TW201917206A - 一種胚芽乳酸桿菌、組合物、培養方法及降尿酸、改善過敏及／或降血糖的用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種具有特定基因序列的胚芽乳酸桿菌GKM3，其具有耐酸、耐鹼及/或細胞吸附能力，且能達到排除體脂肪、降血脂、降低肝腫大、降低肝功能指數、抗發炎、降尿酸、改善過敏的效果及/或降血糖。據此，本發明提供一種新型的胚芽乳酸桿菌，更開發出該胚芽乳酸桿菌的醫藥應用，以作為領域中預防及/或治療肥胖所引起的相關疾病的替代性選擇。

Description

一種胚芽乳酸桿菌、組合物、培養方法及降尿酸、改善過敏及/或 降血糖的用途
本發明關於一種胚芽乳酸桿菌、含其之組合物、培養方法及其用途；更明確地來說，係關於一種包含pheS基因、recN基因與質體的胚芽乳酸桿菌菌種，其藉由排除體脂肪、降血脂、降低肝腫大、降低肝功能指數、抗發炎、降尿酸、改善過敏及/或降血糖，以用於預防及/或治療肥胖相關疾病的用途。
肥胖
隨著生活型態的轉變，特別是飲食習慣的改變，導致肥胖率增加，使肥胖在現代化國家成為一嚴重的健康問題。世界衛生組織(World health organization,WHO)更將肥胖列為二十一世紀最重要之公共衛生及預防醫學之重要課題。根據WHO對肥胖的定義，是以BMI(Body mass index)作為標準，BMI大於30kg/m2為肥胖，BMI值在25~29.9kg/m2為過重(WHO,1998)。
造成肥胖的原因主要是長期熱量的攝取大於消耗，導致脂肪於身體中堆積，因而形成肥胖。肥胖之形成可分原發性與自發性，其中原發性肥胖為飲食與運動等環境因素所造成；自發性則為遺傳或疾病所引起(洪，1992)。細胞生物學所定義的 肥胖，是由於脂肪組織中前脂肪細胞分化成脂肪細胞之數目與大小增加所致(Furuyashiki et al.,2004)。脂肪組織可以分泌多種物質，包括激素、生長因子、酶、細胞因子、補體與基質蛋白等，其主要作用為調節代謝、生殖、免疫、血壓與血管新生等(Youn et al.,2004)。據此，肥胖會誘發全身多種面向的疾病。
肝腫大
高油高脂的飲食習慣造成肥胖，連帶導致肝臟細胞囤積過量脂肪顆粒，當脂肪囤積超過肝重量的5%時即為脂肪肝，而產生肝腫大等症狀。造成肝腫大常見的原因有病毒性肝炎、肝硬化、中毒性與藥物性肝炎、淤血、代謝異常所導致的脂肪肝、腫瘤或白血病等。
肝功能指數
與肝指數GOT與GPT測量的指標分別是天門冬胺酸轉胺酶(Aspartate Aminotransferase，AST)與丙胺酸轉胺酶(Alanine Aminotransferase，ALT)，此為肝細胞製造的兩種最多的酵素。當肝臟發炎時，肝細胞會壞死，AST、ALT就會進入血液中，造成肝指數GOT與GPT升高，因此醫療上常以此作為肝臟發炎或受損程度的評估。肝指數過高的原因可能來自不同因素，例如病毒引起的肝炎、藥物性肝炎、猛爆性肝炎、肝化膿、肝癌、血壓降低、急性心肌梗塞、甲狀腺機能亢進，肥胖所引起的脂肪肝亦為原因之一。
血脂
血液中的脂肪主要分為兩類，即膽固醇及三酸甘油脂，而根據其與蛋白質的比例又再細分為乳糜微粒(CM)、極低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)及高密度脂蛋白(HDL) 若血液中好的膽固醇過少或是壞的膽固醇過高，即稱為高血脂。高血脂成因主要可以分為原發性或次發性，原發性高血脂為家族遺傳，次發性則是內分泌疾病如糖尿病、甲狀腺機能低下，或肝腎疾病、生活習慣、藥物等原因所造成。高血脂會使膽固醇在血管中累積，而形成粥狀動脈硬化，導致血液流動不佳，引發心肌梗塞、中風、周邊動脈堵塞等症狀。
酮體
酮體包含丙酮、乙醯乙酸和β-羥丁酸三種化合物。當身體飢餓、禁食或某些病理狀態(如糖尿病)下，脂肪代謝增加，大量的脂肪酸被肝細胞吸收及氧化，而此同時為了維持血糖濃度的穩定，體內的糖異生也會被激活，進而生成酮體。
尿酸
攝取的食物中所含的嘌呤，經分解後即生成尿酸。尿酸經由腎臟排泄或腸道排遺來排出體外。當體內生成的尿酸過多或腎臟功能有障礙，尿酸無法順利排出體外，使得尿酸在血液中的含量過高，稱為高尿酸血症。進而導致血液中的尿酸在關節或組織中積存，而引起腫脹變形，即痛風。引發高尿酸血症的原因很多，分為原發性與繼發性兩類，其中原發性的病因舉例如遺傳、不當的高嘌呤飲食習慣、藥物、酒精等，而脂肪分解所產生酮體則會抑制尿酸排出，因此肥胖者可能出現尿酸過高的症狀，進而演進成相關疾病。
發炎與過敏
當生物組織受到外在病毒感染的刺激後，即會引過敏反應，釋放出發炎物質，連帶引起發炎反應。腫瘤壞死因子(TNF-α)主要由巨嗜細胞產生，是一種涉及到系統性炎症的細胞因子，同時也是屬於引起急性免疫反應的細胞因子的一員，其作用是 調節免疫細胞的功能，作為一種內源性致熱原能夠促使身體發熱並引起細胞凋亡，以阻止腫瘤發生和病毒複製。TNF-α的失調被認為與許多人類疾病有關，近來亦有研究指出，飲食所誘導的肥胖會促使過敏反應中扮演重要角色的巨噬細胞累積於脂肪組織中，造成脂肪組織發炎。
當支氣管對於刺激產生過度反應，演變為呼吸道持續性的慢性發炎反應，即稱為氣喘。支氣管有過敏反應時，會分泌過多的發炎物質導致黏液的分泌增加，進而阻塞氣道、造成呼吸道狹窄，導致呼吸阻力增加，因而出現喘氣困難、呼吸困難、鳴喘聲、胸悶和咳嗽等症狀。
血糖
血糖即血液中的葡萄糖，是由食物消化後由小腸進入血液中，具有恆定性，通常維持在900毫克/升(5mmol/L)，正常範圍是4-6mmol/L。血糖會於進食一到兩個小時後升高，並在早晨降到最低。血糖濃度失調，如持續性的高血糖或低血糖都會導致多種疾病，其中最顯著的疾病就是糖尿病。
乳酸桿菌
乳酸桿菌(Lactobacillus spp.)存在於一般環境中，其能將碳水化合物發酵成乳酸，因此多應用於發酵食品的製造。此菌對於人體健康具有多重益處，具有幫助消化、改善腸臟健康的功效。縱使同為乳酸桿菌屬，若為不同種、或甚至是同種但不同菌株也具有不一樣的特徵，對人體亦會有不同的影響。舉例來說，植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)已被研究出具有改善人體健康之功效，如L.plantarum PH04具降低血中膽固醇能力；L.plantarum 299V可減輕IL-10缺乏型小鼠而之結腸炎症狀；L.plantarum 10hk2可提高前發炎介質，如IL-1β、IL-6 和TNF-α，及抗發炎介白素-10(IL-10)，達到抗發炎效果；L.plantarum K21具有降低血中膽固醇、三酸甘油脂含量，以及具有抗發炎之功效。
