TWI423807B - 具有抗發炎活性的乳桿菌分離株及其用途 - Google Patents

Description

具有抗發炎活性的乳桿菌分離株及其用途

本發明是有關於兩株具有抗發炎活性(anti-inflammatory activities)以及有益的益生性質(beneficial probiotic properties)的乳桿菌分離株(Lactobacillus isolates)，亦即沙克乳桿菌(Lactobacillus sakei )GMNL-76以及羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri ) GMNL-89，它們分別以寄存編號BCRC 910355與BCRC 910340被寄存於食品工業發展研究所(FIRDI)的生物資源保存及研究中心(BCRC)以及以寄存編號CCTCC M 207153與CCTCC M 207154被寄存於中國典型培養物保藏中心(CCTCC)。這兩株乳桿菌分離株暨其繼代培養後代(sub-cultured offspring)可被用於製備各式的食品產品(food products)，以及用於製造供治療和/或緩和與發炎有關聯的疾病(treating and/or alleviating diseases associated with inflammation)[諸如類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis)]的藥學組成物(pharmaceutical compositions)。

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種慢性自體免疫疾病(chronic autoimmune disease)，它會造成關節(例如手、足、腕、肘、膝以及踝關節)的腫脹(swelling)、變形(deformity)、疼痛(pain)、萎縮(atrophy)以及僵硬(stiffness)。長期地慢性關節炎會逐漸侵蝕掉正常的關節骨細胞，導致關節變形以致最後喪失功能。此外，類風濕性關節炎也會侵犯關節以外的部位，例如：腺體(glands)[諸如唾液腺(salivary gland)、淚腺(lacrimal gland)以及淋巴腺(lymph gland)等]、器官(諸如肝臟、脾臟、心臟以及肺臟等)或系統(諸如循環系統以及神經系統)，進而造成類風濕性血管炎(rheumatoid vasculitis)、胸膜肺炎徵候(pleuropulmonary manifestations)[包括間質纖維化(interstitial fibrosis)、胸膜肺炎結節(pleuropulmonary nodules)、肺炎(pneumonitis)與動脈炎(arteritis)]以及費爾蒂氏症候群(Felty’ s syndrome)等。

類風濕性關節炎的發病年齡主要是落在40至50歲之間，而女性的發病率是男性的2至4倍。至今，類風濕性關節炎的確切致病原因仍是未知，但是，先前的研究顯示：遺傳傾向(genetic predisposition)、環境誘發(environmental trigger)、自體免疫現象(autoimmune events)、慢性發炎(chronic inflammation)、細胞運輸(cell trafficking)以及治療(treatment)等都可能與類風濕性關節炎的免疫致病機制(immunopathogenesis)有關聯。

類風濕性關節炎的主要病灶是滑膜組織(synovial tissue)。正常關節內的滑膜細胞不會超過3層，但在關節炎患者的關節內則會出現明顯的增生。類風濕性關節炎有可能是肇因於患者的免疫細胞不正常地攻擊自身的關節軟骨與滑膜組織的第II型膠原蛋白(collagen type II,CII)。類風濕性關節炎患者可被檢測出具有對第II型膠原蛋白具專一性的自體抗體(collagen type II-specific autoantibodies)和/或類風濕因子(rheumatoid factor)。類風濕因子是由IgG的Fc領域的糖基化缺陷而被引發的自體抗體，其中以IgM最多見，而IgG、IgA亦有發現。類風濕因子在大約80%的類風濕性關節炎患者可被檢測到，它與原抗原(original antigens)結合之後所形成的免疫複合體(immune complexes)會沉積於滑膜、軟骨或血管中而造成病變。

已知細胞激素(cytokines)涉及到許多重要的生物過程(biological processes)，包括：發炎(inflammation)、組織修復(tissue repair)、細胞生長、纖維化(fibrosis)、血管生成(angiogenesis)，以及免疫反應(immune response)。因此，細胞激素在自體免疫疾病中扮演一個重要的角色。

於M. Feldmannet al. (1996),Annu. Rev. Immunol. ,14:397-440此篇回顧性論文中，M. Feldmann等人藉由分析類風濕性關節炎的滑膜組織(synovial tissue)中細胞激素的表現與調控來探討RA的致病機制(pathogenesis)，其中細胞激素被區分為下面四大類別：(1)前發炎性細胞激素(proinflammatory cytokines)；(2)免疫調節性細胞激素(immunoregulatory cytokines)；(3)趨化性細胞激素(chemotactic cytokines)；以及(4)細胞分裂細胞激素(mitogenic cytokines)等。

前發炎性細胞激素是一群由第1型T輔助細胞[T-helper 1 cells，簡稱Th1細胞(Th1 cells)]所產生的能夠調節延遲型過敏反應(delayed-type hypersensitivity reaction)的分子，包括：介白素-1(interleukin-1,IL-1)、干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)以及顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)等。在類風濕性疾病(rheumatic disease)中所觀察到的軟骨破壞(cartilage destruction)已被普遍地認為是基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)的活性所造成，該基質金屬蛋白酶是由對前發炎性細胞激素(諸如IL-1或TNF-α)有反應並被活化的巨噬細胞與纖維母細胞(fibroblasts)所產生。M. Feldmann等人進一步提到：將IL-1或TNF-α注射至經膠原蛋白免疫(collagen-immunized)的小鼠(mice)或大鼠(rats)體內，或將IFN-γ局部注射到經第II型膠原蛋白免疫(collagen type II-immunized)的小鼠的腳掌中，皆會加速關節炎的發生並增高疾病的嚴重性(M. Feldmannet al .(1996)，同上述)。

免疫調節性細胞激素[亦被稱為抗發炎性細胞激素(anti-inflammatory cytokines)]是一群由第2型T輔助細胞[T-helper 2 cells，簡稱Th2細胞(Th2 cells)]所產生的能夠抑制發炎反應的分子，包括：IL-4、IL-10、IL-13以及轉變生長因子-β(Transforming Growth Factor-β,TGF-β)等。在G. Garciaet al. (1999),Journal of Autoimmunity ,13:315-324中，G. Garcia等人提到：TGF-β與IL-10這兩種免疫調節性細胞激素不僅會抑制會誘發MMPs的前發炎性細胞激素的生成，亦會誘發MMPs的天然抑制劑[亦即基質金屬蛋白酶的組織抑制劑(tissue inhibitors of matrix metalloproteinases,TIMPs)]的生成。G. Garcia等人進一步提到：IL-10被廣為知曉除了會抑制從Th1細胞生成IFN-γ之外，還會抑制從其他的白血球族群(leukocyte populations)生成各種不同的細胞激素。IL-10會抑制從巨噬細胞生成IL-1、IL-6、TNF-α、IL-8以及G-CSF(granulocyte-colony stimulating factor，顆粒球-群落刺激因子)，並且會抑制從多形核細胞(polymorphonuclear cells)生成IL-1、TNF、IL-8、巨噬細胞發炎蛋白質1α(macrophage inflammatory protein 1α,MIP1α)以及巨噬細胞發炎蛋白質1β(macrophage inflammatory protein 1β,MIP1β)，而這些細胞激素與趨化激素(chemokines)之中的大多數涉及到關節炎的病理學過程(pathological process)(G. Garciaet al .(1999)，同上述)。

這些研究結果顯示：與Th1細胞有關的前發炎性細胞激素(諸如TNF-α與IFN-γ)會促進發炎而使得類風濕性關節炎的病況更為惡化，而與Th2細胞有關的免疫調節性細胞激素(諸如IL-10與IL-4)除了可以抑制前發炎性細胞激素的生成之外，亦可透過誘導TIMPs的生成來減少軟骨破壞。

目前尚無藥物可有效地治癒類風濕性關節炎，因此臨床上所使用的藥物僅能著重於防止關節與其他組織或器官的發炎與破壞、修復受損關節以減輕疼痛，以及維持關節的功能並防止變形等。治療的模式可區分為藥物治療、手術治療、復健治療、運動治療以及飲食控制等。藥物治療主要是針對發炎的症狀進行治療，而現今常用於治療類風濕性關節炎的藥物可被歸納為下面五大類(謝調揚與陳培瑛(2001)，“類風濕性關節炎的治療”，藥學雜誌，17(4):109-116)：

1.　生物反應調節劑(biological response modifiers,BRMs)：例如依那西普(etanercept)(商品名稱為)與因福利美(infliximab)(商品名稱為)，它們是抗-TNF藥劑(anti-TNF agents)，可藉由專一地結合至TNF-α來抑制TNF-α的生物活性，進而降低TNF-α所造成的發炎現象；

