JP7158761B2 - 乳酸菌株の混合物を含むスターターカルチャー、そのようなスターターカルチャーを使用して製造された発酵製品、及びその発酵製品の使用 - Google Patents
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Description
ラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)株LF26
(受託番号DSM32784)、
ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)株LH43
(受託番号DSM32787)、
ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)株LPC12
(受託番号DSM32785)、
ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)株LRH10
(受託番号DSM32786)、
ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)株ST30
(受託番号DSM32788)。
ラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)株LF26
(受託番号DSM32784、寄託日2018年4月3日)、
ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)株LH43
(受託番号DSM32787、寄託日2018年4月3日)、
ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)株LPC12
(受託番号DSM32785、寄託日2018年4月3日)、
ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)株LRH10
(受託番号DSM32786、寄託日2018年4月3日)、
ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)株ST30
(受託番号DSM32788、寄託日2018年4月3日)。
1.実験動物
ICR(The Institute of Cancer Research)の雄マウス(生後6週齢、体重25g)をBioLASCO(Charles River licensee corporation、台湾宜蘭県)から購入した。ICRマウスは、室温(24℃±2℃)、制御湿度(65%±5%)、12時間明暗サイクルで2週間馴化させた。ICRマウスには、げっ歯類飼料5001(PMI Nutrition International、アメリカ合衆国ミズーリ州ブレントウッド)と蒸留水を不断給餌で与えた。以下に記載されているすべての動物実験は、国立台湾体育大学の研究所動物飼育及び使用委員会(IACUC)によって承認され、IACUC-10523のガイドラインに準拠した。
1.統計解析
以下の実施例で得られた実験データは、全て平均値±SD(標準偏差)で表した。統計解析は、ダンカン検定を用いた一元配置分散分析(ANOVA)を用いて行った(統計的有意性はp<0.05で示す)。また、用量効果を調べるためにコクラン-アーミテージ傾向検定を適用した。
5種の乳酸菌株、即ち、ラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)株LF26(受託番号DSM 32784)、ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)株LH43(受託番号DSM 32787)、ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)株LPC12(受託番号DSM 32785)、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)株LRH10(受託番号DSM 32786)、ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)株ST30(受託番号DSM 32788)を、粉末形態のスターターカルチャを製造するために用いた。低温殺菌済みの9.2%還元脱脂乳に、上記スターターカルチャーを接種し、37℃で16時間発酵させた。得られた発酵乳は、本発明に係る発酵製品となる。
各種乳酸菌株を組み合わせて調製した発酵製品が疲労回復、運動能力の向上、生物学的・生化学的特性の改善に有効であるかどうかを調べるために、以下の実験を行った。