然而，由於如前所提及的由肥胖導致的症狀及疾病可以得知，肥胖全面性地改變生理環境，引起的是身體在多種不同面向上的病變。因此，具有單一功效的菌株無法滿足由肥胖引起的多種症狀的緩解需求，在預防及/或治療的醫藥領域中仍有發展具複合性功效的菌株的必要，以更有效地同時針對肥胖相關的病症達到改善的效果。
本發明的其中一個目的在於提供一種胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)，其包含一具序列SEQ ID No：2的pheS基因及一具序列SEQ ID No：3的recN基因。
較佳地，該胚芽乳酸桿菌進一步包含有具序列SEQ ID No：1的質體。
較佳地，該胚芽乳酸桿菌寄存於財團法人食品工業發展研究所，其寄存編號為BCRC 910787。
較佳地，該胚芽乳酸桿菌具有耐酸、耐鹼及/或細胞吸附能力。
較佳地，該胚芽乳酸桿菌具有排除體脂肪、降低肝腫大及/或抗發炎的效果。
較佳地，該胚芽乳酸桿菌具有降尿酸、改善過敏及/或降血糖的效果。
較佳地，該胚芽乳酸桿菌具有降血脂、降低肝功能指數、 降尿酸及/或抗發炎的效果。
本發明的另一個目的在於提供一種組合物，其包含如上所述之胚芽乳酸桿菌，藉此提升該胚芽乳酸桿菌的應用價值。
較佳地，該組合物中的該胚芽乳酸桿菌寄存於財團法人食品工業發展研究所，其寄存編號為BCRC 910787。
較佳地，該組合物包含一種選自下列群組的添加劑：賦型劑、防腐劑、稀釋劑、填充劑、吸收促進劑、甜味劑或其組合。
較佳地，該組合物為一藥品、飼料、飲料、營養補充品、乳製品、食品或保健食品。
較佳地，該組合物的型態為粉劑、錠劑、造粒、栓劑、微膠囊、安瓶、液劑噴劑或塞劑。
較佳地，該組合物具有排除體脂肪、降低肝腫大及/或抗發炎的效果。
較佳地，該組合物具有降尿酸、改善過敏及/或降血糖的效果。
較佳地，該組合物具有降血脂、降低肝功能指數、降尿酸及/或抗發炎的效果。
為了達到前述目的，本發明提供一種培養一胚芽乳酸桿菌的方法，其包含將寄存編號為BCRC 910787的胚芽乳酸桿菌培養於一培養基；其中該培養基包含蔗糖、酵母萃取物或其組合，且該蔗糖或酵母萃取物的添加比例相對於該培養基總重量為1wt%至10wt%。
較佳地，該方法中的該胚芽乳酸桿菌係於轉速為5至50rpm的條件下培養。
較佳地，該方法中的該胚芽乳酸桿菌該溫度為32℃至42 ℃的條件下培養。
本發明還有一個目的為開發該胚芽乳酸桿菌的醫藥用途，以提升該胚芽乳酸桿菌的醫藥上價值。
本發明的其中一個目的為提供一種胚芽乳酸桿菌的用途，其用於製備降低脂肪量、降低肝腫大及/或抗發炎的醫藥組合物，其中該胚芽乳酸桿菌的寄存編號為BCRC 910787。
較佳地，於該用途中的該降低脂肪量為降低內臟脂肪量、皮下脂肪量或總脂肪量。
較佳地，於該用途中的該降低脂肪量為降低肝臟脂質量。
較佳地，於該用途中的該降低脂肪量係透過增加脂肪的排出量。
較佳地，於該用途中的降低肝腫大為降低肝重量。
較佳地，於該用途中的抗發炎為降低肝臟中發炎物質TNF-α的含量。
本發明的其中一個目的為提供一種胚芽乳酸桿菌菌株的用途，其用於製備降尿酸、改善過敏及/或降血糖的醫藥組合物，其中該胚芽乳酸桿菌的寄存編號為BCRC 910787。
較佳地，於該用途中的降尿酸為降低血清中尿酸的含量。
較佳地，於該用途中的改善過敏為降低呼吸道阻力。
較佳地，於該用途中的降血糖為降低因營養補給所導致的血糖上升量
本發明的其中一個目的為一種胚芽乳酸桿菌菌株的用途，其用於製備改善血脂、降低肝功能指數、降尿酸及/或抗發炎的醫藥組合物，其中該胚芽乳酸桿菌的寄存編號為BCRC 910787。
較佳地，於該用途中的改善血脂為降低三酸甘油脂、降低總膽固醇、提升高密度脂蛋白膽固醇或降低酮體。
較佳地，於該用途中的改善肝功能指數為降低血清中丙胺酸轉銨酶(ALT)或天門冬胺酸轉銨酶(AST)的含量。
第一圖顯示乳酸桿菌(L.Plantarum)GKM3與其他品系的pheS基因的演化樹。
第二圖顯示乳酸桿菌(L.Plantarum)GKM3與其他品系的recN基因的演化樹。
第三圖顯示乳酸桿菌(L.Plantarum)GKM3與其他品系菌種耐酸能力。
第四圖顯示乳酸桿菌(L.Plantarum)GKM3與其他品系菌種耐膽鹽能力。
第五圖顯示乳酸桿菌(L.Plantarum)GKM3與其他品系菌種腸道吸附的能力。
第六圖顯示正常飲食的對照組(ND)、高脂飲食組(HFD)與高脂飲食組給予乳酸桿菌GKM3組(HFD+ GKM3)的初始體重、最終體重與體重變化量。
第七圖顯示正常飲食的對照組(ND)、高脂飲食組(HFD)與高脂飲食組給予乳酸桿菌GKM3組(HFD+ GKM3)的大鼠肝臟重量。
第八圖顯示正常飲食的對照組(ND)、高脂飲食組(HFD)與高脂飲食組給予乳酸桿菌GKM3組(HFD+ GKM3)的大鼠，其不同部位(腎周圍、副睪、腸系膜、腹膜外與腹股溝)的脂 肪組織的重量相對於大鼠體重的脂肪量。
第九圖顯示正常飲食的對照組(ND)、高脂飲食組(HFD)與高脂飲食組給予乳酸桿菌GKM3組(HFD+ GKM3)的大鼠，其不同類型脂肪組織(總體脂、內臟脂肪組織與皮下脂肪組織)相對於大鼠體重的脂肪量。
第十圖顯示正常飲食的對照組(ND)、高脂飲食組(HFD)與高脂飲食組給予乳酸桿菌GKM3組(HFD+ GKM3)的大鼠，其肝臟的總脂質、三酸甘油脂與膽固醇的含量。
第十一圖顯示正常飲食的對照組(ND)、高脂飲食組(HFD)與高脂飲食組給予乳酸桿菌GKM3組(HFD+ GKM3)的大鼠，其肝臟的TNF-α的含量。
第十二圖顯示正常飲食的對照組(ND)、高脂飲食組(HFD)與高脂飲食組給予乳酸桿菌GKM3組(HFD+ GKM3)的大鼠，其血清中AST與ALT的含量。
第十三圖顯示正常飲食的對照組(ND)、高脂飲食組(HFD)與高脂飲食組給予乳酸桿菌GKM3組(HFD+ GKM3)的大鼠，其血清中三酸甘油脂、膽固醇與高密度脂蛋白膽固醇的含量。