2.　非類固醇型抗發炎藥物(nonsteroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)：例如阿司匹靈(aspirin)與伊布洛芬(ibuprofen)，此類藥物具有消炎與止痛的功效，因此可供用於緩和類風濕性關節炎患者長期或短期的疼痛與發炎；

3.　疾病修飾型抗類風濕藥物(disease-modifying antirheumatic drugs,DMARDs)：例如來氟米特(leflunomide)(商品名稱為)、胺甲碟呤(methotrexate)、青黴胺(penicillamine)、羥基氯奎(hydroxychloroquine)以及金製劑(gold compound)等，它們適用於對NSAIDs沒有反應的類風濕性關節炎患者。DMARDs藉由調節會引起類風濕性關節炎的異常免疫反應來延緩疾病過程，而使用此類藥物來進行治療時必須有醫師的監督以避免副作用的發生；

4.皮質類固醇(corticosteroids)：此類藥物對於治療類風濕性關節炎十分有效，但是會產生許多副作用。皮質類固醇通常是以口服或注射的劑量形式(dosage form)來被投藥，但是經常注射皮質類固醇會傷害軟骨，因此注射次數以每年1至2次為限。目前，口服強體松(oral prednisone)是醫師最常開立的處方箋；以及

5.其它：例如玻尿酸(hyaluronic acid)[諸如玻尿酸鈉(sodium hyaluronate)(商品名稱為)]及其衍生物[諸如Hylan G-F 20(商品名稱為)]。玻尿酸是關節軟骨(articular cartilage)與滑液(synovial fluid)的主要成份，因此藉由玻尿酸的關節內注射(intra-articular injection)可以達到刺激軟骨細胞增生、保護與潤滑關節，以及降低發炎的效用。

有關用於治療類風濕性關節炎之藥物的選用，一般初期會以效力(efficacy)較弱、安全性較高的NSAIDs作為第一線用藥，若治療效果不顯著，再以效力較強的DMARDs作為第二線用藥。當這兩類藥物均無法達到所欲療效時，則會考慮使用皮質類固醇或施行手術。雖然藥物具有減輕疼痛、僵硬感及發炎的功效，但長期服用可能會產生失眠(insomnia)、耳鳴(sonitus)、水腫(edema)、胃潰瘍(stomach ulcers)、胃出血(gastrorrhagia)、胃穿孔(gastrobrosia)、皮膚敏感(skin sensitivity)、蛋白尿(albuminuria)、糖尿病(diabetes)、高血壓(hypertension)、骨質疏鬆症(osteoporosis)、白內障(cataract)、抵抗感染能力降低等副作用，同時在治療的過程中需要定期地作血液生化、血清檢查，俾以確保治療成效以及避免上述副作用的發生。

迄今，尚未有一種可以有效地治療或緩和類風濕性關節炎並且不會產生非所欲的副作用的藥物。

聯合國糧食農業組織(Food and Agriculture organization of the United Nations,FAO)以及世界衛生組織(World Health Organization,WHO)將益生菌(probiotics)定義為：活的微生物，當它呈適當數量來被投藥時，可賦予宿主一健康益處(health benefit)(Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food,Joint FAO/WHO Working Group Report on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food,April 30 and May 1,2002)。目前可作為益生菌使用的微生物有許多種類，例如乳桿菌屬(Lactobacillus )、雙叉桿菌屬(Bifidobacterium )、乳球菌屬(Lactococcus )、腸球菌屬(Enterococcus )、酵母菌屬(yeasts)、鏈球菌屬(Streptococcus )等等，特別是前兩個菌屬的物種。

Eli Metchnikoff在1908年提出：存在於胃腸道(gastrointestinal tract,GI tract)內的有害腐敗細菌(harmful putrefying bacteria)會被產酸的乳桿菌(acid-producingLactobacilli )所抑制或拮抗(antagonized)(Eli Metchnikoff,1908,The Prolongation Of Life,Ed. P. Chalmers Mitchell,G. P. Putnam’ s Sons,The Knickerbocker Press,New York & London )。之後，有許多的研究以及臨床試驗亦陸續證實乳桿菌與健康之間存在有重要的相關性。

乳桿菌是一群革蘭氏陽性的兼性厭氧菌(gram-positive facultative anaerobe)，它們普遍存在於人類的胃腸道與陰道(vagina)內，它們能夠發酵糖類並以乳酸為主要代謝產物。乳桿菌已被發現的功效包括：(1)增進腸道微生物群(intestinal microflora)的菌相平衡；(2)預防腹瀉(diarrhea)；(3)降低結腸癌(colon cancer)的危險性；(4)刺激胃腸上皮黏膜系統(gastrointestinal epithelial mucosal system)的正常發展與功能；(5)產生各種維生素(vitamins)與營養素(nutrients)；以及(6)預防與治療陰道炎(vaginosis)。

基於乳桿菌的有益益生性質，本領域中的相關研究人員致力於開發具有所欲的生物活性的乳桿菌分離株。在此方面，可以參見，例如：TW 588109揭示鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus ) Tcell-1及其用途。TW I241912揭示6株具有降低與同化膽固醇能力(ability to lower and assimilate cholesterol)的新穎耐酸與耐膽鹽乳桿菌分離株，它們是Lactobacillus gasseri B21T1、B21T6、C21T1、X21B7與B38T38以及嗜酸乳桿菌(L. acidophilus ) B6T7。TW I283268揭示鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnose ) GM-020及其治療肥胖(obesity)之用途。TW I284149揭示副乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei ) GMNL-32及其治療過敏(allergy)相關疾病之用途。另外，TW200611973揭示醱酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum ) GM-090能有效刺激IFN-γ之分泌和/或治療過敏。

此外，Jae-Seon So等人報導：乳酪乳桿菌(Lactobacillus casei )的口服投藥會抑制膠原蛋白誘發關節炎(collagen-induced arthritis,CIA)以及降低腳掌腫脹(paw swelling)、淋巴細胞浸潤(lymphocyte infiltration)和軟骨組織的破壞(destruction of cartilage tissue)。乳酪乳桿菌透過CD4⁺ T細胞而降低第II型膠原蛋白-反應性前發炎性分子(IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12、IL-17、IFN-γ、TNF-α以及Cox-2)。乳酪乳桿菌投藥亦降低NF-κB至細胞核內的移位(translocation)以及CII-反應性Th1-型IgG同型(CII-reactive Th1-type IgG isotypes) IgG2a和IgG2b，同時上升調節免疫性IL-10位準(Jae-Seon Soet al. (2008),Mol. Immunol. ,45(9):2690-2699;Epub 2008 Feb 19)。

如果類風濕性關節炎可以透過服用乳桿菌分離株來達到治療效果，應可為病患提供一用藥安全而且價格不貴的藥品。

為達到這個目的，申請人從本土的成人胃腸道檢體中篩選出兩株乳桿菌分離株，它們在種系上(phylogenetically)是不同於各自所屬物種中已公開的菌株，而且具有能夠刺激產生大量的IL-10以及較少量的IFN-γ和/或TNF-α的抗發炎活性，因而被預期可供用於治療與發炎有關聯的疾病，包括，但不限於，類風濕性關節炎。

於是，在第一個方面，本發明提供一種具有抗發炎活性的乳桿菌屬物種(Lactobacillus sp. )的分離株(isolated strain)，其中該分離株是：

(i)　一選自於下列的寄存菌株：

(a)　沙克乳桿菌(Lactobacillus sakei ) GMNL-76，其以寄存編號BCRC 910355被寄存於食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心，以及以寄存編號CCTCC M 207153被寄存於中國典型培養物保藏中心；以及

(b)　羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri ) GMNL-89，其以寄存編號BCRC 910340被寄存於食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心，以及以寄存編號CCTCC M 207154被寄存於中國典型培養物保藏中心；或

(ii)　在(i)項中的該寄存菌株的繼代培養後代(sub-cultured offspring)。

在第二個方面，本發明提供一種食品產品(food product)，其包含有一如上所述的乳桿菌屬物種的分離株以及一可食性材料(edible material)。

在第三個方面，本發明提供一種可用於治療和/或緩和一與發炎有關聯的疾病的藥學組成物，其包含有一如上所述的乳桿菌屬物種的分離株。

在第四個方面，本發明提供一種用於治療一個體的一個與發炎有關聯的疾病的方法，其包括對一需要該治療的個體投藥(administering)一如上所述的乳桿菌屬物種的分離株。

