TWI593352B - 一種具有抗氧化／消除自由基能力之黑蒜頭發酵乳及其製造方法 - Google Patents

Description

一種具有抗氧化/消除自由基能力之黑蒜頭發酵乳及其製造方 法

本發明揭示以(Lactobacillus bulgaricus CCRC 14009、L.acidophilus CCRC 14079、Leuconostoc mesenteroides BCRC 12273、Streptococcus thermophilus CCRC 14085)或雙叉桿菌(Bifidobacterium infantis CCRC 14633)當成發酵含有黑蒜頭之發酵乳菌株，生產出具有抗氧化/消除自由基能力之黑蒜頭發酵乳保健食品。

本發明揭示以乳酸菌或雙叉桿菌當成含有發酵黑蒜頭之發酵乳菌株，生產出具有抗氧化/消除自由基能力之黑蒜頭發酵乳保健食品。

依據國內外報告，乳酸菌對人類健康的好處已經確認之功效有：改善乳糖的吸收、減少嬰兒或成人的下痢、增強免疫能力與減少細菌酵素。極具潛力之功效有對病原菌產生競爭、降低膽固醇與抗腫瘤。而推測之功效則有合成葉酸及B群維生素與促進礦物質吸收。

益生菌必須是能在宿主體內發揮作用的活菌，具有改善腸內菌叢品質、增進宿主健康之特點。益生菌之酵素活性與所調節之免疫反應乃因菌種而異(Bernet et al.1993,Fang et al.2000,Ouewhand et al.1999)，常見之益生菌株包括Lactobacillus、Bifidobacterium、Streptococcus thermophilus、Lactococcus lactis、Leuconostoc mesenteroides及其他乳酸菌(Holzapfel et al.1998)。近年來含有益生菌種的產品遽增，且焦點集中在乳酸菌和雙叉桿菌(Gomes and Malcata 1999,Kullen and Klaenhammer 1999,Lee and Salminen 1995,O’Sullivan et al.1992)。攝食含有益生菌種的食品對人體有益，除可隔離或抵抗病原外，亦具有刺激及調節免疫反應、具抗癌及抗突變活性、改善乳糖不耐症、促進營養素吸收、降低膽固醇、減少持續性下痢、預防陰道炎及防止便秘等益處(Gomes and Malcata 1999,Hose and Sozzi 1991,Kullen and Klaenhammer 1999,Sanders 1998)。

乳酸菌之分類

乳酸菌主要依形態、發酵型式、生長溫度、氧氣需求程度、所生成乳酸之旋光性及其他代謝化合物等性質予以分類。與食品關係密切的乳酸菌包括：Streptococcus、Enterococcus、Lactococcus、Vagococcus、Lactobacillus、Carnobacterium、Leuconostoc、Pediococcus、Tetragenococcus、Oenococcus及Weissella等11屬(Stiles and Holzapfel 1997)，以下就常應用於乳製品之乳酸菌有下列幾種(Frazier and Westhoff 1988)：Streptococcus(乳酸鏈球菌屬)、Lactobacillus(乳酸桿菌屬)、Lactococcus(乳酸球菌屬)、雙叉桿菌(菌種則有B.longum、B.infantis、B.breve、B.bifidum及B.adolescentis等(Collins et al.1998,O’Sullivan et al.1992))。

益生菌(Probiotics)、益生物質(Prebiotics)和共生質(synbiotics)

益生菌為某一種或多種微生物當餵食人類或動物時可增進 其腸內菌叢之品質，益生菌作用於其宿主，增進宿主之健康。目前最常用為益生菌之菌株以乳酸菌佔絕大部份，主要是因為人類食用發酵乳品歷史悠久，乳酸菌因而一直被認為是安全的，而且乳酸菌也被認定是有益的腸內菌。益生物質則是指不能消化的食物原料，會選擇性刺激腸道內一種或數種微生物的生長與活性，進而對宿主產生有益的效用以改善宿主的健康，如：乳酸菌的代謝產物。共生質即為益生菌與益生源的混合物，在腸胃道中可滋益生菌生長，促進人體健康，市面上將乳酸菌飲品即是。

黑蒜頭及其生理活性介紹

生物轉換技術又稱為biocatalysis或biotransformation，是一種利用微生物所具有之特殊反應功能，可將原料中某些化合物進行化學修飾反應，而轉換成具有特殊用途或功效化合物之技術。在生物轉換期間，於生鮮大蒜中不穩定及具刺激氣味化合物，會轉換成一穩定且無氣味化合物如S-烯丙基半胱胺酸(S-Allylcysteine,SAC)，其為黑蒜中主要成分，並產生可能具保健功效的有效成分，具開發及驗證功效之價值。