第十四圖顯示正常飲食的對照組(ND)、高脂飲食組(HFD)與高脂飲食組給予乳酸桿菌GKM3組(HFD+ GKM3)的大鼠，其血清中酮體的含量。
第十五圖顯示正常飲食的對照組(ND)、高脂飲食組(HFD)與高脂飲食組給予乳酸桿菌GKM3組(HFD+ GKM3)的大鼠，其血清中尿酸的含量。
第十六圖顯示正常飲食的對照組(ND)、高脂飲食組(HFD)與高脂飲食組給予乳酸桿菌GKM3組(HFD+ GKM3)的大鼠，其乾燥糞便中脂質的含量。
第十七圖顯示正對照組、負對照組、GKM3低劑量組與GKM3高劑量組的大鼠，其於不同濃度乙醯甲膽鹼 (methacholine)的刺激下的呼吸道阻力。
第十八圖顯示對照組與GKM3組的小鼠口服葡萄糖耐受性試驗於0、30、60與120分鐘的血糖值。
第十九圖顯示對照組與GKM3組的小鼠口服葡萄糖耐受性試驗於120分鐘血糖曲線下的面積。
第二十圖顯示對照組與GKM3組的小鼠口服葡萄糖耐受性試驗於0、30、60與120分鐘的血糖上升值。
第二十一圖顯示對照組與GKM3組的小鼠口服葡萄糖耐受性試驗於120分鐘血糖上升曲線下的面積。
本文中所述「排除體脂肪」係指使一個體透過排遺系統排出個體體內的脂肪，其中該各體體內不限制於特定部位，例如血液或臟器等，該脂肪也不限定於特定的種類，例如三酸甘油脂或膽固醇。
本文中所述「降低肝腫大」係使一個體的肝臟重量減少。在較佳的一個具體態樣中，係指因脂肪囤積所導致上升的肝臟重量，藉由施予特定的醫藥組合物而下降。
本文中所述「抗發炎」係指緩解發炎反應，具體來說係降低一或多種發炎反應的指標，例如降低血清中引起或加強發炎反應的細胞因子或介質的含量、減少發炎相關細胞對於激素或介質的分泌。在較佳的一個具體態樣中，係指降低肝臟中腫瘤壞死因子(TNF-α)的含量。
本文中所述「降尿酸」係使一個體體內的尿酸減少，具體來說係指降低血液中尿酸的含量。在較佳的一個具體態樣中，係指因高脂飲食所導致血液中上升的尿酸，藉由施予特定的醫藥組合物而下降。
本文中所述「改善過敏」係指緩解過敏症狀，具體來說係指降低一種或多種過敏反應的指標，例如降低血清中的抗體含量、減少過敏反應相關細胞對於激素或介質的分泌。在較佳的一個具體態樣中，係指降低呼吸道阻力。
本文中所述「降血脂」係指使一個體血液中的脂肪減少。在較佳的一個具體態樣中，係指減少血清中的三酸甘油脂、總膽固醇或高密度脂蛋白膽固醇。
本文中所述「降低肝功能指數」係指使一個體血清中的天門冬胺酸轉胺酶(Aspartate Aminotransferase，AST)與丙胺酸轉胺酶(Alanine Aminotransferase，ALT)的含量降低。在較佳的一個具體態樣中，係指因高脂飲食所導致血液中上升的AST與ALT，藉由施予特定的醫藥組合物而下降。
本發明從醃製有機蔬果的發酵液中，經過分離與純化取得一菌種，命名為GKM3。GKM3經全基因定序取得GKM3的全長基因序列，並得知GKM3包含一質體。將該GKM3的全長基因序列於資料庫中比對，鑑定為胚芽乳酸桿菌。接著，以GKM3的pheS與recN序列，與其他購入菌種的基因或資料庫中他種菌種的基因序列比對以繪製演化樹，從序列的差異度發現GKM3與他種菌種在演化關係上相差甚遠，確認GKM3為一新穎的胚芽乳酸桿菌菌種。
確認GKM3為新穎菌種後，將此菌株於2017年7月14日以「植物乳桿菌Lactobacillus plantarum GKM3」的名稱，完成寄存於食品工業發展研究所，取得寄存編號BCRC 910787，並於2017年7月26日完成確認該菌株存活。
GKM3由於為一新穎的菌種，因此亦對於此菌種的培養條件進行研究，並於本發明中提供一種針對GKM3特別適用的培 養方法。對於選用培養該菌種的培養基，可從碳源與氮源來考量。可選擇的碳源舉例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、甘露糖、山梨糖醇、甘油、糖蜜或其組合。在一個較佳的態樣中，碳源為蔗糖。可選擇的氮源舉例如大豆蛋白、酵母抽出物、牛肉萃取物、酪蛋白粉、乳清蛋白粉、魚蛋白水解物、植物萃取蛋白或其組合。在一個較佳的態樣中，氮源為酵母抽出物。碳源或氮源相對於培養基總重量的添加比例對於培養成效亦會有影響，各別為1至10wt%。在一個較佳的態樣中，碳源或氮源相對於培養基總重量，各別的添加比例為3至7wt%。在一較佳實施態樣中，培養基包含蔗糖、酵母萃取物或其組合，且該蔗糖或該酵母萃取物的添加比例相對於培養基總重量為1wt%至10wt%。
培養條件除培養基的成份以外，尚有培養溫度與轉速需要設定。培養溫度可設定於32℃至42℃。在一個較佳的態樣中，培養溫度為35℃至40℃，更佳為37℃。轉速可設定於5至50rpm。在一個較佳的態樣中，轉速為10至35rpm，更佳為20rpm。
在於特定條件下可以順利量產GKM3後，針對其菌種特性進行研究。已知乳酸桿菌要於動物體內有效地發揮功效，需要對動物體的消化系統中腸胃道所分泌的胃酸或膽鹼具有耐受性，始能於消化道中存活，到達欲發揮功效的消化道部位。再者，乳酸桿菌成功存活且到達欲作用的消化道位置後，需具備對於腸胃道細胞的吸附能力，始可與腸胃道中的有害病原菌競爭吸附。若對於細胞的吸附能力不夠，即會被吸附能力強的有害病原菌排除，而無法停留於腸胃道中有效發揮功能。縱使尚未有有害病菌吸附於腸胃道細胞上以感染動物體，若乳酸桿菌具備高吸附能力，亦可排除後來的病原菌，避免腸胃道不為有 害病原菌所吸附，避免腸胃道的病菌感染。據此，比較GKM3與其他菌種於酸或膽鹽的環境下的耐受能力，以及對於動物體細胞的吸附能力。
除上述基本的特性外，本發明亦研究GKM3於動物體內的生理作用，以開發GKM3的醫藥用途。藉由高脂飲食以導致肥胖的大鼠，測量其體重計算變化量，並於大鼠犧牲後取其臟器、脂肪組織與血液，以研究餵食GKM3對於因高脂飲食引起的肥胖於動物體的各種生理面向，例如：體重、脂肪、臟器、血清中肥胖相關的指標、糞便，甚至是發炎或過敏反應相關指標上的影響。經該等實驗結果證實，GKM3對於肥胖所引起的多面向的病理反應具備緩解的作用，亦可有效改善過敏症狀。
於研究結果得知GKM3對於改善動物體健康有益下，將GKM3應用於醫藥用途上，開發為一種包含GKM3的組合物。