本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯。

發明的詳細說明

要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家之中，該前案刊物形成本技藝中的一般常見知識之一部分。

為了這本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。

除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。

類風濕性關節炎是一種全身性的慢性疾病(systemic chronic disease)，但目前臨床上所用的藥物並無法有效地治療類風濕性關節炎，而且長期使用該等藥物還會引起非所欲的不利副作用。

此外，先前的研究指出：與Th1細胞有關的前發炎性細胞激素(諸如IFN-γ以及TNF-α)會促進發炎而使得類風濕性關節炎的病況更為惡化，而與Th2細胞有關的免疫調節性細胞激素(諸如IL-10與IL-4)可以抑制前發炎性細胞激素的生成以及可透過誘導TIMPs的生成來減少軟骨破壞。因此，吾人推論：類風濕性關節炎的治療也許可以藉由調控免疫調節性細胞激素以及前發炎性細胞激素的分泌量來達成。

乳酸菌(lactic acid bacteria)，特別是乳桿菌屬的菌株(bacterial strains of the genusLactobacillus )，是為人所熟悉與廣泛使用的益生性微生物(probiotic microbes)，它們已被證實具有許多有益於宿主(host)健康的功效，例如：增進腸道微生物群的菌相平衡、預防腹瀉(diarrhea)、降低結腸癌(colon cancer)的危險性、刺激胃腸上皮黏膜系統的正常發展與功能、產生各種維生素與營養素以及預防與治療陰道炎(vaginosis)等。

因此，申請人嘗試從被視為是益生性微生物的乳酸菌當中找出具有有利的抗發炎活性的乳桿菌分離株來供治療類風濕性關節炎。

於是，申請人以來自台灣健康成人的胃腸道檢體(gastrointestinal tract specimens)作為乳桿菌分離株的分離來源，並將所得到的分離株分別地與實驗動物的單核細胞(monocytes)進行共培養(co-culture)以刺激單核細胞分泌細胞激素，然後使用IL-10以及IFN-γ作為篩選標記(screening markers)，而篩選出能夠刺激單核細胞分泌大量的IL-10以及較少量的IFN-γ和/或TNF-α的兩株乳桿菌分離株GMNL-76以及GMNL-89，它們經特徵鑑定而分別地被歸屬於沙克乳桿菌(Lactobacillus sakei )以及羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri )。

沙克乳桿菌GMNL-76以及羅伊氏乳桿菌GMNL-89已分別於2007年6月14日以及2006年11月14日以寄存編號BCRC 910355與BCRC 910340被寄存於台灣的食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute,FIRDI)的生物資源保存及研究中心(Biosource Collection and Research Center,BCRC)(300新竹市食品路331號，台灣)。這兩個分離株亦有依據布達佩斯條約(Budapest Treaty)的規定，於2007年11月19日分別以寄存編號CCTCC M 207153與CCTCC M 207154被寄存於中國典型培養物保藏中心(China Center for Type Culture Collection,CCTCC)(武漢，武漢大學，430072，中華人民共和國)。

當本發明的沙克乳桿菌GMNL-76以及羅伊氏乳桿菌GMNL-89被餵食給帶有膠原蛋白誘發的關節炎(collagen-induced arthritis)的大鼠時，可觀察到大鼠血清中的IL-10升高而IFN-γ與TNF-α降低，這顯示本發明的乳桿菌分離株GMNL-76以及GMNL-89能夠使大鼠的關節發炎狀況不再惡化。

相較於習知菌株沙克乳桿菌BCRC 12933與BCRC 17500以及羅伊氏乳桿菌BCRC 14625、BCRC 16090、BCRC 16091、BCRC 17476與BCRC 17478，沙克乳桿菌GMNL-76與羅伊氏乳桿菌GMNL-89在活體外刺激單核細胞分泌IL-10的能力分別地要比它們各自所屬物種的習知菌株為佳。

基於上述的有利生物活性，本發明的兩株乳桿菌分離株或它們的繼代培養後代被預期具有可用於治療一與發炎有關聯的疾病的潛力。於是，本發明提供一種用於治療一與發炎有關聯的疾病的藥學組成物，其包含有：

(i)　至少一種選自於下列的寄存菌株：

(a)　沙克乳桿菌GMNL-76，其以寄存編號BCRC 910355被寄存於食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心，以及以寄存編號CCTCC M 207153被寄存於中國典型培養物保藏中心；以及

(b)　羅伊氏乳桿菌GMNL-89，其以寄存編號BCRC 910340被寄存於食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心，以及以寄存編號CCTCC M 207154被寄存於中國典型培養物保藏中心；或

(ii)　在(i)項中的該寄存菌株的繼代培養後代。

本發明亦提供一種用於治療一個體的一與發炎有關聯的疾病的方法，其包括對一需要該治療的個體投藥一如上所述的乳桿菌屬分離株或其繼代培養後代。

依據本發明，該與發炎有關聯的疾病是選自於下列所構成的群組：類風濕性關節炎、骨關節炎(osteoarthritis)、幼年型類風濕性關節炎(juvenile rheumatoid arthritis)、僵直性脊椎炎(ankylosing spondylitis)、脊椎炎(spondylitis)、乾癬性關節炎(psoriatic arthritis)、克隆氏症(Crohn’s disease)、潰瘍性大腸炎(ulcerative colitis)以及牛皮癬(psoriasis)(Eveline Trachselet al .(2007),Arthritis Research & Therapy ,9(1): R9,Published online 2007 January 29. doi: 10.1186/ar2115;Suchita Nadkarniet al .(2007),The Journal of Experimental Medicine ,204:33-39;Richard O Williamset al .(2007),Current Opinion in Pharmacology ,7:412-417)。在本發明的一個較佳具體例中，該與發炎有關聯的疾病是類風濕性關節炎。

依據本發明的藥學組成物可利用熟習此藝者所詳知的技術，將上述的乳桿菌分離株或其繼代培養後代配製於一藥學上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable vehicle)中，然後製成一適用於口服投藥(oral administration)的劑型(dosage form)。在本發明的一個較佳具體例中，該藥學組成物是呈一選自於下列群組中的劑型：溶液(solution)、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、粉末(powder)、錠劑(tablet)、丸劑(pill)、糖漿(syrup)、口含錠(lozenge)、片劑(troche)、口嚼膠(chewing gum)、膠囊(capsule)、濃漿(slurry)以及類似之物。

如本文中所用的，術語“藥學上可接受的載劑”意指一種當被投藥時不會在被投予的個體內造成一過敏性反應或其它非所欲之效用的載劑。依據本發明，該藥學上可接受的載劑可包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤滑劑(lubricant)以及類似之物。

此外，本發明的沙克乳桿菌GMNL-76以及羅伊氏乳桿菌GMNL-89亦被發現具有耐膽鹽與耐胃酸特性，因而適用於作為一種胃腸道益生菌。例如，該等分離株或其繼代培養後代可被當作食品添加成分(food additive)，藉由習知方法於原料製備時添加，或是不參與發酵而於發酵製程之後添加，而與任一種可食性材料被配製成供人類與非人類動物攝食的食品產品。

因此，本發明亦提供一種食品產品，其包含有一如上所述的乳桿菌分離株或其或其繼代培養後代以及一可食性材料。

適用於本發明的可食性材料包括，但不限於：流體乳品(fluid milk products)，例如牛奶(milk)、濃縮牛奶(concentrated milk)；發酵乳品(fermented milk)，例如優酪乳(yogurt)、酸乳(sour milk)、冷凍優格(frozen yogurt)、乳酸菌發酵飲料(lactic acid bacteria-fermented beverages)；奶粉(milk powder)；冰淇淋(ice cream)；乳酪(cream cheeses)；乾酪(dry cheeses)；豆奶(soybean milk)；發酵豆奶(fermented soybean milk)；蔬果汁(vegetable-fruit juices)；果汁(fruit juices)；運動飲料(sports drinks)；甜點(confectionery)；果凍(jellys)；糖果(candies)；嬰兒食品(infant formulas)；健康食品(health foods)；動物飼料(animal feeds)；膳食補充品(dietary supplements)等等。