2週間の馴化後、実験材料の第1項に記載のマウス(8週齢に成長)を、体重によって以下の4つのグループ(1グループあたりn=8)に分けた。4つのグループは、溶媒投与対照群(対照群と略記)、単回投与群(1X群と略記)、2回投与群(2X群と略記)、5回投与群(5X群と略記)である。マウスの初期体重を記録した。実施例1で得られた凍結乾燥した発酵製品を、1X群、2X群、5X群のマウスにそれぞれ一日当たり2.15g/kg体重、4.31g/kg体重、10.76g/kg体重の投与量で経口投与した。具体的には、実施例1で得られた凍結乾燥した発酵製品を水に溶解し、チューブを介して経口投与するための発酵製品溶液を調製した。対照群のマウスには、1X群、2X群、5X群に投与した発酵製品と同カロリーのグルコース水溶液を適量経口投与した。グルコース水溶液と発酵製品溶液を同量、1日1回、36日間(すなわち、マウスを犠牲にするまで)経口投与した。
29日目の発酵製品水溶液またはグルコース水溶液投与を行った後、30分後に消耗性遊泳試験を行った。具体的には、27℃±1℃に保たれた円柱状のプール(半径28cm、水深25cm)にマウスを1匹ずつ入れた。各マウスの尾の付け根に体重の5%に相当する重量負荷をかけた。各マウスが浮かんだり、もがいたり、浮いたままでいたりするための動作(遊泳状態)を脱力して沈むまで行った時間を遊泳時間(消耗遊泳時間とも呼ぶ)とした。消耗は、それぞれのマウスの泳げなくなった状態(即ち、水面に留まることができなくなった状態)を観察することで判断した。持久力を評価するために、それぞれのマウスの泳ぎ始めから消耗するまでの遊泳時間を記録した。得られたデータは、上記基本手順の第1項に記載した方法に従って統計解析を行った。
図1に示されるように、1X群、2X群、5X群のそれぞれの消耗遊泳時間は、対照群の消耗遊泳時間よりも有意に長くなっており、本発明に係る発酵製品は、抗疲労効果を示すことができ、したがって、水泳持久力性能を向上させることができることが示された。更に、水泳持久力性能に有意な、本発明に係る発酵製品の用量依存的効果が観察された(p<0.0001)。このように、本発明に係る発酵製品は、特に処置的な運動訓練を必要とせず、運動能力を向上させることができ、更に栄養素利用性を向上させることができることが明らかである。
28日目の発酵製品水溶液またはグルコース水溶液投与を行った後、30分後に、各マウスの前肢握力(前肢絶対握力)を低力試験装置(型番RX-5、アイコーエンジニアリング、愛知県名古屋市)を用いて測定した。具体的には、金属棒(直径2mm、長さ7.5cm)を装着した力変換器を用いて、各マウスの引張力を測定した。測定中は、それぞれのマウスを尾の付け根で把持し、棒に向かって垂直に吊り下げた。各マウスは、両前肢を伸ばして棒をつかんだとき、尾によってわずかに後方に引っ張られ、それにより引っ張り力が発生する。引っ張り中にそれぞれのマウスが発揮した握力を測定し、握力計でグラム単位で記録した。最大握力を前肢握力とした。得られたデータは、基本手順の第1項に記載した方法に従って統計解析を行った。
図2に示されているように、1X群、2X群、及び5X群のそれぞれの前肢握力は、対照群よりも有意に大きく、本発明に係る発酵製品は、握力を向上させることができ、したがって、筋力を向上させることができることが示された。また、握力に有意な、本発明に係る発酵製品の用量依存的効果が観察された(p<0.0001)。このように、本発明に係る発酵製品は、特に処置的な運動訓練を必要とせず、運動能力を向上させることができ、更に栄養素利用性を向上させることもできることが明らかである。
本発明に係る発酵製品が、本実施例の項目Bで実施した消耗性水泳試験以外の水泳運動後の疲労関連生化学的指標に及ぼす影響を調べるために、以下の実験を行った。
31日目に、10分間の水泳運動の前後及びこの10分間の水泳運動の後の20分間の休憩後に、各マウスから血液サンプルを採取した。10分間の水泳運動の間、各マウスを本実施例の項目Bで使用した柱状プールに入れ、重量負荷をかけずに泳がせた。得られた血液サンプルを1500g、4℃で10分間遠心分離し、得られた上清を回収して血清とした。血清中の乳酸値、アンモニア値、グルコース値を自動分析装置(型番7060、日立社、東京都日立市)を用いて測定した。
更に、33日目に、各マウスに90分間の水泳運動とその後の60分間の休憩を与え、血清クレアチンキナーゼ(CK)値及び血清尿素窒素(BUN)値の疲労に伴う変化を評価した。90分間の水泳運動中、各マウスを本実施例の項目Bで使用した柱状プールに入れ、重量負荷をかけずに泳がせた。血清中のCK値及びBUN値は、乳酸値、アンモニア値、及びグルコース値を測定するための前述の手順に概ねしたがって測定した。
D-1.10分間の水泳運動及び20分間の休憩