在一較佳實施態樣中，該組合物進一步包含添加劑。該添加劑可為賦型劑、防腐劑、稀釋劑、填充劑、吸收促進劑、甜味劑、或其組合。該賦型劑可選自檸檬酸鈉、碳酸鈣、磷酸鈣或其組合。該防腐劑可延長醫藥組合物的儲藏期限，例如苯甲醇、對羥基苯甲酸(parabens)。稀釋劑可選自水、乙醇、丙二醇、甘油或其組合。填充劑可選自乳糖、牛乳糖、高分子量舉乙二醇或其組合。吸收促進劑可選自二甲基亞碸(DMSO)、月桂氮卓酮、丙二醇、甘油、聚乙二醇或其組合。甜味劑可選自安塞甜(Acesulfame K)、阿斯巴甜(aspartame)、糖精(saccharin)、三氯蔗糖/蔗糖素(sucralose)、紐甜(neotame)或其組合。除上述所列舉的添加劑以外，在不影響GKM3的醫藥效果前提下，可依需求選用適合的其他添加劑。
在一較佳實施態樣中，該組合物為一藥品、飼料、飲料、 營養補充品、乳製品、食品或保健食品。
在一較佳實施態樣中，該組合物的形態為粉劑、錠劑、造粒、栓劑、微膠囊、安瓶(ampoule/ampule)、液劑噴劑或塞劑。
本發明的組合物可使用於動物或是人類。在不影響GKM3的效果的前提下，可以製為任何藥物型態，並根據藥物型態以適用的途徑施予該動物或人類。
下列實施態樣係記載以進一步闡釋本發明的優點，但並不欲對本發明的權利範圍產生限制。
實施例一：菌種的採集與分離純化
拜訪宜蘭、花蓮、台東等各地從事農作的農戶家庭，觀察高齡75歲以上仍可自給自足、靈活耕種的高齡農民。推論應長期攝取含有乳酸菌食品，意即長期接觸獨特益生功效之菌株，而有助於高齡農民維持良好的生理機能。因此，採集各地可能含有乳酸菌的樣品，將該樣品保存於密封的無菌袋，並冷藏於行動冰箱中帶回實驗室，以分離純化樣本中所含有的益生菌株。首先，配製含有不同營養源的培養基，以篩選出樣品中不同種類的乳酸菌株，培養基的成分與種類舉例如：MRS瓊脂、PCA瓊脂、M17瓊脂、Rogosa瓊脂、TOS-MUP瓊脂、MRS瓊脂添加3%NaCl或MRS瓊脂添加0.05%溴甲酚綠(bromocresol green)。接著，將採集的菌種在37℃下於該不同種類的培養基培養48小時後，從每種培養基的平板挑選約5~10個菌落外觀不同的單一菌落。該等單一菌落各別在37℃下於MRS培養基培養16小時後，以無菌甘油冷凍保存於-80℃的環境，待進行後續該等菌種的耐酸性、耐膽鹼及腸道吸附力測試，或其他動物實驗以測試生理活性。
最終發現採集自宜蘭礁溪鄉山區，以有機栽培的蔬果醃製 而得的發酵液作為的樣本中，分離出的菌株具優異的耐酸、耐膽鹽及腸道吸附性，特命名為GKM3。
實施例二：菌種的基因分析與鑑定
首先收集GKM3的DNA進行定序，並藉由基因比對判別菌種。將GKM3劃線活化，以接種環勾取單一菌落接種至培養基中放大。隔日收取新鮮菌體以CTAB法抽取菌株gDNA，以0.6%瓊脂膠體電泳確認gDNA品質。經濃縮後以第三世代定序技術平台PacBio RSII進行菌株全基因體分析。根據該全基因體分析結果，GKM3全基因體長度為3,076,381bp，並包含一49,415bp的質體(SEQ ID NO：1)。於全基因體資料庫進行GKM3全基因體序列的比對，得知GKM3的pheS(SEQ ID NO：2)及recN(SEQ ID NO：3)基因序列。接著，於NCBI資料庫比對GKM3的pheS基因(SEQ ID NO：2)序列。結果顯示GKM3的pheS基因與胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)的基因相似度最高，得知GKM3的菌種類別為胚芽乳酸桿菌。
再者，比對GKM3與其他菌株的特定基因片段，研究GKM3於演化上的獨特性。從食品工業發展研究所生物資源保存與研究中心隨機挑選購買3種胚芽乳酸桿菌，其編號分別為BCRC 12251、BCRC80222與BCRC80578。將菌株活化放大抽取gDNA後，分別以如下表1的引子對，經94℃反應3分鐘後，再進行94℃反應30秒、52℃反應30秒、72℃反應1分鐘30秒的35個循環，最後以72℃反應5分鐘的條件，進行聚合酶鏈反應。
反應完成的樣品送件進行定序，取得3株菌的pheS及recN基因序列。
此外，除取得上述購買的3種菌株的pheS及recN基因序列外，另由NCBI資料庫中下載以下5種菌株的pheS與recN序列，其為胚芽乳酸桿菌菌株LZ95(CP012122)、B21(CP010528)、JDM1(CP001617)、WCFS1(AL935263)及Lactobacillus paraplantarum L-ZS9(CP013130)。
針對本發明的GKM3、購買的3種胚芽乳酸桿菌以及資料庫下載的5種菌株的pheS與recN序列，以Phylogeny的MEGA Bootatrap Test的Neighbor-Joining模式繪製演化樹。pheS序列的比對結果顯示於第一圖，recN序列則顯示於為第二圖。根據該第一圖與第二圖的結果，Lactobacillus paraplantarum L-ZS9(CP013130)作為外群(out group)，被當作其他菌種相似度的比較基準，其與GKM3以及其他7種菌種在演化樹中的距離相距最遠。第一圖中，位於最上方的GKM3與由資料庫取得的B21(CP010528)最為相近，說明兩者於pheS基因序列的比對在演化關係中最接近。第二圖中，GKM3同樣位於最上方，與其接近的菌種是資料庫取得的LZ95(CP012122)與購入的BCRC 12251，得知於recN基因序列的比對中，GKM3與此兩 種菌株相較於其他種菌株更為接近。據此，綜觀比較pheS與recN基因序列所得的演化樹，GKM3在演化樹中的位置可與其他菌株區隔而自成一線，說明GKM3與現有胚芽乳酸桿菌品系存在差異，為一新穎胚芽乳酸桿菌菌株。
實施例三：菌種培養
研究不同培養條件對於GKM3的產量的影響。以一次一因子試驗法，針對培養GKM3的發酵培養基中的碳源與氮源進行測試。