此外，依據本發明的食品產品可被製造成當中含有可直接食用的冷凍乾燥(lyophilized)或噴霧乾燥(spray-dried)菌體粉末的即溶沖泡食品(instant food)的形式。有關食品產品的製備，可以參見，例如US 6,872,565 B2、US 7,244,424 B2、US 7,270,994 B2、US 7,172,777 B2以及US 6,872,411 B1。

依據本發明的食品產品可進一步包含有至少一種益生性微生物(probiotic microbes)。如本文中所用的，“益生性微生物”或“益生菌(probiotics)”等術語可被相互交換使用，且意指活性微生物(live microorganisms)的製備物(preparation)，當被一人類或動物攝食(ingested)之後，該等微生物可以維持(remain)並存活在胃腸道之中，而且能夠提供疾病的預防與治療。

適用於本發明的益生性微生物包括，但不限於：乳桿菌屬物種(Lactobacillus sp. )、雙叉桿菌屬物種(Bifidobacterium sp. )、鏈球菌屬物種(Streptococcus sp. )、酵母菌(yeasts)，以及它們的組合。

較佳地，該乳桿菌屬物種是選自於下列所構成的群組：嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus )、乳酸乳桿菌(Lactobacillus lactis )、瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus )、短乳桿菌(Lactobacillus brevis )、乳酪乳桿菌(Lactobacillus casei )、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum )、唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius )、雙歧乳桿菌(Lactobacillus bifidus )、保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus )、高加索乳桿菌(Lactobacillus caucasicus )、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus )、加氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri )，以及它們的組合。

較佳地，該雙叉桿菌屬物種是選自於下列所構成的群組：雙叉型雙叉桿菌(Bifidobacterium bifidum )、長型雙叉桿菌(Bifidobacterium longum )、嬰兒型雙叉桿菌(Bifidobacterium infantis )、短型雙叉桿菌(Bifidobacterium breve )、青春雙叉桿菌(Bifidobacterium adolescentis )、乳酸雙叉桿菌(Bifidobacterium lactis )，以及它們的組合。

較佳地，該鏈球菌屬物種是選自於下列所構成的群組：嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus )、乳酸鏈球菌(Streptococcus lactis )、乳酪鏈球菌(Streptococcus cremoris )、雙乙醯鏈球菌(Streptococcus diacetylcatis )，以及它們的組合。

較佳地，該酵母菌是選自於下列所構成的群組：乳酒假絲酵母菌(Candida Kefyr )、弗羅稜酵母菌(Saccharomyces florentinus )、啤酒酵母菌(Saccharomyces cereviseae )，以及它們的組合。

較佳實施例的詳細說明

本發明將就下面的實施例來作進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。

實施例1.　具有抗發炎活性的乳桿菌分離株的初步篩選 實驗材料與方法： A.　試驗菌株的來源與製備：

申請人於91年2月經由中國醫藥大學附設醫院(台中市，台灣)取得眾多健康成人的胃腸道檢體，並從該等檢體中分離出4百餘株的乳桿菌分離株。為尋找具有可用於治療類風濕性關節炎的潛力的益生菌，申請人對該等乳桿菌分離株進行抗發炎活性分析，並使用IL-10作為篩選標記。

各試驗菌株被接種至Bacto乳桿菌MRS肉湯培養基(BactoLactobacilli MRS BROTH)(DIFCO,Cat. No. 0881)內，然後於37℃下被厭氧培養歷時12至18小時。所形成的細菌培養物以4,000 rpm來離心歷時15分鐘，倒除上清液，而沉澱物(precipitate)以1倍(1X)的磷酸緩衝鹽水溶液(phosphate buffered saline,PBS)予以清洗共計3次，然後被散浮於1X PBS中。所形成的菌液以1X PBS來調整濃度至1~5×10⁹ 細胞/mL(以OD₆₀₀ 來進行菌數計數，OD₆₀₀ =1.00=5.0×10⁸ 細胞/mL)，並以之作為原液(stock solution)來進行10倍連續稀釋(10-fold serial dilution)，而生成10⁸ 、10⁷ 、10⁶ 、10⁵ 、10⁴ 、10³ 、10² 、10¹ 細胞/mL的試驗菌液來供隨後的實驗之用。

B.　小鼠脾臟單核細胞(mouse spleen monocytes)的製備：

以CO₂ 犧牲6~8週齡的雌性BALB/c小鼠，取出脾臟並以經滅菌的玻棒研磨。研磨後的脾臟組織與Ficoll-Paque^TM PLUS(17-1441-03,Amersham Biosciences)以1：1的體積比(volume ratio)來進行密度梯度離心(density gradient centrifugation)(720 g×20 min，在4℃下)。之後，紅血球被移除，而由此得到的小鼠脾臟單核細胞以含有10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的RPMI 1640培養基(RPMI 1640 medium)來調整細胞濃度至4×10⁶ 細胞/mL備用。

C.　乳桿菌分離株刺激小鼠脾臟單核細胞分泌IL-10的評估：

對96井的培養盤的各井予以加入100 μL的上述B項中所製備的小鼠脾臟單核細胞樣品，並分成3組來分別加入：(1)試驗組，20 μL的上述A項中所製備的試驗菌液(1×10⁷ 細胞/mL)；(2)正常對照組(normal control)，20 μL的含有10% FBS的RPMI 1640培養基；以及(3)正對照組(positive control)，20 μL的脂多醣(lipopolysaccharides,LPS)[大腸桿菌(Escherichia coli )血清型(serotype) O55:B5，Sigma]。在培養箱(37℃，5% CO₂ )中進行培養歷時24小時之後，各井內的培養液被離心，並從所收取的上清液取出100 μL來進行使用Mouse IL-10 OptEIA^TM Set(BD Biosciences,Cat. No. 555252)的酵素結合免疫吸附分析(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)。各組的實驗被重複兩次。

IL-10的濃度是藉由將ELISA試驗所測得的OD₄₀₅ 數值代入下列公式來計算，並以ELISA單位(ELISA unit)(%)來表示：

ELISA單位(%)=[(A-C)/(B-C)]×100

其中：A=乳桿菌分離株的OD₄₀₅ 數值

B=正對照組的OD₄₀₅ 數值

C=正常對照組的OD₄₀₅ 數值

結果：

在所有的試驗菌株當中，有46株會刺激小鼠脾臟單核細胞分泌較高數量的IL-10，它們的實驗結果被顯示於表1中。

根據表1所示的實驗結果，並同時考量這46株試驗菌株的生長速度、菌數以及在量產上的實用性等因素後，申請人選出GMNL-19、GMNL-76、GMNL-78、GMNL-89、GMNL-94、GMNL-101以及GMNL-161來作進一步試驗，以評估它們在刺激人類周邊血液單核細胞(human peripheral blood mononuclear cells,human PBMCs)分泌IL-10與IFN-γ上的能力。

實施例2.　乳桿菌分離株刺激人類PBMCs分泌IL-10與IFN-γ能力的評估 實驗材料與方法： A.　人類周邊血液單核細胞的製備：

取經檢驗合格供實驗用的人類白血球濃縮液(human white blood cell concentrate)(台南捐血中心)與Ficoll-Paque^TM PLUS(17-1441-03,Amersham Biosciences)以1：1的體積比來進行密度梯度離心(720 g×20 min，在4℃下)。之後，紅血球被移除，而由此得到的人類PBMCs以含有10% FBS的RPMI 1640培養基來調整細胞濃度至4×10⁶ 細胞/mL備用。

B.　乳桿菌分離株刺激人類PBMCs分泌IL-10的評估：

乳桿菌分離株GMNL-19、GMNL-76、GMNL-78、GMNL-89、GMNL-94、GMNL-101以及GMNL-161刺激人類PBMCs分泌IL-10的能力大體上是參照實施例1的“實驗材料與方法”的C項“乳桿菌分離株刺激小鼠脾臟單核細胞分泌IL-10的評估”當中所述的操作程序來作評估，不同之處在於：以20 μL之具有一濃度為1×10⁸ 細胞/mL的試驗菌液作為試驗組，並且使用100 μL的上述A項中所製備的人類PBMCs樣品以及Human IL-10 OptEIA^TM Set(BD Biosciences,Cat. No. 555157)。

C.　乳桿菌分離株刺激人類PBMCs分泌IFN-γ的評估：

乳桿菌分離株GMNL-19、GMNL-76、GMNL-78、GMNL-89、GMNL-94、GMNL-101以及GMNL-161刺激人類PBMCs分泌IFN-γ的能力是依照下面所述來作分析。

