JP5247120B2 - L−オルニチン含有物の製造方法 - Google Patents
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例えば、L−オルニチンは、それ自体又はその酸付加塩であるオルニチン−α−ケトグルタル酸塩(以下、OKG)」が、成長ホルモンの分泌を促進させ、タンパク質合成が促進され、筋肉増強や手術後の腸管組織の回復が促進される。また、L−オルニチン自体又はOKGが、オルニチン回路を活性化させ、アンモニア解毒を促進させ、肝機能障害により引き起こされる高アンモニア血症を改善し、肝性脳症を予防する(非特許文献6)。また、OKGが、TNF−α産生促進(非特許文献7)やNK細胞の活性化等免疫増強作用も示すことも知られている(非特許文献5)。さらに、L−オルニチンを摂取させ、ポリアミンの合成を促進させることにより、障害を受けた腸管の修復を促すことが報告されている(非特許文献8)。
また、穀粉、水、乳酸菌、並びにオルニチン生成のための基質となるアミノ酸を混合して醗酵させることを特徴とする、パン生地添加用醗酵種の調製方法も報告されている(特許文献8)。
また、ペディオコッカス属の乳酸菌により乳酸菌含有醗酵種を調製し、これを添加してパン生地を焼成し、風味良好なパンの製造方法が報告されているが、オルニチン生成のために基質としてアルギニンを添加する必要があり、手間やコストがかかる。
従って、本発明は、L−アルギニン遊離活性を有する微生物とアルギニン・ディミナーゼ経路を有する微生物によって、L−アルギニンを構成アミノ酸として含む蛋白質及び/又はペプチド含有物を発酵させることにより、L−オルニチンを高含有し、精製工程を設けなくても直接飲食することが可能な飲食品、医薬品、飼料の製造方法を提供することを課題とする。
(1)L−アルギニン遊離活性を有する微生物とアルギニン・ディミナーゼ経路を有する微生物を用いて、L−アルギニンを構成アミノ酸として含む蛋白質及び/又はペプチド含有物を発酵させることを特徴とするL−オルニチン含有物の製造方法。
(2)L−アルギニン遊離活性を有する微生物及び/又はアルギニン・ディミナーゼ経路を有する微生物が、乳酸菌であることを特徴とする(1)に記載のL−オルニチン含有物の製造方法。
(3)L−アルギニン遊離活性を有する微生物が、基質にアルギニンとパラ・ニトロアニリド複合体(Arg-p-NA)を用いて細胞抽出液酵素活性測定に供したとき、活性が100(nmol p-NA released/min/mg protein)以上であることを特徴とする(1)又は(2)に記載のL−オルニチン含有物の製造方法。
(4)アルギニン・ディミナーゼ経路を有する微生物が、L−アルギニン又はその塩を500mg/100ml含む培地において10〜42℃で培養したとき、L−オルニチンを250mg/100ml以上生産することを特徴とする(1)〜(3)のいずれかに記載のL−オルニチン含有物の製造方法。
(5)L−アルギニン遊離活性を有する微生物が、ラクトコッカス属又はラクトバチルス属であることを特徴とする(1)〜(4)のいずれかに記載のL−オルニチン含有物の製造方法。
(6)アルギニン・ディミナーゼ経路を有する微生物が、ラクトコッカス属又はラクトバチルス属であることを特徴とする(1)〜(5)のいずれかに記載のL−オルニチン含有物の製造方法。
(7)(1)〜(6)のいずれかに記載の方法により得られるL−オルニチン含有飲食品。
(8)(1)〜(6)のいずれかに記載の方法により得られるL−オルニチン含有医薬品。
(9)(1)〜(6)のいずれかに記載の方法により得られるL−オルニチン含有飼料。
本発明は、L−アルギニンを構成アミノ酸として含む蛋白質及び/又はペプチドを含有するものを原材料として用いる。多くの蛋白質は、L−アルギニンを構成アミノ酸として含むため、原材料としては、蛋白質であれば特に制限されない。そのような原材料として、例えば、肉類、魚介類、乳類、大豆、小麦等が挙げられるが、その中でも、食経験が豊かで安全な乳酸菌の生育に適した乳類、大豆又はそれらの加工品が好ましい。乳類としては、発酵乳食品製造に通常用いられる乳であればいずれの乳を使用してもよく、例えば全乳、脱脂調製乳、還元乳、濃縮乳、バターミルク、クリーム、脱脂粉乳、乳蛋白、豆乳等又はこれらの混合物を挙げることができる。
ペプチダーゼは特に反応部位認識機構や基質特異性、すなわちペプチド中のどのアミノ酸を認識しどのようなペプチドもしくはアミノ酸を遊離するかによってエンドペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、トリペプチダーゼ、ジペプチダーゼ等に分類されその種類は多岐に渡ることが知られており、菌株によって有するペプチダーゼの種類や活性は様々である。