首先從碳源的需求著手，比較8種碳源：葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、甘露糖、山梨糖醇、甘油及糖蜜的條件下GKM3的菌落數多寡及對於周邊白血球淋巴細胞的IFN-γ誘導的能力，以選用對GKM3的產量高、生理活性高碳源。於MRS培養基中，添加相對於培養基總重量3wt%上述8種的碳源，並設定培養溫度於約37℃、轉速約20rpm。實驗結果中較佳的4種碳源及其活菌菌落形成數目顯示如下表2，結果發現以蔗糖培養的菌落形成數目最高為4.2x109cfu/mL，相較於對照組的3.1x109cfu/mL有顯著提升，說明蔗糖培養的GKM3的產量最高。將以上述四種產量較佳的碳源所培養的菌株數目調整至1x109cfu/mL，進行周邊白血球淋巴細胞的IFN-γ誘導功效性的試驗。結果顯示如下表2，結果發現以蔗糖培養的GKM3提升IFN-r的活性最高達553pg/mL，相較於對照組的402pg/mL，增加幅度達32%，說明蔗糖培養的GKM3的生理活性最高。在同步考量高產量與生理活性的試驗結果下，評估以蔗糖作為碳源最適合GKM3的發酵培養。
接著，以蔗糖為固定碳源，測試不同氮源對GKM3益生菌的影響，7種氮源選擇如下：大豆蛋白、酵母抽出物、牛肉萃取物、酪蛋白粉、乳清蛋白粉、魚蛋白水解物及植物萃取蛋白。 經培養後觀測濃度(OD600)與菌數計數比較，可發現酵母抽出物促進GKM3的生長效果最佳。據此，以蔗糖搭配酵母抽出物作為培養基成分，與商業配方MRS液態培養基進行產量比較，發現新開發出的培養基配方在GKM3的發酵測試中，活菌數的菌落形成數目達到4.6x109菌落形成單位/毫升(cfu/mL)，相較於MRS培養基增加48%。證明新配方的發酵培養基有效提高GKM3益生菌的產量，GKM3可為大量生產，增加該GKM3於商業上應用的可行性。
實施例四：耐酸試驗
比較GKM3相對於其他菌種的耐酸能力。將GKM3、從食品工業發展研究所生物資源保存與研究中心購入的BCRC 12251、BCRC 80222與BCRC 80578共4種菌株活化。原始MRS液態培養基的酸鹼值約為pH 6.5，藉由添加HCl至MRS液態培養基中，調整該培養基的酸鹼度為另3種不同酸鹼度：約pH 3.2、pH 2.4與pH 2.0。將菌株接種在該等不同酸鹼值的培養基，於37℃下培養3小時後，計數菌落形成數目。
結果如第三圖所示，於原始pH培養下(約pH 6.5)，GKM3與其他3種菌株的菌數皆可達到10次方。於酸鹼值為pH 3.2時，全部菌株的菌數略為下降，GKM3與其他3種菌株相較未出現顯著差異。當酸鹼值下降至pH 2.4跟pH 2.0時，BCRC 12251、BCRC 80222與BCRC 80578的菌數陡降至約6次方，都顯著低於菌數維持於8次方的GKM3(P<0.05)。據此，得知在酸性環境下GKM3的活菌數顯著多於他種菌株，說明GKM3的耐酸能力較好，對於通過胃部時抵禦胃酸的能力更佳。
實施例五：耐膽鹽試驗
比較GKM3相對於其他菌種的耐膽鹽能力。將GKM3、從食品工業發展研究所生物資源保存與研究中心購入的BCRC 12251、BCRC 80222與BCRC 80578共4種菌株活化。將該等菌種接種於含0.3%膽鹽的MRS液態培養基中，於37℃下浸泡半小時後，觀察並計數菌數。
結果如第四圖所示，於原始MRS液態培養基培養下，GKM3與BCRC 12251、BCRC 80222與BCRC 80578的單位菌數皆接近9 x109。在添加有0.3%膽鹽的MRS中，BCRC 12251、BCRC 80222的菌數都顯著低於GKM3菌數(P<0.05)，BCRC 80578的菌數則與GKM3統計上無顯著差異。據此，得知在膽鹽環境下，GKM3的活菌數顯著多於他種菌株，說明GKM3的耐酸能力較好，對於通過體內消化道時抵禦膽鹽的能力更佳。
實施例六：腸道吸附試驗
比較GKM3相對於其他菌種的腸道吸附能力。將GKM3、從食品工業發展研究所生物資源保存與研究中心購入的BCRC 12251、BCRC 80222與BCRC 80578共4種菌株活化，並調整 起始菌數至10的7次方，加入至培養的HT-29細胞中。該HT-29細胞係一種腸癌細胞，培養在含10%胎牛血清(HyCloneTM)的DMEM(Sigma)培養基中，並添加1mM丙酮酸鈉(sigma)、1%非必需胺基酸(NEAA)與1%抗生素(青黴素100units/mL與鏈黴素100μg/mL)，置於37℃、5% CO2恆溫培養箱中培養，約2至3天為週期繼代。加入菌株的HT-29細胞於37℃下培養2小時後，以PBS洗去未吸附細胞的菌，再利用1% Triton X-100裂解HT-29細胞，使吸附在細胞表面的菌釋出，並計算菌數。
結果如第五圖所示，BCRC 12251、BCRC 80222與BCRC 80578吸附在HT-29細胞上的菌數，都顯著低於GKM3吸附的菌數(P<0.05)。據此，可得知GKM3在腸道吸附能力上優於其他菌種，能有效於腸道中停留較長的時間，以發揮效益。
實施例七：動物實驗I
試驗動物由樂斯科生物科技公司(BioLASCO Taiwan Co.,Ltd.,Taiwan)訂購18隻6週齡且體重介於201-225g的雄性Wistar大白鼠。將動物飼養於不銹鋼鼠籠，而動物房溫度控制在22±2℃，濕度控制在60-80%，光照與黑暗各十二小時(07：00-19：00為光照期；19：00-07：00為黑暗期)。本實驗操作經由中山醫學大學實驗動物照護及使用委員會(Chung Shan Medical University Animal Care Committee)核准通過(IACUC AHPP-Groval NO：1199)。試驗期間，大鼠自由攝食飼料和蒸餾水。
試驗動物餵予正常成鼠飼料和飲用蒸餾水適應環境1週後，將其隨機分為每組6隻共三組，如下：
1.正常飲食組(normal diet,ND)
2.高脂飲食組(high-fat diet,HFD)
飼料配方為以AIN93G作為基礎，加以調整油脂比例。飼料中包含固形物68%、大豆油7%和豬油25%。
3.高脂飲食組給予GKM3(HFD+GKM3)
除與高脂飲食組相同的飼料配方外，經由口服方式以102.8mg/kgrat/day的份量餵食GKM3達6週。