對96井的培養盤的各井予以加入100 μL的上述A項中所製備的人類PBMCs樣品，並分成兩組來分別加入：(1)試驗組，20 μL的實施例1的“實驗材料與方法”的A項“試驗菌株的來源與製備”當中所製備的試驗菌液(1×10⁷ 細胞/mL)；以及(2)正常對照組(normal control)，20 μL的含有10% FBS的RPMI 1640培養基。在培養箱(37℃，5% CO₂ )中進行培養歷時24小時之後，各井內的培養液被離心，並從所收取的上清液取出100 μL來進行使用BD OptEIA^TM Human IFN-γ ELISA Kit II(BD Biosciences,Cat. No. 550612)的IFN-γELISA。

另外，將人類PBMCs樣品以4×10⁶ 細胞/mL添加10 μg/mL菜豆凝集素(Phaseolus vulgaris agglutinin,PHA)(Sigma，Cat. No. L2769)的比例來進行共同培養歷時48小時。在離心(720 g×20 min，在4℃下)之後，將上清液分裝保存於-80℃冰箱備用。當進行IFN-γELISA分析時，該經過PHA處理的上清液(100 μL)被使用作為內部正對照組(internal positive control)。

以微量分注器(microdispenser)將經過塗覆緩衝液(coating buffer)(0.1 M Na₂ HPO₄ ,0.77 mM NaN₃ ,pH 9.0)予以稀釋1000倍的100 μL小鼠抗人類IFN-γ(mouse anti-human IFN-γ,BD Pharmingen^TM ,Cat. No. 551221)加入至一個96井的培養盤(Nunc-Immuno^TM 96 MicroWell^TM Plates,MaxiSorp,Cat. No. 442404)的各井中，於室溫(25℃)下以40 rpm振盪該培養盤歷時1小時，然後將該培養盤置於4℃下過夜。

之後，將該培養盤回溫並移除各井中的液體，然後以清洗緩衝液(washing buffer)(含有0.05% Tween 20的PBS)來清洗各井2次(每次3分鐘)，繼而於每井內加入200 μL的封阻緩衝液(blocking buffer)[含有3%牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)的PBS]，並靜置於室溫下歷時2小時，隨後移除封阻緩衝液並以清洗緩衝液予以清洗2次。

將100 μL的待測樣品加入各井中，並於4℃下反應過夜。之後，移除各井中的液體，以清洗緩衝液予以清洗2次，然後將經過稀釋緩衝液(diluent buffer)(含有1% BSA的PBS)予以稀釋2000倍的100 μL生物素小鼠抗-人類IFN-γ(biotin mouse anti-human IFN-γ,BD Pharmingen^TM ,Cat. No. 554550)加入至各井內，並於室溫下反應歷時2小時。在以清洗緩衝液清洗2次之後，加入經過稀釋緩衝液予以稀釋2000倍的100 μL鏈黴抗生物素蛋白-鹼性磷酸酶(Streptavidin-Alkaline phophatase,Streptavidin-AP,BD Pharmingen^TM ,Cat. No. 554065)，並於室溫下反應歷時1小時。在移除各井中的液體之後，以清洗緩衝液予以清洗4次，然後將100 μL新鮮配製的p-硝基苯基磷酸(p-Nitrophenylphosphate,pNPP)溶液加入至各井中。於室溫下將培養盤置於暗處以進行呈色反應歷時30分鐘。之後，以ELISA Microplate Reader (Bio-Rad,Model 550)來讀取各井在波長405 nm下的吸光值(OD₄₀₅ )。各組的實驗被重複兩次。

IFN-γ的濃度是藉由將ELISA試驗所測得的OD₄₀₅ 數值代入下列公式來計算，並以ELISA單位(ELISA unit)(%)來表示：

ELISA單位(%)=[(A-C)/(B-C)]×100

其中：A=乳桿菌分離株的OD₄₀₅ 數值

B=內部正對照組的OD₄₀₅ 數值

C=正常對照組的OD₄₀₅ 數值

結果：

乳桿菌分離株GMNL-19、GMNL-76、GMNL-78、GMNL-89、GMNL-94、GMNL-101以及GMNL-161刺激人類周邊血液單核細胞分泌IL-10與IFN-γ的結果被分別地顯示於表2與表3中。

從表2可見，在所有的乳桿菌分離株中，乳桿菌分離株GMNL-76與GMNL-89刺激人類周邊血液單核細胞分泌IL-10的數量最高，這顯示這兩個分離株對於刺激人類周邊血液單核細胞分泌IL-10的能力是最佳的。

另從表3可見，在所有的乳桿菌分離株中，乳桿菌分離株GMNL-78刺激人類周邊血液單核細胞分泌IFN-γ的數量最低，而GMNL-89以及GMNL-76次之，這顯示乳桿菌分離株GMNL-78對於刺激人類周邊血液單核細胞分泌IFN-γ的能力是最差的，而乳桿菌分離株GMNL-89以及GMNL-76對於刺激人類周邊血液單核細胞分泌IFN-γ的能力也是較差的。

已知前發炎性細胞激素(諸如IFN-γ與TNF-α)會促進發炎而使得類風濕性關節炎的病況更為惡化，而免疫調節性細胞激素(諸如IL-10)可以抑制前發炎性細胞激素的生成。申請人據此而推論：若能夠刺激人類或動物的單核細胞分泌較多的免疫調節性細胞激素以及較少的前發炎性細胞激素，應會有利於改善患有RA的人類或動物的病況。而根據表2與表3所示的結果，申請人認為乳桿菌分離株GMNL-76以及GMNL-89是最具開發潛力的菌株，並以之來進行下面的動物試驗。

實施例3.　乳桿菌分離株GMNL-76以及GMNL-89對於帶有膠原蛋白誘發的關節炎的大鼠的治療效用評估 實驗材料與方法： A.　實驗動物：

得自於國家實驗研究院實驗動物中心(National Applied Research Laboratories National Laboratory Animal Center)的雄性LEW/SsNNarl大鼠(6週大，體重為大約200至250 g)被使用於下面的實驗中。所有的實驗動物被飼養於一個光照與黑暗各為12小時、室溫維持在25±1℃以及濕度維持在60±5%的獨立空調的動物房內，而且水分與飼料被充分地供給。動物被給予一週的期間去適應環境，待動物穩定之後才開始進行試驗。有關實驗動物的處理以及一切實驗程序均依據實驗動物委員會的標準章程規範來進行。

B.　試驗菌株的製備：

將乳桿菌分離株GMNL-76以及GMNL-89分別地接種於Bacto乳桿菌MRS肉湯培養基(DIFCO,Cat. No. 0881)中，於37℃下厭氧培養至飽和生長狀態。在以3,000g離心歷時15分鐘之後，沉澱物分別以2 mL與1 mL的1X PBS(pH7.2)來清洗2次，然後加入1 mL的PBS，並以OD₆₀₀ 來測量測量菌液濃度，結果均有達1.0×10¹⁰ 細胞/mL左右。將菌液(1X PBS)冷凍保存於-80℃下備用。

C.　關節炎的誘發：

有關於關節炎的誘發是參考Y. Kameyamaet al. (2004),Bone, 35:948-956當中所述的方法來進行，並略作修改。將牛第II型膠原蛋白(bovine type II collagen，簡稱為CII)(Sigma-Aldrich,Cat. No. C1188)溶於0.05 M醋酸溶液中以配製具有一濃度為2 mg/mL的CII溶液。以100 μL的CII溶液添加100 μL的完全弗倫氏佐劑(Complete Freund’s Adjuvant,CFA)的方式來配製一個CII乳化液。之後，將200 μL的CII乳化液皮下注射至大鼠尾巴內來做第1次免疫，並於免疫21天後再追加免疫(boost)一次。

D.　乳桿菌分離株的餵食：

大鼠被隨機地分成4組(每組n=6)，其中包括3個實驗組[GMNL-76組、GMNL-89組與安慰劑(placebo)組]以及一個對照組。除了對照組之外，其它各組的大鼠均有依照上述C項“關節炎的誘發”當中所述的方法來誘發關節炎的發生。

對於GMNL-76組以及GMNL-89組，從追加免疫後的第7天起，大鼠被餵食以上述B項“試驗菌株的製備”當中所製備的菌液(1.0×10¹⁰ 細胞/mL/天)。至於安慰劑組以及對照組的大鼠，牠們被餵食以逆滲透水。