10分間の水泳運動の前では、対照群、1X群、2X群、及び5X群の各群間で血清乳酸値の有意な差は見られなかった(データは特に示さない)。一方、図3Aに示されているように、10分間の水泳運動後で且つ20分間の休憩前では、1X、2X、及び5Xの各群の血清乳酸値は、対照群よりも有意に低くなっている。これにより、本発明に係る発酵製品は、血中乳酸の除去及び利用を促進することができ、したがって、抗疲労効果を示すことが明らかになった。更に、10分間の水泳運動の後で且つ20分間の休憩の前では、本発明に係る発酵製品の血清乳酸値に対して有意な用量依存的効果が観察された(p=0.0037)。更に、図3Bに示されているように、20分間の休憩後の、1X、2X、及び5Xの各群の血清乳酸値は、対照群に比べて有意に低い。これにより、本発明に係る発酵製品は、血中の乳酸の除去及び利用を更に促進することができ、したがって、運動後の休憩中に抗疲労効果を発揮することが明らかになった。更に、20分間の休憩の後、血清乳酸値に対する本発明に係る発酵製品の有意な用量依存的効果が観察された(p<0.0001)。
図5Aに示されているように、90分間の水泳運動及び60分間の休憩の後では、1X、2X、及び5Xの各群の血中BUN値が対照群よりも有意に低く、本発明に係る発酵製品が血中のBUNを減少させ、したがって抗疲労効果を示すことが明らかになった。更に、90分間の水泳運動及び60分間の休憩の後において、血中BUN値に対する本発明に係る発酵製品の有意な用量依存的効果が観察された(p=0.0301)。
36日目に、マウスの最終体重を記録した。全てのマウスを8時間の絶食後に95%二酸化炭素で窒息させて犠牲にした。その後、以下の実験を行った。
各マウスの肝臓、腎臓、精巣上体脂肪パッド(EFP)、心臓、肺、筋肉(後肢後部の腓腹筋、ヒラメ筋を含む)、褐色脂肪組織(BAT)を切除し、その重量を測定して、本発明に係る発酵製品がこれらの組織・臓器に栄養上の悪影響を及ぼすかどうかを調べた。得られたデータは、基本手順の第1項に記載の方法に従って統計解析した。
本実施例の項目E-1で得られた各マウスの肝臓および筋肉に対して、Huang, C.C. et al. (2012), Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2012:364741に記載されている方法に従ってグリコーゲン含量の測定を行った。得られたデータは、基本手順の第1項に記載されている方法に従って統計分析した。
本実施例の項目E-1で得られた各マウスの肝臓、腎臓、EFP、心臓、肺、筋肉、BATを以下のように組織学的染色を行った。即ち、前記各臓器及び組織からそれぞれ組織サンプルを採取し、10%ホルマリンを用いて固定した。ホルマリン固定後、各組織サンプルをパラフィンに埋め込んだ後、形態学的、病理学的評価のために厚さ4μmのスライスに切断した。こうして得られた組織切片をヘマトキシリンおよびエオジンで染色し、CCDカメラを備えた光学顕微鏡(BX-51、オリンパス社、東京都)で200倍または100倍の倍率で観察した。
血液を各マウスから心臓穿刺で採取し、次いで遠心分離し、得られた上清(血清)を採取した。採取した血清中のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)、アルブミン、クレアチニン、乳酸脱水素酵素(LDH)、CK、総蛋白(TP)、グルコース、総コレステロール(TC)、トリアシルグリセロール(TG)のレベルを、本実施例の項目Dで用いた自動分析装置を用いて評価した。得られたデータは、基本手順の第1項に記載の方法に従って統計解析を行った。
それぞれのマウスから盲腸サンプルを採取し、細菌DNA抽出のために直ちに-80℃で保存した。細菌DNAの抽出は、当分野で一般的に使用されているセチルトリメチルアンモニウムブロマイド/ドデシル硫酸ナトリウム(CTAB/SDS)法にしたがって行った。抽出したゲノムDNAを-80℃で保存した後、以下のようにして16S rRNAシークエンシングを行った。
E-1.組織・臓器重量の測定
対照群、1X群、2X群、5X群の各群間で、初期体重、最終体重、食物摂取量及び水分摂取量に有意な差は認められなかった(データは特に示さず)。また、肝臓、腎臓、EFP、心臓、肺の重量についても対照群、1X群、2X群、5X群の各群間で有意差は認められなかった。よって本発明に係る発酵製品は、臓器・組織に栄養面で悪影響を及ぼすことがないことがわかった(データは特に示さず)。
図7Aに示されているように、1X群、2X群、および5X群のそれぞれの肝グリコーゲン含量は、対照群の肝グリコーゲン含量よりも有意に高かった。このことから、本発明に係る発酵製品は肝グリコーゲン含量を増強し、よって抗疲労効果を発揮し、身体持久力をさらに向上させることができることが明らかになった。更に、本発明に係る発酵製品の肝グリコーゲン含量に対する有意な用量依存的効果(p=0.004)が観察された。
1X群、2X群、5X群の各群に関する肝臓、筋肉、心臓、腎臓、肺、EFPおよびBATの組織学的観察は、対照群に関するものと相違しなかった(特にデータは示さず)。本発明に係る発酵製品の投与後に毒性を示す臨床徴候は観察されず、このような発酵製品は、用いられ得る各種用量において特に安全であることが示された。