於試驗開始前，先紀錄大鼠的起始體重(initial body weight)，隨後每兩日精秤體重。犧牲前的第三天當天收集一次大鼠糞便，並於試驗結束前12小時進行禁食。利用二氧化碳(CO2)進行犧牲後，紀錄其最終體重(final body weight)，並計算體重改變量(weight change)。從大鼠靜脈進行血液採集，將血液收集於血清分離管(BD Vacutainer,Plymouth,UK)中，以4000rpm離心10分鐘取出血清，分裝於微量離心管中並儲存於-80℃冰箱，作為分析使用。取出臟器組織(心臟、肺臟、肝臟、脾臟和腎臟)和脂肪組織(腎周圍脂肪、副睪脂肪、腸系膜脂肪、腹股溝脂肪和腹膜外脂肪)利用生理食鹽水清洗及擦拭，並紀錄各個臟器和脂肪組織的重量，秤量後以鋁箔紙包覆，再以液態氮冷凍，儲存於-80℃冰箱，以供實驗分析使用。
所得的實驗數據使用SPSS電腦統計軟體進行分析。變異數分析則以PROC ANOVA與Duncan’s multiple range test進行分析，p<0.05為具有顯著性差異。
1.體重變化
根據起使體重與最終體重，以下述式1計算體重改變量。式1：體重改變量(g)=[最終體重(g)-起始體重(g)]正常飲食組(ND)、高脂飲食組(HFD)與高脂飲食組給 予GKM3(HFD+GKM3)的起始體重、最終體重與體重改變量，彙整如下表3：
根據表3繪製如第六圖，各組間的起始體重無顯著差異(p>0.05)。高脂飲食組在最終體重上顯著高於正常飲食的對照組(p<0.05)，而相較於高脂飲食組，以高脂飲食誘導肥胖的大鼠並給予GKM3的組別，其最終體重顯著降低(p<0.05)。從體重改變量亦可看到相同的趨勢，餵食GKM3的組別相較於沒有餵食的組別，其體重變化量較小，顯示GKM3可降低由高脂飲食引起的體重增加。
2.臟器重量
各組別的臟器：心臟、肝臟、脾臟、肺臟與腎臟的重量顯示於如下表4。
根據表4，大鼠臟器重量於心臟、脾臟、肺臟與腎臟沒有顯著變化。針對肝臟，高脂飲食組的重量高於正常飲食組，而餵食GKM3的組別相較於高脂飲食組則明顯下降(p>0.05)，其結果繪製如第七圖。據此，服用GKM3能有效降低肝臟的重量，減緩因高脂飲食所引起的肝腫大。
3.脂肪重量
將各脂肪的重量(mg)除以最終體重(g/rat)，計算得出各部位的脂肪量，彙整為如下表5，並繪製如第八圖。
從該結果可看出，餵食GKM3的組別相較於高脂飲食組，各脂肪重量都顯著下降。此結果說明在高脂飲食下，GKM3仍能有效降低全身各脂肪的堆積。
若將取下的脂肪組織分為內臟脂肪與皮下脂肪兩類，腎周圍脂肪、副睪脂肪與腸系膜脂肪屬於內臟脂肪，腹股溝脂肪與腹膜外脂肪則歸類於皮下脂肪，而各脂肪組織的加總則作為總脂肪量。內臟脂肪與皮下脂肪量以下式2與式3計算得出，總脂肪量以下式4計算得出，並將計算結果彙整為如下表6，並繪製為第九圖。
式2：內臟脂肪量(mg/grat)=[腎周圍脂肪量(mg)+副睪脂肪量(mg)+腸系膜脂肪量(mg)]÷最終體重(g)
式3：皮下脂肪量(mg/grat)=[腹股溝脂肪(mg)+腹膜外脂肪量(mg)]÷最終體重(g)
式4：總脂肪量(mg/grat)=[腎周圍脂肪量(mg)+副睪脂肪量(mg)+腸系膜脂肪量(mg)+腹股溝脂肪(mg)+腹膜外脂肪量(mg)]÷最終體重(g)
根據第九圖，高脂飲食誘導的肥胖大鼠在內臟脂肪組織重量顯著高於正常飲食組(p<0.05)。高脂飲食合併給予GKM3 的組別相較於單純給予高脂飲食組，在內臟脂肪和皮下脂肪組織的重量皆顯著低於高脂飲食組(p<0.05)。此結果說明不論在內臟脂肪或皮下脂肪，GKM3有效減少因高脂飲食造成的各脂肪積存。
4.肝臟脂質含量
針對大鼠的肝臟進行脂質分析。將剪取下的肝臟組織秤重，並於加入萃取溶劑(氯仿：甲醇為2：1(v/v)的比例)後，再以均質機磨碎。將磨碎的肝臟組織過濾至有蓋試管中，以萃取液定量至10mL後，加入2mL的0.05%氯化鈣(w/v)，以3500×g、4℃離心3分鐘，去除上層液。接著，以氯仿：甲醇：水為3：48：47(v/v/v)的比例定量至12mL，以3500×g、4℃離心3分鐘，去除上層液。再來，先加入甲醇定量至10mL，再以萃取溶劑(氯仿：甲醇為2：1(v/v)的比例)定量至25mL，即可收集於樣品瓶中，儲存於-20℃以作為分析實驗樣品。該肝臟分析樣品中所含的總脂質、三酸甘油酯與膽固醇以市售試劑組進行分析。
大鼠肝臟總脂質、三酸甘油脂和膽固醇的含量的實驗結果實驗結果顯示如下表7，繪製於第十圖。
根據該實驗結果得知，在總脂質與三酸甘油酯的含量上，單純給予高脂飲食的組別均顯著高於正常飲食的對照組(p<0.05)。而在總脂質、三酸甘油脂和膽固醇的含量上，高脂飲食合併給予GKM3的組別相對於單純給予高脂飲食組別，在統計學上都有意義的明顯降低(p<0.05)。此結果說明，GKM3有效減少因高脂飲食所導致的肝臟的脂質堆積。
5.肝臟發炎物質含量
酵素免疫分析法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)測定肝臟中之TNF-α濃度。以冰的生理食鹽水(ice-cold saline)將肝臟組織殘留的多餘血液洗去，將肝臟組織置於漏斗上滴乾生理食鹽水後秤重。接著，加入適量的酸鹼值為pH 7.4的緩衝溶液(0.32M蔗糖、1mM EDTA、10mM Tris-HCl)後，以均質機打碎肝臟組織為10%的均質液(homogenate)。再以13,600×g高速離心該均質液30分鐘，取上清液50μL，以TNF-α ELISA kit進行檢測，並以分光光度計於450nm測量吸光值(A)。
大鼠肝臟中的TNF-α濃度的實驗結果顯示於第十一圖。如該結果所示，高脂飲食組大鼠的肝臟中TNF-α的濃度顯著高於正常飲食組別。相較於高脂飲食組的大鼠，經高脂飲食誘導的肥胖大鼠合併給予GKM3的組別的肝臟中TNF-α的濃度明顯下降。此結果顯示，服用GKM3會降低肝臟中TNF-α的濃度，GKM3具有降低體內發炎反應的功效。
6.肝指數
經離心分離大鼠靜脈血液取得的血清，以市售分析套組(Diasys Co Ltd.,Holzheim,Germany)測定天門冬胺酸轉胺酶(Aspartate Aminotransferase，AST)與丙胺酸轉胺酶(Alanine Aminotransferase，ALT)的濃度，實驗結果顯示如下表8，繪 製為第十二圖。