在連續餵食8週之後，藉由眼採血(orbital bleeding)來收集大鼠的血液並進行離心，而由此得到的血清被用來測定IL-10、IFN-γ以及TNF-α的濃度。另外，經眼採血的各組大鼠被進一步用來進行下面的關節炎評估。

E.　IL-10、IFN-γ以及TNF-α的濃度測定：

IL-10的濃度測定大體上是參照實施例1的“實驗材料與方法”的C項“乳桿菌分離株刺激小鼠脾臟單核細胞分泌IL-10的評估”當中所述的操作程序來作評估，但是使用上面D項中所得到的大鼠血清以及Rat IL-10 OptEIA^TM Set(BD Bioscience PharMingen,San Diego,CA,Cat. No. 2611KI)。

IFN-γ的濃度測定大體上是參照實施例2的“實驗材料與方法”的C項“乳桿菌分離株刺激人類PBMCs分泌IFN-γ的評估”當中所述的操作程序來作評估，但是使用上面D項中所得到的大鼠血清以及Rat IFN-γ OptEIA^TM Set(BD Bioscience PharMingen,San Diego,CA)。

TNF-α的濃度測定大體上是參照實施例1的“實驗材料與方法”的C項“乳桿菌分離株刺激小鼠脾臟單核細胞分泌IL-10的評估”當中所述的操作程序來作評估，但是使用上面D項中所得到的大鼠血清以及BD OptEIA Rat TNF-α ELISA Kit(BD Bioscience PharMingen,San Diego,CA)。

由此所測得的OD₄₀₅ 數值接而分別根據預先以具有不同已知濃度的IL-10、IFN-γ或TNF-α標準品相對於它們自身的OD₄₀₅ 數值所作出的相關曲線(correlation curve)而被換算成濃度(pg/mL)來表示。

F.　關節炎的評估(Evaluation of arthritis)：

經眼採血的各組大鼠被用來進行下面的關節炎評估，而有關大鼠的關節炎評估是參照Y. Kameyamaet al. (2004),Bone ,35:948-956當中所述的方法來進行。簡言之，記錄大鼠的四隻腳掌關節的紅腫、脹大等變化情形，並以下列5種計分(score)來作為區別的依據：計分0，未表現任何關節炎症狀；計分1，有1個腳趾腫脹；計分2，有3個以上的腳趾腫脹；計分3，整個腳掌腫脹；以及計分4，所有的關節均嚴重腫脹，無法正常行走而呈蜷縮狀。

G.　統計分析方法：

本實施例採用SPSS統計軟體(10.0版)來進行統計分析。由於實驗動物的總樣本數少於30，所得到的實驗數據是以無母數統計方法(nonparametric statistical methods)[亦稱為曼-懷特尼U檢定(Mann-Whitney U test)]來作分析，俾以評估對照組、GMNL-76組以及GMNL-89組分別與安慰劑組之間在樣本分布上的差異。實驗數據是以平均值±偏差值來表示(統計顯著性，P＜0.05)。

結果：

各組大鼠在歷經連續8週的餵食後，血清中的IL-10、IFN-γ以及TNF-α之濃度被分別地顯示於表4以及圖1至圖3中。另外，關節炎評估的計分結果亦被歸納於表4中。

從表4以及圖1至圖3可見，GMNL-76組與GMNL-89組的大鼠在分別被餵食以乳桿菌分離株GMNL-76與GMNL-89後，牠們血清中的IFN-γ以及TNF-α濃度相較於安慰劑組有顯著的降低，而IL-10濃度則有顯著的增加。

因此，申請人推論：乳桿菌分離株GMNL-76以及GMNL-89除了能夠降低Th1細胞所分泌的IFN-γ以減輕發炎現象外，也可以降低TNF-α的分泌量，進而減少基質金屬蛋白酶(MMPs)的分泌量，使得關節組織中的軟骨不會再繼續受到破壞。另外，乳桿菌分離株GMNL-76以及GMNL-89亦能提高免疫調節性細胞激素IL-10的分泌量，而讓發炎的情況受到控制。因此，雖然關節炎所造成的關節損害已無法回復，但是透過餵食本發明的乳桿菌分離株GMNL-76以及GMNL-89，在大鼠的血清中，與發炎相關聯的IFN-γ以及TNF-α已有降低的情形，而與抗發炎相關聯的IL-10則有上升的情形，這表示大鼠的關節炎病況能夠獲得減輕並且不再繼續惡化。

實施例4.　乳桿菌分離株GMNL-76與GMNL-89的特徵鑑定

為了確認在上面實施例中所篩選出的乳桿菌分離株GMNL-76以及GMNL-89之所屬菌種，進行下面的初步試驗、16S rDNA序列分析以及隨機擴增的多型性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD)分析。

實驗材料與方法： A.　初步試驗：

對乳桿菌分離株GMNL-76以及GMNL-89進行初步試驗，試驗項目包括：革蘭氏染色(gram staining)、型態觀察(morphological observation)、過氧化氫酶反應、運動性(mobility)、在好氧(aerobic)與厭氧(anaerobic)條件下之生長情形等試驗。

B. 16S rDNA序列分析：

於無菌條件下，將乳桿菌分離株GMNL-76以及GMNL-89分別地接種於1 mL的Bacto乳桿菌MRS肉湯培養基(DIFCO,Cat. No. 0881)中，並於37℃下培養隔夜。之後，菌液以13,000 rpm來進行離心歷時1分鐘，繼而移除上清液。留下的沉澱物予以加入200 μL的ddH₂ O以充分散浮菌體，以13,000 rpm來進行離心歷時1分鐘之後移除上清液，並重複此步驟1次。最後，以200 μL ddH₂ O來散浮經離心而得到的沉澱物，其中含有該等乳桿菌分離株的基因組DNA(genomic DNA)。

以所得到的基因組DNA作為模版(template)並使用一組被發表於P. S. M. Yeunget al. (2002),J. Dairy Sci. ,85:1039-1051中的針對乳桿菌的16S rDNA而被設計之具有下面所示核苷酸序列的引子對(primer pair) PAF引子與536R引子來進行使用下面表5中所示的反應條件之聚合酶鏈反應(PCR)。

PAF引子

(序列辨識編號：1)

536R引子

(序列辨識編號：2)

於完成PCR之後，藉由1.8%瓊脂糖凝膠電泳(agarose gel electrophoresis)來確認有否得到一大小約為500 bp的PCR擴增產物，並從凝膠回收純化該經確認的PCR產物。該經純化的PCR產物是委託基龍米克斯生物科技股份有限公司(台灣)來進行定序，而所得到的定序結果是利用NCBI網站中的核苷酸-核苷酸BLAST(nucleotide-nucleotide BLAST)軟體來進行比對分析。

C.　隨機擴增的多型性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD)分析：

在以16S rDNA序列分析確認乳桿菌分離株GMNL-76以及GMNL-89所屬物種之後，以上述B項中所得到的乳桿菌分離株GMNL-76以及GMNL-89的基因組DNA作為模版，並選用一個被發表於M. DE ANGELISet al .(2001),Applied and Environmental Microbiology ,67:2011-2020中之具有下面所示核苷酸序列的10-員引子(10-mer primer) Lac P2來進行使用下面表6中所示的反應條件之PCR反應。

LacP2引子

(序列辨識編號：3)

於完成PCR之後，擴增產物以1.8%瓊脂糖凝膠(agarose gel)來進行電泳(electrophoresis)，繼而染色，然後於紫外光下作觀察並照相。

在這個實驗中，同時使用購自於食品工業發展研究所(FIRDI)的生物資源保存及研究中心(BCRC)的7株乳桿菌菌株作為比較菌株來進行比對分析，它們分別為：

1.　沙克乳桿菌沙克亞種(Lactobacillus sakei subsp. sakei ) BCRC 12933(對應於ATCC 31063，分離來源為酸菜)；

2.　沙克乳桿菌肉質亞種(Lactobacillus sakei subsp. carnosus )_BCRC 17500(對應於LMG 17302，分離來源為生香腸)；

3.　羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri ) BCRC 14625(對應於ATCC 23272與DSM 20016，分離來源為人類糞便)；

4.　羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri ) BCRC 16090[對應於DSM 20015，分離來源為糞肥(manure)]；

5.　羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri ) BCRC 16091(對應於DSM 20053，分離來源為人類糞便)；

6.　羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri ) BCRC 17476(對應於JCM 1081，分離來源為雞腸)；以及