下記表2に示すように、1X群、2X群及び5X群のALT値及びCK値は、対照群のALT値及びCK値よりも有意に低かった。このことから、本発明に係る発酵製品は、血中ALTおよびCKを低下させることができることが示された(血中ALTが低下していることは、肝臓へのダメージがないことを意味し、血中CKが低下していることは、抗疲労効果があることを意味する)。AST、アルブミン、クレアチニン、LDH、TP、グルコース、TC、TGといった他の生化学的指標は、4群間で差がなかった(データは特に示さず)。このことからも、本発明に発酵製品は、用いられ得る各種用量において特に安全であることがわかる。
主座標分析の結果(データは特に示さず)に基づくと、対照群、1X群、2X群、及び5X群がそれぞれ比較的明確なグループにクラスター化していることが判明した。このことにより、本発明に係る発酵製品は、腸内微生物叢を有意に変化させられることが示唆された。更に、菌門レベルで言うと、対照群、1X群、2X群、及び5X群のマウスの腸内マイクロバイオームの全体的な組成において、フィルミクテス門(Firmicutes)(対照群65%、1X群69%、2X群51%、5X群57%)及びバクテロイデス門(Bacteroidetes)(対照群28%、1X群25%、2X群43%、5X群39%)が優勢であった。4群の腸内細菌叢においては、フィルミクテス門とバクテロイデス門が優勢であったが(合わせて約90%)、2X群と5X群ではフィルミクテス門の割合が少なく、バクテロイデス門の割合が多かった。本発明に係る発酵製品は、バクテロイデス門を増加させる能力を有し、バクテロイデス門は分岐鎖アミノ酸の異化に関与するタンパク質の発現を増加させ、短鎖脂肪酸(SCFA)(炎症の軽減、満腹感の向上、及び全体的な代謝効果に関与する)の産生を増加させるため、本発明に係る発酵製品を十分な量で使用した場合、炎症の軽減、満腹感の向上、および有益な代謝効果を提供するのに有効といえる。
Claims (11)
- ドイツ微生物細胞培養コレクション(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)に寄託された以下の5つの乳酸菌株の混合物を含む、発酵製品を製造するためのスターターカルチャー。
ラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)株LF26
(受託番号DSM32784)、
ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)株LH43
(受託番号DSM32787)、
ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)株LPC12
(受託番号DSM32785)、
ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)株LRH10
(受託番号DSM32786)、
ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)株ST30
(受託番号DSM32788)。 - 液状、ペースト状、半固形状、固形状、及びこれらの複合状態からなる群から選ばれる1つの状態にある、請求項1に記載のスターターカルチャー。
- 発酵性材料を請求項1または請求項2に記載のスターターカルチャーを用いて発酵処理にかけることを含む、発酵製品を製造する方法。
- 前記発酵性材料は、乳製品、大豆材料、米材料、ナッツ材料、ココナッツ材料、果実材料、麦汁材料、生姜材料、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項3に記載の方法。
- 前記発酵性材料が乳製品である、請求項4に記載の方法。
- 前記発酵性材料は、乳、ホエイ、発酵乳、乳酸菌飲料、脱脂乳、脱脂粉乳、調製粉乳、粉乳、濃縮乳、濃縮脱脂乳、還元脱脂乳、練乳、脱脂練乳、加糖練乳、加糖脱脂練乳、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項5に記載の方法。
- 前記発酵性材料が還元脱脂乳である、請求項6に記載の方法。
- 前記発酵処理の後に脱水処理を行うことを更に含む、請求項3~7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記脱水処理は、凍結乾燥、流動床乾燥、噴霧床乾燥、減圧乾燥、熱風乾燥、流動床造粒、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項8に記載の方法。
- 前記脱水処理が凍結乾燥である、請求項9に記載の方法。
- 前記発酵処理は、30℃~43℃で8時間~24時間行われる、請求項3に記載の方法。
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