結果顯示，高脂飲食組大鼠的血清中ALT和AST顯著高於正常飲食的對照組(p<0.05)，說明其肝臟的損壞程度較高。反觀高脂飲食誘導之肥胖大鼠合併給予GKM3的組別，其相較於高脂飲食組，可顯著降低血清中ALT和AST的濃度(p<0.05)。此結果說明，服用GKM3會降低血清中ALT和AST的濃度，GKM3有效改善肝功能。
7.血清脂質含量
經離心分離大鼠靜脈血液取得的血清，以市售分析套組(Diasys Co Ltd.,Holzheim,Germany)測定血清中三酸甘油脂(Triglyderide)、總膽固醇(Total cholesterol)與高密度脂蛋白膽固醇(HDL-cholesterol)的濃度，實驗結果顯示於下表9，並依序繪製為第十三圖。
結果顯示，高脂飲食組大鼠的血清中三酸甘油脂顯著高於正常飲食組(p<0.05)。相對於高脂飲食組，高脂飲食誘導的肥胖大鼠合併給予GKM3的組別的三酸甘油脂含量顯著降低。
高脂飲食之肥胖大鼠總膽固醇含量約為148.35(mg/dL)，經服用GKM3後，總膽固醇降至約90.55(mg/dL)，顯示服用GKM3亦能降低高脂飲食血清中的總膽固醇濃度。
高脂飲食組大鼠的血清中高密度脂蛋白膽固醇顯著低於正常飲食組(p<0.05)。相對於高脂飲食組，高脂飲食誘導的肥胖大鼠合併給予GKM3的組別的高密度脂蛋白膽固醇含量些微提升。此結果說明，服用GKM3能提高血清中高密度脂蛋白膽固醇的濃度。
8.血清酮體
經離心分離大鼠靜脈血液取得的血清，酮體以市售分析套組(Denka Seiken Co Ltd.,Taipei City,Taiwan)進行測定，實驗結果顯示於下表10，並繪製為第十四圖。
結果顯示，高脂飲食組大鼠的血清中酮體含量顯著高於正常飲食組(p<0.05)。經高脂飲食誘導的肥胖大鼠合併給予GKM3的組別，顯著降低高脂飲食所誘導引起的血清酮體濃度上升情形(p<0.05)，降低高脂飲食誘導的肥胖大鼠的酮體含量約27.8%。此結果顯示，服用GKM3會降低高脂飲食血清中酮體濃度。
9.血清尿酸
經離心分離大鼠靜脈血液取得的血清，尿酸以市售分析套組(Diasys Co Ltd.,Holzheim,Germany)進行測定，實驗結果顯示於下表11，並繪製為第十五圖。
實驗結果顯示，高脂飲食組別的大鼠的血清中，尿酸含量顯著高於正常飲食組別。高脂飲食合併給予GKM3的組別，與高脂飲食組別相比，顯著降低血清中尿酸的濃度(p<0.05)至正常飲食組的水準。此結果說明，施予GKM3對於降低血清中尿酸具備功效。
10.糞便脂肪排出
以犧牲前第三天當天收集的大鼠糞便，進行所含總脂質含量的測定。秤重收集乾燥的糞便並將其磨碎，加入萃取溶劑(氯仿：甲醇為2：1(v/v)的比例)後進行振盪並以濾紙過濾。接著，於濾液中加入0.05%的氯化鈣，混勻後以3500 xg、4℃離心5分鐘，去除上清液，再以萃取溶劑定量至25mL，儲存於-20℃以備作為後續分析實驗的樣 品。取作為樣品的該糞便脂質萃取液10μL，經減壓濃縮機抽乾後，加入市售試劑組的反應劑1000μL混勻後，37℃水浴5分鐘。接著，以分光光度計測量500nm波長的吸光值，並控制標準液吸光值換算取得糞便脂質濃度。實驗結果顯示於下表12，並繪製為第十六圖。
結果顯示高脂飲食組的糞便總脂質顯著高於正常飲食組(p<0.05)。但於高脂飲食合併給予GKM3的組別，相較於高脂飲食組，糞便中脂質的排出量顯著提升(p<0.05)。此結果說明對高脂飲食所導致的肥胖大鼠給予GKM3，具有增加以糞便方式排出脂質的效果。
實施例八：動物實驗II
BALB/c雄鼠4至5週大共36隻，飼養一週待其適應環境後開始實驗。首先隨機分為以下三個組別，每組12隻。
1.正對照組：無致敏、餵食0.9%生理食鹽食水、無餵食GKM3。
2.負對照組：致敏、餵食0.9%生理食鹽食水、無餵食GKM3。
3.GKM3組：致敏、餵食0.9%生理食鹽食水以及GKM3。
根據上述組別連續餵食生理食鹽水、及GKM3 0.2ml達四週，並於第三週及第四週於皮下注射OVA抗原誘導過敏，於第五週鼻腔氣管內以OVA抗原致敏，兩天後以非侵入的方式進行 呼吸道阻力測試。
呼吸道阻力測試以Buxco出產的Whole-body plethysmogragh(WBP)，進行非侵入性之小鼠呼吸道阻力變化的測量，其阻力變化是依據小鼠呼吸過程中測得的數值經電腦分析後，得到一個肺功能指標Penh(enhanced pause)值來表示，數值越高代表呼吸道阻力越大。首先將小鼠放進動物艙中，測量小鼠的基礎Penh值三分鐘。接著將小鼠暴露在霧化的0.9% NaCl三分鐘後，測量Penh值三分鐘。接著將小鼠暴露在霧化的非特異性氣管收縮刺激劑-乙醯甲膽鹼(methacholine)(3.125mg/ml)三分鐘後，測量Penh值三分鐘，以逐漸增高濃度的乙醯甲膽鹼(methacholine)，濃度分別為6.25mg/ml、12.5mg/ml、25mg/ml、50mg/ml，重複上述步驟，以Penh來表示所有得到的數值加以平均計算。實驗結果顯示於第十七圖。
由結果來看，正對照組因未致敏，在乙醯甲膽鹼(methacholine)的刺激下呼吸道阻力最小，而其他兩組呼吸道阻力顯著提升，顯示確實有致敏成功。相較於致敏後未餵食GKM3的小鼠(負對照組)，致敏後餵食GKM3的組別在漸進濃度的呼吸道刺激劑乙醯甲膽鹼(methacholine)的刺激反應下，於各濃度乙醯甲膽鹼(methacholine)的刺激反應顯著較低(p<0.05)。此結果說明GKM3具有改善因過敏原所引起的呼吸道壓力的效果。
實施例八：動物實驗III
自國家實驗研究院實驗動物中心購入二十隻雄性C57BL/6JNarl小鼠。經一週觀察期將小鼠隨機分組，每盒飼養5隻。墊料採用美國NEPCO公司(Warrensburg,NY,USA)實驗動物專用木屑(Aspen and Shredded Aspen Shavings)，經滅 菌後使用，每週更換2次。餵食方式採用任食、任飲。飼養方式按一般(conventional)實驗動物管理方法進行，環境設定為溫度23±2℃、相對溼度50±10%、12小時光照/黑暗交替。本實驗設計經食品工業發展研究所動物實驗管理小組審核通過(動管字第106-10號)。