L−アルギニン遊離活性を有する微生物としては、食品に添加できて、L−アルギニン遊離活性を有する菌であれば特に制限されないが、遊離L−アルギニンを基質としてオルニチンに変換する反応より、タンパク質から構成アミノ酸であるL−アルギニンを遊離する反応の方が律速になる。よって、L−アルギニン遊離活性が高いもの、具体的には基質にArg-p-NAを用いた細胞抽出液酵素活性測定(Sasaki, M., Boukje, W., B. and Paris, S., T. Comparison of proteolytic activities in various lactobacilli. Journal of Dairy Research. 62: 601-610, 1995に記載された方法に従った。以下同様に測定した。)を行った場合に、少なくとも活性が100(nmol p-NA released/min/mg protein)以上、特に150(nmol p-NA released/min/mg protein)以上であるものが好ましい。そのような微生物としては、ラクトバチルス(Lactobacillus)属、ラクトコッカス(Lactococcus)属等に属する菌が好ましく、特に、ラクトバチルス・ヘルベチカス(Lactobacillus helveticus(以下Lb.ヘルベチカス))が好ましい。これらの微生物は1種を単独で用いても2種以上を組み合わせて用いてもよい。
乳類を含有する原材料を用いることにより、良好に発酵し、発酵時間を短くすることができ、得られる発酵乳食品の風味及び香り等は非常に良好なものとなる。このような発酵乳食品の例としては、チーズ、ヨーグルトや豆乳等が挙げられるが、特にチーズが好ましい。このような方法により、チーズ100gあたり100mg以上のL−オルニチン高含有飲食品を得ることができる。
L−アルギニン遊離活性を有する微生物を選択するため、下記の評価を行った。表1に示す各菌株の細胞抽出液を作成し、L−アルギニンとパラ・ニトロアニリド(以下、p-NAと略記する)複合体(以下、Arg-p-NAと略記する)を用いて反応させ、放出されたp-NA量を410nmの吸収の増加で測定した。結果を表1に示す。
アルギニン・ディミナーゼ経路を有する微生物を選択するため、下記の評価を行った。表2に示す菌株を、500mg/100mlのL−アルギニン及び500mg/100mlの酵母エキスを添加した12%脱脂粉乳溶液において、30℃(ラクトコッカス属に属する菌)あるいは37℃(ラクトバチルス属に属する菌)で3日間培養した。培養上清に、5−スルホサリチル酸二水和物を最終濃度が2%になるように加え、遠心分離した上清を適宜希釈したものを0.22μm口径のフィルターにてろ過し、HPLCにて上清中のL−オルニチン濃度を測定した。結果を表2に示す。
市販されているチーズ(Aは、チェダーチーズ(原料用チーズ(ニュージーランド製):フォンテラ社製)、Bは、チェダーチーズ(原料用チーズ(オーストラリア製):フォンテラ社製)、Cは、ゴーダチーズ(原料用チーズ:フォンテラ社製)、Dは、ゴーダチーズ(雪印乳業株式会社製))中のL−アルギニン及びL−オルニチン量を測定した。なお、L−アルギニン及びL−オルニチン量の測定は試験例2と同様の方法で測定した。結果を表3に示す。
L−アルギニン遊離活性を有する微生物を用いてゴーダチーズEを製造した。すなわち、原料乳(脂肪分3.5%)100kgを75℃で15秒間加熱殺菌した後、L−アルギニン遊離活性を有するLb.ヘルベチカスSBT2171(FERM P−14381)をスターターとして1%添加した。その後は、比較例1と同様の製法で製造し、15℃で5週間、その後10℃で6ヶ月熟成した。熟成後、チーズ中の遊離L−オルニチン量を測定した。結果を表3に示す。表3に示される結果から明らかなように、L−アルギニン遊離活性を有するLb.ヘルベチカスを添加したことによりチーズ中遊離L−アルギニン量が有意に増加した。なお、L−アルギニン及びL−オルニチン量の測定は試験例2と同様の方法で測定した。
アルギニン・ディミナーゼ経路を有する微生物を用いてゴーダチーズFを製造した。原料乳(脂肪分3.5%)100kgを75℃で15秒間加熱殺菌した後、アルギニン・ディミナーゼ経路を有するLc.ラクティスSBT11017(JCM5805T)を含む混合スターターを1%添加し、31℃で発酵し、凝乳酵素のレンネットを添加した。カッティングを行った後、撹拌しながらホエーを排除し、最終温度が37℃になるように80℃の温水を徐々に加えた。その後さらに30分撹拌した後、生成したカードを沈降させてスチールの板でプレスした。カードが固化したらホエーを排除し、型詰、圧搾、加塩の行程を経てワックスでコーティングし、12ヶ月熟成した。熟成後、チーズ中の遊離L-アルギニン、L−オルニチン量を測定した。