7.　羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri ) BCRC 17478[對應於JCM 2762，分離來源為發酵的糖蜜(fermented molasses)]。

結果： 1.　乳桿菌分離株GMNL-76的特徵鑑定：

(i)　依據初步試驗結果，此分離株為革蘭氏陽性桿菌，不具運動性，不具觸酶(catalase)，不具氧化酶(oxidase)，於好氧及厭氧環境下均可生長；

(ii)　此分離株的16S rDNA序列分析結果被顯示於圖4中，而經與NCBI網站中的基因資料庫比對後，發現此分離株的16S rDNA序列(序列辨識編號：4)與沙克乳桿菌(Lactobacillus sakei )的16S rDNA之序列相似度最高；以及

(iii)　此分離株的RAPD分析結果被顯示於圖5中。從圖5可見，此分離株的PCR產物的基因指紋圖譜與另外2株習知的沙克乳桿菌菌株所具有者不相同。

綜合以上鑑定結果，本發明的乳桿菌分離株GMNL-76被認為是一株新穎的沙克乳桿菌(Lactobacillus sakei )分離株。

2.　乳桿菌分離株GMNL-89的特徵鑑定：

(i)　依據初步試驗結果，此分離株為革蘭氏陽性桿菌，不具運動性，不具觸酶，不具氧化酶，於好氧及厭氧環境下均可生長；

(ii)　此分離株的16S rDNA序列分析結果被顯示於圖6中，而經與NCBI網站中的基因資料庫比對後，發現此分離株的16S rDNA序列(序列辨識編號：5)與羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri )的16S rDNA序列相似度最高；以及

(iii)　此分離株的RAPD分析結果被顯示於圖7中。從圖7可見，此分離株的PCR產物之基因指紋圖譜與另外5株習知的羅伊氏乳桿菌菌株所具有者不相同。

綜合以上鑑定結果，本發明的乳桿菌分離株GMNL-89被認為是一株新穎的羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri )分離株。

本發明的沙克乳桿菌(Lactobacillus sakei ) GMNL-76與羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri ) GMNL-89已分別於西元2007年6月14日以及2006年11月14日以寄存編號BCRC 910355以及BCRC 910340被寄存於食品工業發展研究所(FIRDI)的生物資源保存及研究中心(BCRC)(300新竹市食品路331號，台灣)。這兩個分離株亦有依據布達佩斯條約的規定，於2007年11月19日分別以寄存編號CCTCC M 207153與CCTCC M 207154被寄存於中國典型培養物保藏中心(CCTCC)(武漢，武漢大學，430072，中華人民共和國)。

實施例5.　乳桿菌分離株GMNL-76以及GMNL-89與習知菌株在刺激小鼠脾臟單核細胞分泌IL-10能力的評估

為了證明能夠刺激單核細胞分泌較多的IL-10是乳桿菌分離株GMNL-76以及GMNL-89所特有的生物活性，在下面的實施例中，它們被拿來與7株習知菌株(亦即購自於食品工業發展研究所的沙克乳桿菌BCRC 12933與BCRC 17500以及羅伊氏乳桿菌BCRC 14625、BCRC 16090、BCRC 16091、BCRC 17476與BCRC 17478)進行比較。

實驗材料與方法：

IL-10的濃度測定大體上是參照實施例1的“實驗材料與方法”的C項“乳桿菌分離株刺激小鼠脾臟單核細胞分泌IL-10的評估”當中所述的操作程序來作評估，並使用本發明的乳桿菌分離株GMNL-76與GMNL-89以及上述的7株習知菌株來進行實驗。由此所測得的OD₄₀₅ 數值接而分別根據預先以具有不同已知濃度的IL-10標準品相對於它們自身的OD₄₀₅ 數值所作出的相關曲線(correlation curve)而被換算成濃度(pg/mL)來表示。各菌株的實驗被重複2次，而且實驗數據是以平均值±偏差值來表示。

結果：

下面的表7顯示GMNL-76、GMNL-89以及各比較菌株刺激小鼠脾臟單核細胞分泌IL-10的結果。

從表7可見，在所有的試驗菌株當中，以本發明的乳桿菌分離株GMNL-89與習知菌株BCRC 17476對於刺激小鼠脾臟單核細胞分泌IL-10的能力最佳，而GMNL-76次之。表7所示的實驗結果亦再次地證明本發明的乳桿菌分離株GMNL-89以及GMNL-76與它們各自所屬物種的習知菌株是不相同的。

實施例6.　沙克乳桿菌GMNL-76與羅伊氏乳桿菌GMNL-89的耐酸性以及膽鹽耐受性試驗

為確認本發明的沙克乳桿菌GMNL-76以及羅伊氏乳桿菌GMNL-89在攝食之後是否能夠通過消化道的嚴苛條件而存活下來，一個模擬人類消化道之連續消化處理的實驗被進行。

實驗材料： 1.　MRS肉湯培養基(MRS broth)(pH=3)：

將55 g的MRS粉末(BD,Cat. No. 288130)溶於1 L的逆滲透水中並予以充分混合，接著以1 M HCl將pH值調整至3，繼而於121℃下進行滅菌歷時15分鐘，待冷卻之後備用。

2.　含有0.2%(w/v)牛膽汁的MRS肉湯培養基：

將55 g的MRS粉末溶於1 L的逆滲透水中並予以充分混合，繼而於121℃下進行滅菌歷時15分鐘。之後，待溫度降至大約45℃，加入2 g的牛膽汁粉末(ox gall powder,Sigma)並予以充分混合以得到一含有0.2%(w/v)牛膽汁的MRS肉湯培養基，繼而以一孔徑為0.45 μm的過濾膜予以過濾後備用。

3.　MRS瓊脂培養盤(MRS agar plate)：

將55 g的MRS粉末溶於1 L的逆滲透水中，待完全溶解之後予以加入15 g的瓊脂糖粉末(agarose powder)，然後將所形成的混合物倒入至1 L的血清瓶中並於121℃下進行滅菌歷時15分鐘。之後，待溫度降至45℃，在無菌操作條件下，將大約15至20 mL的MRS瓊脂溶液加入至各個無菌培養皿(petri dish)中，待冷卻凝固之後備用。

實驗方法： A.　耐酸性試驗(acid tolerance test)：

將3 mL的於實施例1的“實驗材料與方法”的A項“試驗菌株的來源與製備”當中所得到的試驗菌液接種至27 mL的MRS肉湯培養基(pH=3)中並充分混合，接而將所形成的培養物置於37℃下培養歷時3小時。之後，取出1 mL的培養物並以滅菌水來進行連續稀釋塗盤(10^-9 ~10^-1 )以檢測存活的菌數。

B.　膽鹽耐受性試驗(bile salt tolerance test)：

於上述A項的耐酸性試驗結束後，將剩餘的29 mL培養物以4,000 rpm離心歷時15分鐘，移除上清液並加入30 mL無菌水來散浮菌體。之後，以4,000 rpm離心歷時15分鐘並移除上清液，藉此洗除酸性的MRS肉湯培養基。之後，予以加入30 mL之含有0.2%(w/v)牛膽汁的MRS肉湯培養基以散浮菌體，繼而將所形成的培養物置於37℃下培養歷時3小時。之後，取出1 mL的培養物並以滅菌水來進行連續稀釋塗盤(10^-9 ~10^-1 )以檢測存活的菌數。

結果：

沙克乳桿菌GMNL-76與羅伊氏乳桿菌GMNL-89在經過模擬人類消化道的連續消化處理後的生長情況被顯示於下面的表8中。

從表8可見，當以pH=3的MRS肉湯培養基來培養本發明的兩株乳桿菌分離株歷時3小時之後，沙克乳桿菌GMNL-76的活菌數相較於處理前下降達大約99.95%，而羅伊氏乳桿菌GMNL-89的活菌數下降達大約64%。接著，這兩個乳桿菌分離株在含有0.2%牛膽汁的MRS肉湯培養基中被培養歷時另外3小時之後，活菌數並沒有下降的現象，兩者的存活率均極為優越。這個結果顯示：沙克乳桿菌GMNL-76與羅伊氏乳桿菌GMNL-89能夠克服人類消化道的環境壓力，在攝食後能有效到達腸內並定殖(colonization)於腸內。

於本案說明書中被引述之所有文獻資料以及專利文件以它們的整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案的詳細說明(包含界定在內)將佔上風。

雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。

<110>　景岳生物科技股份有限公司

<120>　具有抗發炎活性的乳桿菌分離株及其用途

<130>　GMNL-76和GMNL-89

<160>　5

<170>　PatentIn version 3.4

<210>　1

<211>　20

<212>　DNA

<213>　人工的

<220>

<223>　用於PCR擴增乳桿菌的16S rDNA的PAF引子

<400>　1

<210>　2

<211>　18

<212>　DNA

<213>　人工的

<220>

<223>　用於PCR擴增乳桿菌的16S rDNA的536R引子

<400>　2

<210>　3

<211>　10

<212>　DNA

<213>　人工的

<220>

<223>　用於PCR擴增乳桿菌基因的10-員引子

<400>　3

<210>　4

<211>　535

<212>　DNA

<213>　沙克乳桿菌(Lactobacillus sakei ) GMNL-76

<400>　4

<210>　5

<211>　522

<212>　DNA

<213>　羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri ) GMNL-89

<400>　5

圖1顯示帶有膠原蛋白誘發的關節炎的大鼠在經連續餵食本發明的乳桿菌分離株GMNL-76以及GMNL-89歷時8週之後被收集血清並進行IL-10的ELISA試驗的結果，其中不帶有關節炎並被餵食以逆滲透水的大鼠以及帶有關節炎但被餵食以逆滲透水的大鼠是分別作為對照組以及安慰劑組；

圖2顯示帶有膠原蛋白誘發的關節炎的大鼠在經連續餵食本發明的乳桿菌分離株GMNL-76以及GMNL-89歷時8週之後被收集血清並進行IFN-γ的ELISA試驗的結果，其中不帶有關節炎並被餵食以逆滲透水的大鼠以及帶有關節炎但被餵食以逆滲透水的大鼠分別是作為對照組以及安慰劑組；

圖3顯示帶有膠原蛋白誘發的關節炎的大鼠在經連續餵食本發明的乳桿菌分離株GMNL-76以及GMNL-89歷時8週之後被收集血清並進行TNF-α的ELISA試驗的結果，其中不帶有關節炎並被餵食以逆滲透水的大鼠以及帶有關節炎但被餵食以逆滲透水的大鼠是分別作為對照組以及安慰劑組；

圖4顯示本發明的乳桿菌分離株GMNL-76的16S rDNA核苷酸序列；

圖5顯示分別以本發明的乳桿菌分離株GMNL-76以及2株習知的沙克乳桿菌BCRC 12933與BCRC 17500的基因組DNA作為模板並使用Lac P2引子來進行隨機擴增的多型性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD)分析，繼而以1.8%瓊脂糖凝膠來進行電泳後，於紫外光下觀察所得到的照相結果，其中在(A)區中，徑M1：DNA階梯標記(DNA Ladder)(100-3000 bp)，徑1：GMNL-76；在(B)區中，徑M2：DNA階梯標記(100-3000 bp)，徑2：BCRC 12933；以及在(C)區中，徑M3：DNA階梯標記(100-3000 bp)，徑3：BCRC 17500；

圖6顯示本發明的乳桿菌分離株GMNL-89的16S rDNA核苷酸序列；以及

圖7顯示分別以本發明的乳桿菌分離株GMNL-89以及5株習知的羅伊氏乳桿菌BCRC 14625、BCRC 16090、BCRC 16091、BCRC 17476與BCRC 17478的基因組DNA作為模板並使用Lac P2引子來進行RAPD分析，繼而以1.8%瓊脂糖凝膠來進行電泳後，於紫外光下觀察所得到的照相結果，其中在(A)區中，徑M1：DNA階梯標記(100-3000 bp)，徑1：GMNL-89；在(B)區中，徑M2：DNA階梯標記(100-3000 bp)，徑2：BCRC 14625；在(C)區中，徑M3：DNA階梯標記(100-3000 bp)，徑3：BCRC 16090；在(D)區中，徑M4：DNA階梯標記(100-3000 bp)，徑4：BCRC 16091；在(E)區中，徑M5：DNA階梯標記(100-3000 bp)，徑5：BCRC 17476；以及在(F)區中，徑M6：DNA階梯標記(100-3000 bp)，徑6：BCRC 17478。

Claims (17)

1. 一種具有抗發炎活性的乳桿菌屬物種(Lactobacillus sp. )的分離株，其中該分離株是一沙克乳桿菌(Lactobacillus sakei ) GMNL-76，其以寄存編號BCRC 910355被寄存於食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心，以及以寄存編號CCTCC M 207153被寄存於中國典型培養物保藏中心。
2. 一種可用於治療和/或緩和一與發炎有關聯的疾病的藥學組成物，其包含：一沙克乳桿菌GMNL-76，其以寄存編號BCRC 910355被寄存於食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心，以及以寄存編號CCTCC M 207153被寄存於中國典型培養物保藏中。
3. 如申請專利範圍第2項的藥學組成物，其中該疾病是類風濕性關節炎。
4. 如申請專利範圍第2項的藥學組成物，其中該藥學組成物是呈一可供口服投藥的劑型。
5. 如申請專利範圍第4項的藥學組成物，其中該劑型是選自於下列所構成的群組：溶液、懸浮液、乳劑、粉末、錠劑、丸劑、糖漿、口含錠、片劑、口嚼膠、濃漿以及膠囊。
6. 一種如申請專利範圍第1項的乳桿菌屬物種的分離株供應用於製備一用以治療和/或緩和一與發炎有關聯的疾病的藥學組成物的用途。
7. 如申請專利範圍第6項的用途，其中該疾病是類風濕性關節炎。
8. 如申請專利範圍第6項的用途，其中該藥學組成物是呈一可供口服投藥的劑型。
9. 如申請專利範圍第8項的用途，其中該劑型是選自於下列所構成的群組：溶液、懸浮液、乳劑、粉末、錠劑、丸劑、糖漿、口含錠、片劑、口嚼膠、濃漿以及膠囊。
10. 一種食品產品，其包含有一如申請專利範圍第1項的乳桿菌屬物種的分離株以及一可食性材料。
11. 如申請專利範圍第10項的食品產品，其進一步包含有至少一種選自於下列群組中的益生性微生物：乳桿菌屬物種(Lactobacillus sp. )、雙叉桿菌屬物種(Bifidobacterium sp. )、鏈球菌屬物種(Streptococcus sp. )、酵母菌(yeasts)，以及它們的組合。
12. 如申請專利範圍第11項的食品產品，其中該乳桿菌屬物種是選自於下列所構成的群組：嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus )、乳酸乳桿菌(Lactobacillus lactis )、瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus )、短乳桿菌(Lactobacillus brevis )、乳酪乳桿菌(Lactobacillus casei )、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum )、唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius )、雙歧乳桿菌(Lactobacillus bifidus )、保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus )、高加索乳桿菌(Lactobacillus caucasicus )、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus )、加氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri )，以及它們的組合。
13. 如申請專利範圍第11項的食品產品，其中該雙叉桿菌屬物種是選自於下列所構成的群組：雙叉型雙叉桿菌(Bifidobacterium bifidum )、長型雙叉桿菌(Bifidobacterium longum )、嬰兒型雙叉桿菌(Bifidobacterium infantis )、短型雙叉桿菌(Bifidobacterium breve )、青春雙叉桿菌(Bifidobacterium adolescentis )、乳酸雙叉桿菌(Bifidobacterium lactis )，以及它們的組合。
14. 如申請專利範圍第11項的食品產品，其中該鏈球菌屬物種是選自於下列所構成的群組：嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus )、乳酸鏈球菌(Streptococcus lactis )、乳酪鏈球菌(Streptococcus cremoris )、雙乙醯鏈球菌(Streptococcus diacetylcatis )，以及它們的組合。
15. 如申請專利範圍第11項的食品產品，其中該酵母菌是選自於下列所構成的群組：乳酒假絲酵母菌(Candida Kefyr )、弗羅稜酵母菌(Saccharomyces florentinus )、啤酒酵母菌(Saccharomyces cereviseae )，以及它們的組合。
16. 如申請專利範圍第10項的食品產品，其中該可食性材料是選自於下列所構成的群組：流體乳品、發酵乳品、奶粉、冰淇淋、乳酪、乾酪、豆奶、發酵豆奶、蔬果汁、果汁、運動飲料、甜點、果凍、糖果、嬰兒食品、健康食品、動物飼料以及膳食補充品。
17. 如申請專利範圍第10項的食品產品，其被製成呈一即溶沖泡食品的形式。