抗氧化

黑蒜頭為生鮮蒜頭經生物轉換後的產品，經生物轉換之蒜頭其總酚、類黃酮及SOD-like含量皆高於生蒜頭，且主要成份為Allicin，並且對於蒜頭中之硫化物，包括DAS、DADS、DATS含量均具有提升效應(蕭，2008)。

降血糖作用

於第二型糖尿病老鼠動物餵食實驗中，發現餵食黑蒜頭組之老鼠肝臟的相關抗氧化酵素活性及活性物質明顯高過生蒜頭組，因此推測 黑蒜頭比生蒜頭具有較高的抗氧化能力，並能避免糖尿病的併發症產生(Lee et al.,2009)。

改善粥狀動脈硬化

有學者將黑蒜頭氯仿萃取物用在治療或抑制動脈粥狀血管的相關疾病或抑制發炎前驅物(5-Hydroxymethylfurfural；5-HMF)反應(Kim et al.,2011)。

抗腫瘤作用

將人類胃癌細胞培養於濃度1.0mg/ml的黑大蒜水萃液(BGWE)中，可達到抑制AGS細胞生長50%；透過細胞計數法，相同濃度可造成1.5×105個AGS細胞死亡。利用Western blot分析BGWE對於AGS細胞凋亡相關蛋白的表現，發現當BGWE濃度為1.0mg/ml時，細胞內凋亡因子AIF、cytochrome c、caspase-3蛋白表現有增加的趨勢，此外Bcl-2家族中的促進細胞凋亡因子Bax、Bid以及Bid上游調控因子FasL等蛋白質在細胞內也都有增加的表現(周，2009)。另有研究指出在罹患胃癌腫瘤老鼠實驗中發現，餵食黑蒜頭具有抑制胃癌腫瘤效果且有明顯的劑量效應；進一步研究指出對於血清中SOD、GPx、interleukin-2之活性有增強效果，推測原因黑蒜頭具有抗氧化能力和免疫調節能力之關係(Wang et al.,2012)。

改善肥胖作用

黑蒜甲醇萃取物具有最佳的抑制脂肪細胞數目、胞內三酸甘油酯含量與甘油-3-磷酸去氫酶活性；黑蒜甲醇萃取物亦具有抑制脂肪細胞分化、脂質生合成與脂肪細胞激素之基因表現，以及提升脂質分解與脂聯素之基因表現，顯示黑蒜在動物模式與細胞模式中，具有抑制脂質合成 之效應，且此效應是與減低脂肪細胞分化、減低脂質生合成、減少脂肪細胞激素與增加脂質分解作用之調控有關(張，2011)。2014年也有學者指出黑蒜頭甲醇萃取物有調節脂質生合成功效，可能在預防肥胖之機能性食品具有潛在的市場(Chen et al.2014)。2014年也有學者指出黑蒜頭甲醇萃取物有調節脂質生合成功效，可能在預防肥胖之機能性食品具有潛在的市場(Chen et al.2014)。

護肝

有研究指出以黑蒜頭餵食酒精性肝氧化損傷之老鼠4星期後，發現實驗組(酒精+黑蒜頭)可有效降低脂肪在肝臟的堆積；且因酒精性肝損傷所誘導之天門冬胺酸胺基轉移酶、丙胺酸胺基轉移酶、鹼性磷酸酶、乳酸脫氫酶與對照組(酒精)相比較下活性明顯降低，細胞色素P450 2E1活性減少了55%，GST和quinine reductase活性比對照組增加1.5倍和4倍，GSH含量和GPx、Gsr和觸酶(catalase)在肝臟的活性明顯提高；進一步推測黑蒜頭之抗氧化能力具有保護慢性酒精肝損傷的效果(Kim et al.,2012)。

上述研究結果顯示黑蒜頭具有多重生理機能性。

近年來十分熱門的保健食品或中草藥，不論是由傳統醫學或現代科學的研究，都發現其對體內的調節或疾病的防治皆是多元的。誠如黑蒜頭在文獻中被提到具有有降血脂、抗光老化、免疫調節、消炎、控制血糖、抗腫瘤等功效。因此，我們推斷，黑蒜頭中某些成分可能為具有抗氧化/消除自由基的防禦功能，這些成分是為生理調節中十分重要的因子。

2011年有學者以麵包酵母(Saccharomyces cerevisiae)發 酵黑蒜頭後其發酵液粉末添加在高脂肪飲食飲食中，探討其體外之生物活性。研究結果顯示以酵母發酵過的黑蒜頭其抗氧化能力高過黑蒜頭；並可以當作添加在糖尿病患者的飲食營養添加劑，藉以改善老年人氧化壓力的傷害及增強抗氧化能力(Jung et al.,2011)。