結果を表3に示す。なお、L−アルギニン及びL−オルニチン量の測定は試験例2と同様の方法で測定した。
を用いてゴーダチーズGを製造した。
すなわち、原料乳(脂肪分3.5%)100kgを75℃で15秒間加熱殺菌した後、L−アル
ギニン遊離活性を有するLb.ヘルベチカスSBT2171(FERM P−14381)と、アルギニン・
ディミナーゼ経路を有するLc.ラクティスSBT11017(JCM5805T)とを含む混合スターター
を1%添加した。その後は、比較例1と同様の方法で製造し、15℃で5週間、その後10℃
で12ヶ月熟成させた。熟成後、チーズ中の遊離L−アルギニン及びL−オルニチン量を試
験例2と同様の方法で測定した。結果を表3に示す。
なお、市販されているチーズA〜Dについては、オルニチン含量は、表3に示すとおり、実施例1で調製したチーズに比べて、オルニチンはほとんど含まれていなかった。また、Aのチーズはオルニチン含量に比べてアルギニン含量が多く、アルギニンからオルニチンへの変換反応が良好に進んでいないと思われる。
最初に原料を調合し、均質化した後、殺菌、冷却した。次いで、撹拌用羽が設けられたタンク内で原料を保持し、L−アルギニン遊離活性を有するLb.ヘルベチカスSBT2171(FERM P−14381)と、アルギニン・ディミナーゼ経路を有するLc.ラクティス(SBT11017(JCM5805T))とを添加し、容器に充填した。次いで、発酵させた後、急速冷却し、ヨーグルトを製造した。
なお、この方法に用いた微生物以外の原料、使用量、各工程における温度、時間等の条件は、通常のヨーグルトの製造に用いる条件と同様とした。
HPLCで測定したところ、L-アルギニン遊離活性を有する微生物とアルギニン・ディミナーゼ経路を有する微生物とを用いていない通常のヨーグルトには、ほとんど存在しなかったL−オルニチンが生産された。
原料の大豆を浸漬した後、L−アルギニン遊離活性を有するLb.ヘルベチカスSBT2171(FERM P−14381)と、アルギニン・ディミナーゼ経路を有するLc.ラクティス(SBT11017(JCM5805T))とを添加した。次いで、原料を磨砕、加熱、圧搾して豆乳を製造した。
なお、この方法に用いた微生物以外の原料、使用量、各工程における温度、時間等の条件は、通常の豆乳の製造に用いる条件と同様とした。
HPLCで測定したところ、L-アルギニン遊離活性を有する微生物とアルギニン・ディミナーゼ経路を有する微生物とを用いていない通常の豆乳には、ほとんど存在しなかったL−オルニチンが生産された。
L−アルギニン遊離活性を有するLb.ヘルベチカスSBT2171(FERM P−14381)と、アルギニン・ディミナーゼ経路を有するLc.ラクティス(SBT11017(JCM5805T))をMRS液体培地(Difco社)5Lに接種後、37℃、18時間静置培養を行い、培養物を得た。次いで、この培養物を、脱脂粉乳10重量%、グルタミン酸ソーダ1重量%を含む分散媒と同量混合し、pH7に調整後、凍結乾燥を行った。得られた凍結乾燥物を60メッシュのフルイで整粒化し、凍結乾燥培養物を製造した。表4に示した配合により原料を混合し、本発明のオルニチン含有イヌ飼育用飼料を製造した。
Claims (3)
- L−アルギニン遊離活性を有する微生物とアルギニン・ディミナーゼ経路を有する微生物を用いて、L−アルギニンを構成アミノ酸として含む蛋白質及び/又はペプチド含有物を発酵させるL−オルニチン含有物の製造方法であって、
前記L−アルギニン遊離活性を有する微生物が、ラクトコッカス属又はラクトバチルス属に属し、基質にアルギニンとパラ・ニトロアニリドとの複合体(Arg-p-NA)を用いて細胞抽出液酵素活性測定に供したとき、活性が100(nmol p-NA released/min/mg protein)以上である微生物であり、
前記アルギニン・ディミナーゼ経路を有する微生物が、ラクトコッカス属又はラクトバチルス属に属し、L−アルギニンを500mg/100ml及び酵母エキスを500mg/100ml添加した12%脱脂粉乳溶液において10〜42℃で3日間培養したとき、L−オルニチンを250mg/100ml以上生産する微生物であることを特徴とする前記製造方法。 - 請求項1に記載の方法により得られるL−オルニチン含有物からなる飲食品。
- 請求項1に記載の方法により得られるL−オルニチン含有物からなる飼料。
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