菌株活化。將該等菌種接種於含0.3%膽鹽的MRS液態培養基中，於37℃下浸泡半小時後，計數菌落形成數目。
結果如表3與圖3所示，於原始MRS液態培養基培養下，GKF3與其他4種菌株的菌數皆可達到9x109
cfu/ml。在添加有0.3%膽鹽的MRS中，除GKF3以外的菌種，其菌種的菌數下降至約7次方，在統計上皆比GKF3的8次方低（P ＜0.05）。據此，在膽鹽環境下GKF3的活菌數顯著多於他種菌株，此實驗結果說明GKF3的耐膽鹽能力相較於其他菌株更好，故GKF3通過體內消化道時抵禦膽鹽的能力更佳。 表3：GKF3與其他品系菌株的耐膽鹽試驗的菌落數目 
數值以平均值±標準差呈現，n=3，單位CFU/g *與GKF3組（MRS+0.3%膽鹽）相比有顯著差異（P＜0.05）
表現型分析
-
耐熱試驗
比較GKF3相對於其他菌種的耐熱能力。將GKF3、從食品工業發展研究所生物資源保存與研究中心購入的BCRC23271、BCRC12190、BCRC12194與BCRC10360共5種菌株活化。將該等菌種於水浴鍋中分別於70℃加熱5、10與15分鐘後，觀察並計數菌數。
結果如表4與圖4所示，於未加熱情況下（0分鐘），GKF3與其他4種菌株的菌數皆可達到9x109
cfu/ml。在70 ℃下加熱5分鐘後，全部菌株的菌數皆下降至6次方。當70 ℃加熱15分鐘後，BCRC 23271、BCRC 12190、BCRC 12194與BCRC 10360菌數陡降至約4次方，都顯著低於菌數維持於5次方的GKF3（P ＜0.05）。據此，得知在高溫環境下GKF3的活菌數顯著多於他種菌株，說明GKF3的耐熱較好，菌株於環境中安定性更佳。 表4：GKF3與其他品系菌株的耐熱試驗的菌落數目 
數值以平均值±標準差呈現，n=3，單位CFU/g *與GKF3組（10 min）相比有顯著差異（P＜0.05） #與GKF3組（15 min）相比有顯著差異（P＜0.05）
菌種培養
勾取上述發酵乳桿菌GKF3的菌落（colony）接種於固態培養基上活化菌種。在一較佳的實施態樣中，該固態培養基為MRS 瓊脂。待菌體生長完成後，將新鮮的菌體連同固態培養基接入於含有液態培養基的錐形瓶中進行液態培養。在一較佳的實施態樣中，於溫度25至40 ℃下、通氣量0至1 vvm氮氣或二氧化碳、速率250至1000 rpm的條件下液態培養。在一較佳的實施態樣中，液態培養的時間為16至24小時，更佳為18小時活菌數可達到最高點。在一較佳的實施態樣中，液態培養基為MRS液態培養基。在一較佳的實施態樣中，液態培養基的配方如下表5所示。液態培養完成後進行發酵培養。
表5 
凍乾粉的製備
將發酵乳桿菌GKF3經發酵培養而完成生長後，收集包含菌體與培養液的發酵全液進行離心以獲得菌泥。在一較佳的實施態樣中，發酵全液投入15重量%脫脂乳粉靜置1至4小時始菌體凝集成團狀增加回收率，再以速率1000至15000 rpm進行離心。離心後所得的菌泥與作為保護劑的6至50 重量%脫脂奶粉混合後冷凍乾燥。最後，將冷凍乾燥後所得的凍乾粉置於低溫保存。在一較佳的實施態樣中，冷凍乾燥的預凍溫度設定為梯度設定，依序為0至 -20 ℃儲放1至4小時，接著-15至-40 ℃儲放4至8小時，最終冷凍於-196至-40 ℃超過8小時。在一較佳的實施態樣中，冷凍乾燥溫度與時間為-5 ℃約2小時，接著-20 ℃約6小時，最後-50 ℃約16小時。在一較佳的實施態樣中，低溫保存的溫度為-30至0℃。保存的凍乾粉作為以下動物實驗中所要施予動物的餵食樣品的原料。本案所請的發酵乳桿菌GKF3使用時的態樣，包括，但不限於前述凍乾粉、前述含有菌體與培養液的發酵全液以及發酵全液離心後的菌泥。
實驗動物
試驗動物為ICR雄鼠30隻，每隻體重約20至25公克，購自BioLASCO（樂斯科生物科技）。小鼠飼養在常規籠中，室溫維持於23 ± 2 ℃，濕度50 ± 5 %，定時12小時光照與黑暗，飼料及無菌逆滲透水均任由小鼠自由取食。在研究之前使小鼠適應實驗室環境一周。所有動物實驗程序皆由弘光科技大學實驗動物照護及使用委員會進行審查並核准。
試驗動物餵食正常成鼠飼料和飲用蒸餾水適應環境1週後，將其隨機分為每組6隻，組別有對照組與實驗組A至D，共5組。
實驗流程