購入的二十隻小鼠分為對照組及GKM3實驗組兩組，每組10隻。GKM3實驗組以500mg/kg小鼠劑量的劑量、0.1mL/10g體重/天的體積連續管餵十四天，對照組則餵食水。於餵食期間每週量測一次體重、各兩次飼料攝取量及飲水量。十四天後，進行口服葡萄糖耐受性測試。小鼠禁食16小時後，自尾端採集血液樣本，以Glucosure II血糖機(ApexBio Inc.,Taiwan)搭配血糖測試片(葡萄糖氧化酵素法)檢測空腹(0分鐘)血糖值。接著，每隻小鼠管餵葡萄糖溶液2g/kg，並分別於30、60及120分鐘時檢測血糖濃度。口服葡萄糖耐受性測試完成後，犧牲小鼠並取其肝、腎、脾臟進行秤重。
實驗結果以Mean±SEM表示，以Student’s t-test比較GKM3實驗組與對照組的實驗結果，*及**分別表示與水對照組之間p<0.05、p<0.01。小鼠體重與總體增重變化的結果顯示於下表13；平均每日攝食量及飲水量顯示於下表14；小鼠臟器重量顯示於下表15；小鼠於口服葡萄糖耐受性試驗的血糖值顯示於下表16並繪製為第十八圖與第十九圖；口服葡萄糖耐受性試驗的血糖上升值顯示於下表17，並繪製為第二十圖與第二十一圖；。
從上述表13-15得知，管餵十四天後GKM3組的體重及體增重((克數及百分比)、飲水量與飼料攝取量、臟器重量及其相對重量比，與對照組無統計上的顯著差異((p>0.05)。
從上述表16與17得知，在口服葡萄糖耐受性試驗中，GKM3實驗組的30分鐘血糖值均顯著地較對照組低，GKM3組的120分鐘血糖曲線下面積(area under curve,AUC120min)亦略低於水對照組(p<0.05)。針對血糖上升值(blood glucose increments)，實驗組的30分鐘血糖上升值(i30min)以及120分鐘血糖上升曲線下面積(iAUC 120min)都明顯低於水對照組。綜合以上，顯示在500mg/kg劑量之下，GKM3具有改善葡萄糖敏感性的潛力。
【生物材料寄存】
國內外寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】
食品工業發展研究所；2017年7月14日；寄存編號BCRC 910787。
<110> 葡萄王生技股份有限公司
<120> 一種胚芽乳酸桿菌、組合物、培養方法及降尿酸、改善過敏及/或降血糖的用途
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 49415
<212> DNA
<213> Lactobacillus plantarum strain GKM3
<400> 1
<210> 2
<211> 1047
<212> DNA
<213> Lactobacillus plantarum strain GKM3
<400> 2
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<211> 1695
<212> DNA
<213> Lactobacillus plantarum strain GKM3
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<212> DNA
<213> Artificail primer
<400> 4
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<213> Artificail primer
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<213> Artificail primer
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<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificail primer
<400> 7

Claims (18)

  1. 一種胚芽乳酸桿菌( Lactobacillus plantarum)，其包含一具序列SEQ ID No：2的 pheS基因及一具序列SEQ ID No：3的 recN基因。
  2. 如請求項1所述之胚芽乳酸桿菌，其進一步包含有具序列SEQ ID No：1的質體。
  3. 如請求項1或2所述之胚芽乳酸桿菌，其寄存於財團法人食品工業發展研究所，其寄存編號為BCRC 910787。
  4. 如請求項1或2所述之胚芽乳酸桿菌，其具有耐酸、耐鹼及/或細胞吸附能力。
  5. 如請求項1或2所述之胚芽乳酸桿菌，其具有降尿酸、改善過敏及/或降血糖的效果。
  6. 一種組合物，其包含如請求項1至5項中任一項所述之胚芽乳酸桿菌。
  7. 如請求項6所述之組合物，其中該胚芽乳酸桿菌寄存於財團法人食品工業發展研究所，其寄存編號為BCRC 910787。
  8. 如請求項6所述之組合物，其包含一種選自下列群組的添加劑：賦型劑、防腐劑、稀釋劑、填充劑、吸收促進劑、甜味劑或其組合。
  9. 如請求項6所述之組合物，其為一藥品、飼料、飲料、營養補充品、乳製品、食品或保健食品。
  10. 如請求項6所述之組合物，其形態為粉劑、錠劑、造粒、栓劑、微膠囊、安瓶、液劑噴劑或塞劑。
  11. 如請求項6所述之組合物，其具有降尿酸、改善過敏及/或降血糖的效果。
  12. 一種培養一胚芽乳酸桿菌的方法，其包含將寄存編號為BCRC 910787的胚芽乳酸桿菌培養於一培養基；其中該培養基包含蔗糖、酵母萃取物或其組合，且該蔗糖或該酵母萃取物的添加比例相對於該培養基總重量為1wt%至10wt%。
  13. 如請求項12所述之方法，其係於轉速為5至50rpm的條件下培養。
  14. 如請求項12所述之方法，其係於溫度為32℃至42℃的條件下培養。
  15. 一種胚芽乳酸桿菌菌株的用途，其用於製備降尿酸、改善過敏及/或降血糖的醫藥組合物，其中該胚芽乳酸桿菌的寄存編號為BCRC 910787。
  16. 如請求項15所述之用途，其中降尿酸為降低血清中尿酸的含量。
  17. 如請求項15所述之用途，其中改善過敏為降低呼吸道阻力。
  18. 如請求項15所述之用途，其中降血糖為降低因營養補給所導致的血糖上升量。
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