本實驗室近幾年著重在黑蒜頭的專利佈局，目前計有中華民國專利公告第I430755號「一種可提高已受酒精性肝損傷之酵素活性的黑蒜頭食品之新用途」、中華民國專利申請第103126551號「一種抵抗疲勞之黑蒜頭保健品」、中華民國專利申請第103128770號「一種以黑蒜頭製備預防動脈粥狀硬化之萃取物之方法及用途」、中華民國專利申請第103130197號「黑蒜頭改善雄性動物精液品質之用途及性功能障礙的保健食品」、中華民國專利申請第104105785號「一種黑蒜頭之抗血色素糖化及降血糖萃取物之製作方法」。

本發明主要保護的概念在於利用黑蒜頭具有抗氧化/消除自由基之成分與乳酸菌一起在乳品中發酵，生產含有益生菌、益生物質和共生質之黑蒜頭發酵乳，該發酵乳的抗氧化能力比未添加黑蒜頭之發酵乳尤佳。

本發明係以黑蒜頭添加在鮮乳及黃豆奶(俗稱豆漿)中，選擇利用乳酸菌(Lactobacillus bulgaricus CCRC 14009、L.acidophilus CCRC 14079、Leuconostoc mesenteroides BCRC 12273、Streptococcus thermophilus CCRC 14085)或雙叉桿菌(Bifidobacterium infantis CCRC 14633)單獨發酵，其生產之發酵乳含有益生菌、益生物質和共生質；產品顯示含黑蒜頭發酵 之發酵乳之抗氧化/消除自由基能力大於未含黑蒜頭之發酵乳。

本發明提供一種具有抗氧化/消除自由基能力之黑蒜頭發酵乳的保健食品，可以乾燥呈粉末狀或以液體狀呈現，其中包含黑蒜頭發酵乳與添加食品上可接受之載體、賦形劑或稀釋劑，並可製為可食入之形式，可為粉末、膠囊、液體或錠劑。

本發明的有益效果在於：藉由將該萃取物搭配一般日常食用的基料成分所製成的保健產品，使該萃取物能以較適當的濃度與較方便的包裝型式被獲得與攝食，進而能彌補現代人飲食不均衡所引發的文明病，及提供作為日常保養的輔助食品。

發酵乳製作方法

在食品領域乳品分為動物性奶類(如：牛奶、羊奶等)及植物性奶類(如：黃豆奶、烏豆奶)等，本發明取市售全脂鮮奶及黃豆奶進行該技術實施例之乳品來源，該乳品來源可以以粉末狀加水成為還原乳(奶)取代，加入3~8%蔗糖(調整口味及乳酸菌的碳源)，將黑蒜頭打成泥狀，以全部重量為基準(w/w)，添加0~10%的黑蒜頭泥(空白組為0%添加黑蒜頭泥)，在0~10%黑蒜頭添加範圍，隨著添加量的提高抗氧化/消除自由基能力隨之增強；但是，超過10%以上黑蒜頭添加，隨著添加量的提高呈現出減緩或抑制乳酸菌或雙叉桿菌的生長。接種0.1%(v/v)乳酸菌(Lactobacillus bulgaricus CCRC 14009、L.acidophilus CCRC 14079、Leuconostoc mesenteroides BCRC 12273、Streptococcus thermophilus CCRC 14085)或雙叉桿菌(Bifidobacterium infantis CCRC 14633)，於23~43℃進行發酵36~56小時候，即分別完成具有抗氧化/消除自由基能力之黑蒜頭發酵乳。實驗中發現在23~43℃的培養溫度範圍中，培養溫度的改變各菌種發酵的時間就會改變，乳酸菌及雙叉桿菌在此培養溫度範圍的生長對數曲線呈現不同的態樣，但是同樣具有抗氧化/消除自由基能力。本發明以37℃當成本發明揭示的實施例顯示，本領域的技術人員應當理解，不能將此揭示培養溫度當成限縮本發明權利之理由。由上述方法所製作之具有抗氧化/消除自由基能力之黑蒜頭發酵乳可以乾燥成粉末狀或以液體狀，添加食品上可接受之載體、賦形劑或稀釋劑成為一種飲食品。

抗氧化性分析

取黑蒜頭發酵乳(空白組為0%添加黑蒜頭泥)5mL以超音波振碎5次(每次60秒)，每次振碎處理後立即冰浴60秒，再以6,000g離心4小時，取上清液測定抗氧化性。測定之抗氧化活性項目包括：總抗氧化能力(TEAC)之測定(參考Miller等(1996)與Arnao(2001)的方法)、DPPH自由基清除效應(參考Shimada等(1992)的方法)、超氧陰離子清除效應(PMS-NADH法)(參考Robak and Gryglewski(1988)的方法)、過氧化氫清除效應(參考Pick and Mizel(1981)的方法)、羥基自由基清除效應(參考Halliwell等(1987)的方法)、還原力測定(參考Oyaizu(1988)的方法)、亞鐵離子螯合能力(參考Dinis等(1994)的方法)、抑制抗壞血酸自氧化活性(參考Mishra and Kovachich(1984)的方法)之能力。