實驗組A至D的小鼠，依下表6將不同菌種的凍乾粉回溶於食鹽水中，以此每天餵食一次各實驗組A至D的小鼠，對照組則給予同體積的0.9 %食鹽水，達四週。餵食採小鼠管灌，不鏽鋼餵食針平時浸泡在75 %酒精溶液中，使用前再以0.9 %生理食鹽水清洗潤濕，以1 ml無菌塑膠針筒套上不鏽鋼餵食針餵食。
表6 
灌食劑量的計算依據實驗動物與人體表面積比的等效劑量換算係數，其中小鼠與人的換算係數為12.3。小鼠每周秤量體重一次，每組計算出平均體重後，小鼠體重以25公克計算。提供之樣品成人（以體重60公斤計算）每日服用劑量為1000 mg（約為每人每日1000億個活菌數），加以換算每天管灌小鼠之劑量，公式如下所示： 小鼠每日餵食產品劑量（g）＝ {成人劑量/60公斤（成人體重）}×小鼠體重（公斤）× 12.3 （小鼠與人的換算係數）
經上述公式計算出實驗組餵食劑量為5.125mg。
實驗的第15天開始，各組別小鼠每天接受禁錮誘導，共14天。將各組小鼠每天一次放置於通風良好的透明限制器中（100×40 mm）禁錮，一次達2小時。4週實驗結束後，小鼠以二氧化碳（CO2
）麻醉後犧牲，將血液收集至EDTA管中，於4 ℃離心，保存於-80 ℃。快速去除小鼠總海馬體，以低溫食鹽水均質後，於4 ℃下離心10分鐘（13000 ×g），收集上清液，保存於-80 ℃以待後續生化評估。
多巴胺含量測定
以商業分析ELISA套組（Novus Biologicals, Littleton, CO, USA）測定大腦中多巴胺（dopamine）含量。
各組別小鼠腦組織中多巴胺濃度結果如圖5所示。受禁錮誘導的小鼠的腦組織中多巴胺濃度明顯較低，試驗期間若同時給予發酵乳桿菌GKF3（組別C），可顯著增加小鼠腦組織中的多巴胺濃度（p＜ 0.05）。相比其他株乳酸菌，例如植物乳桿菌BCRC-910787、發酵乳桿菌BCRC-23271、嗜酸乳桿菌BCRC-14064，發酵乳桿菌GKF3提升多巴胺的效果皆更為顯著。
血清素含量測定
以商業分析ELISA套組（Novus Biologicals, Littleton, CO, USA）測定大腦中血清素（5-HT）含量。各組別小鼠腦組織中血清素濃度結果如圖6所示。受禁錮誘導的小鼠的腦組織中血清素濃度也明顯較低，試驗期間若同時給予發酵乳桿菌GKF3（組別C），小鼠腦組織中的血清素濃度明顯增加（p＜ 0.05）。相比其他株乳酸菌，例如植物乳桿菌BCRC-910787、發酵乳桿菌BCRC-23271、嗜酸乳桿菌BCRC-14064，發酵乳桿菌GKF3提升血清素的效果皆更為顯著。
數據統計分析
實驗結果以 Means ± SD 表示，並利用SPSS （12版） 商用統計軟體進行分析；以one-way ANOVA 比較各組 Mean 值的差異性，再以 Duncan’s multiple comparison 進行事後檢定，當p＜0.05時，即表示具有統計上的顯著差異性。
綜合上述結果，發酵乳桿菌GKF3能有效提升受禁錮誘導的小鼠腦中的多巴胺及血清素濃度，降低壓力造成的相關精神失調發生的風險。
本發明提供一組合物，包含有發酵乳桿菌GKF3，該組合物具有改善精神失調的功效。
視情況，該組合物可進一步包含添加劑。在一較佳的實施態樣中，該添加劑可為賦型劑、防腐劑、稀釋劑、填充劑、吸收促進劑、甜味劑、或其組合。該賦型劑可選自檸檬酸鈉、碳酸鈣、磷酸鈣、蔗糖或其組合。該防腐劑可延長組合物的儲藏期限，例如苯甲醇、對羥基苯甲酸（parabens）。該稀釋劑可選自水、乙醇、丙二醇、甘油或其組合。該填充劑可選自乳糖、牛乳糖、高分子量舉乙二醇或其組合。該吸收促進劑可選自二甲基亞碸（DMSO）、月桂氮卓酮、丙二醇、甘油、聚乙二醇或其組合。該甜味劑可選自安塞甜（Acesulfame K）、阿斯巴甜（aspartame）、糖精（saccharin）、三氯蔗糖／蔗糖素（sucralose）、紐甜（neotame）或其組合。除上述所列舉的添加劑以外，在不影響發酵乳桿菌GKF3的效果前提下，可依需求選用適合的其他添加劑。
該組合物可依市場需求開發為不同商品。在一較佳實施態樣中，該組合物為一藥品、飼料、飲料、營養補充品、乳製品、食品或保健食品。
該組合物可根據受施予者之需要，而採用不同形態。在一較佳實施態樣中，該組合物的形態為粉劑、錠劑、造粒、栓劑、微膠囊、安瓶（ampoule/ampule）、液劑噴劑或塞劑。