抗氧化性分析統計分析

實驗數據以SPSS/PC統計分析軟體作變異數分析 (Analysis of variance,ANOVA)，測試控制組(有添加黑蒜頭)與空白組(0%添加黑蒜頭)各實驗組是否有差異，若有差異再以鄧肯氏多變試驗(Duncan’s multiple range test)作進一步分析。控制組(有添加黑蒜頭泥)與空白組(0%添加黑蒜頭泥)相比較，在統計學上抗氧化/消除自由基能力有明顯提高15%以上以〝○〞表示、抗氧化/消除自由基能力相比提高10~15%以〝△〞表示、抗氧化/消除自由基能力相比提高5~10%以〝-〞表示、抗氧化效果相比降低者以〝×〞表示。

發明結果

抗氧化性分析結果

乳酸菌發酵品具有抗氧化效果已為習知。本發明以黑蒜頭自身的抗氧化能力與乳酸菌結合發酵結合，由表1結果得知，不管以全脂鮮奶及黃豆奶與黑蒜頭發酵，所有發酵乳抗氧化能力檢測皆比未添加者提高。在以DPPH自由基清除效應、還原力測定、亞鐵離子螯合能力檢測上發酵乳抗氧化能力明顯提高15%以上。因黃豆中含有與抗氧化有關之成分，如：異黃酮、植酸、蛋白抑制劑及皂素(Corpet et al.1997,Jenab and Thompson 2000,Persky and van Horn 1995,Sautier et al.1979,Yu et al.1999)，及1977年Matkovics指出黃豆中含有豐富之超氧歧化酶。因此利用植物性奶類-黃豆奶，其抗氧化/消除自由基能力的檢測上，如：總抗氧化能力、超氧陰離子清除效應、抑制抗壞血酸自氧化活性，明顯比全脂牛奶發酵之黑蒜頭發酵乳高10~15%。另，過氧化氫清除效應、羥基自由基清除效應的能力都還能維持在5~10%之範圍。

代碼說明：M：脫脂牛奶、S：黃豆奶、1. Lactobacillus bulgaricus CCRC 14009、2. L.acidophilus CCRC 14079、3. Leuconostoc mesenteroides BCRC 12273、4. Streptococcus thermophilus CCRC 14085 5. Bifidobacterium infantis CCRC 14633；抗氧化/消除自由基能力有明顯提高15%以上以〝○〞表示、抗氧化/消除自由基能力相比提高10~15%以〝△〞表示、抗氧化/消除自由基能力相比提高5~10%以〝-〞表示、抗氧化/消除自由基能力相比降低者以〝×〞表示。

承如本申請案所述自然界中乳酸菌(含雙叉桿菌屬)繁多，不可能一一從事試驗，本發明提供食品生醫領域中常使用的乳酸菌進行實驗，本領域的技術人員應當理解，任何對本發明的技術方案進行乳品選擇的改變(如：全脂乳、脫脂乳、動物性及植物性乳品種類)、乳酸菌種改變進行單獨發酵、二種以上菌種的混合發酵、菌種分別從不同發酵時間點接種、乳酸菌營養源的改變(如：碳源由雙糖改變成單糖、寡糖等)的修改，都可能會導致落入本發明的保護範圍。

Claims (4)

1. 一種製造具有抗氧化/消除自由基能力之黑蒜頭發酵乳之方法，該方法包含下列步驟：(A)取動物性及植物性的奶類；(B)加入3~8%蔗糖及10%以內黑蒜頭泥(w/w)；(C)添加乳酸菌或雙叉桿菌；(D)於23~43℃進行發酵36~56小時後，即為具有抗氧化/消除自由基能力之黑蒜頭發酵乳。
2. 依據申請專利範圍第1項所述一種製造具有抗氧化/消除自由基能力之黑蒜頭發酵乳之方法，其中動物性及植物性的奶類分別為全脂牛奶及黃豆奶。
3. 依據申請專利範圍第1項所述一種製造具有抗氧化/消除自由基能力之黑蒜頭發酵乳之方法，其中乳酸菌為Lactobacillus bulgaricus CCRC 14009、L.acidophilus CCRC 14079、Leuconostoc mesenteroides BCRC 12273、Streptococcus thermophilus CCRC 14085，雙叉桿菌為Bifidobacterium infantis CCRC 14633。
4. 一種如申請專利範圍第1-3項任一項所述一種製造具有抗氧化/消除自由基能力之黑蒜頭發酵乳之方法之保健食品，其特徵在於包含黑蒜頭發酵乳與食品上可接受之載體、賦形劑或稀釋劑，並可製為可食入之形式，可為粉末、膠囊、液體或錠劑。