本發明的組合物可使用於動物或是人類。在不影響發酵乳桿菌GKF3發揮效果的前提下，包含乳酸菌的組合物可製為任何藥物型態，並根據藥物型態以適用的途徑施予該動物或人類。
組合物製備
本發明之GKF3若應用於食品用途，則以下組合物1之態樣作為例示性實例。
組合物1：取GKF3的凍乾粉（20 wt%），與作為防腐劑之苯甲醇（8wt%）、作為稀釋劑之甘油（7 wt%）充分混合，並溶於純水（65 wt%）中，存放於4 ℃備用。前述wt%係指各成分佔組合物總重之比例。
本發明之GKF3若以液體劑型應用於醫藥用途，則以下組合物2之態樣作為例示性實例。
組合物2：取GKF3的凍乾粉（20 wt%），與作為防腐劑之苯甲醇（8wt%）、作為稀釋劑之甘油（7 wt%）、作為稀釋劑之蔗糖（10 wt%）充分混合，並溶於純水（55 wt%）中，存放於4 ℃備用。前述wt%係指各成分佔組合物總重之比例。
無
圖1顯示發酵乳桿菌GKF3與其他品系菌株的recN
基因的演化樹。
圖2顯示發酵乳桿菌GKF3與其他品系菌株的耐酸試驗的菌落數目。
圖3顯示發酵乳桿菌GKF3與其他品系菌株的耐膽鹽試驗的菌落數目。
圖4顯示發酵乳桿菌GKF3與其他品系菌株的耐熱試驗的菌落數目。
圖5顯示小鼠腦組織中的多巴胺含量。
圖6顯示小鼠腦組織中的血清素含量。
發酵乳桿菌GKF3：BCRC910824
Claims (15)
- 一種發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum ）GKF3，該發酵乳桿菌GKF3以寄存編號BCRC910824寄存於財團法人食品工業發展研究所。
- 如請求項1所述之發酵乳桿菌GKF3，其具有耐酸、耐膽鹽及/或耐熱能力。
- 一種改善精神失調的組合物，其包含一發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum ）GKF3，其中該發酵乳桿菌GKF3以寄存編號BCRC910824寄存於財團法人食品工業發展研究所。
- 如請求項3所述之組合物，其中該發酵乳桿菌GKF3以下列方法製備： （a）取一發酵乳桿菌GKF3菌落（colony）接種於培養基進行固態培養，形成菌體； （b）將步驟（a）培養的菌體接種於液體培養基進行液態培養；及 （c）將步驟（b）培養的含菌體的液態培養基進行發酵培養，得到發酵全液。
- 如請求項4所述之組合物，其中該方法進一步包含下列步驟： （d）將步驟（c）培養的發酵全液離心以獲得菌泥；及 （e）將步驟（d）所得的該菌泥進行冷凍乾燥。
- 如請求項4所述之組合物，其中該步驟（b）的溫度為25至40 ℃、通氣量為0至1 vvm氮氣或二氧化碳、轉速為250至1000 rpm及/或培養時間16至24小時。
- 如請求項5所述之組合物，其中該步驟（d）的菌泥與保護劑混合後再行冷凍乾燥。
- 如請求項5所述之組合物，其中該步驟（e）的冷凍乾燥的預凍溫度與時間為0至-20 ℃儲放1至4小時，接著-15至-40 ℃儲放4至8小時，最終冷凍於-196至-40 ℃超過8小時。
- 如請求項3至8中任一項所述之組合物，其包含一種以上選自下列群組的添加劑：賦型劑、防腐劑、稀釋劑、填充劑、吸收促進劑、甜味劑或其組合。
- 如請求項3至8中任一項所述之組合物，其為一藥品、飼料、飲料、營養補充品、乳製品、食品或保健食品。
- 如請求項3至8中任一項所述之組合物，其形態為粉劑、錠劑、造粒、栓劑、微膠囊、安瓶、液劑噴劑或塞劑。
- 一種如請求項3至11中任一項之組合物用於改善精神失調的用途。
- 如請求項12所述之用途，其中該改善精神失調係相對於未施予該發酵乳桿菌GKF3之受施者，施予該發酵乳桿菌GKF3之受施者的腦組織中的多巴胺含量提升。
- 如請求項12所述之用途，其中該改善精神失調係相對於未施予該發酵乳桿菌GKF3之受施者，施予該發酵乳桿菌GKF3之受施者的腦組織中的血清素含量提升。
- 如請求項12至14中任一項所述之用途，其中該精神失調的症狀包含失眠、自律神經失調、專注力下降、憂鬱症或其組合。
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