WO2015111598A1 - 乳酸菌の高濃度の培養法 - Google Patents

乳酸菌の高濃度の培養法 Download PDF

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悟 尾▲崎▼
圭介 古市
恵美 遠山
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株式会社明治
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a culturing method for lactic acid bacteria, and more particularly to a culturing method capable of increasing the concentration of lactic acid bacteria.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2006-230259
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 07-099968
  • Patent Document 4 07-099967 (Patent Document 4)
  • a culture method for removing lactic acid JP 2001-211878 (Patent Document 5)
  • a method for preparing a medium that can easily recover lactic acid bacteria from the culture solution JP 2007-089511 (Patent Document 6)
  • a co-culture method of lactic acid bacteria and filamentous fungi Japanese Patent Laid-Open No. 2006-238743 (Patent Document 7) has been proposed.
  • Non-patent Documents 1 and 2 the genus Lactococcus that metabolizes arginine is known (Non-patent Documents 1 and 2), and reactions involving arginine deiminase and ornithine carbamil transferase are known in the metabolic pathway.
  • the contents referring to the change in pH during arginine metabolism or during these reactions have not yet been reported.
  • Patent Document 8 describes a method for easily inspecting lactic acid bacteria constituting a lactic acid bacteria starter by culturing a lactic acid bacteria starter using a lactic acid bacteria growth medium supplemented with arginine. Yes. However, the amount of arginine added is very small, and no increase in pH is intended here.
  • Patent Document 9 describes a method for producing an L-ornithine-containing product in which lactic acid bacteria are used to ferment a protein containing L-arginine. However, the addition of L-arginine alone is not described.
  • Japanese Patent Laid-Open No. 2004-057020 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2006-230259 Japanese Unexamined Patent Publication No. 07-099968 Japanese Unexamined Patent Publication No. 07-099967 JP 2001-211878 A JP 2007-089511 A JP 2006-238743 A Japanese Unexamined Patent Publication No. 07-184687 JP 2009-112205 A
  • the present inventors have recently found that lactic acid bacteria capable of producing citrulline can be cultured at a high concentration by culturing lactic acid bacteria in a medium to which arginine is added in order to suppress a decrease in the pH of the medium. Got. More specifically, the present inventors have obtained knowledge that lactic acid bacteria can be cultured at a high concentration basically by controlling and controlling only the culture temperature without particular stirring. The present invention is based on these findings.
  • the object of the present invention is to provide a culture method capable of easily increasing the concentration of lactic acid bacteria.
  • the present invention relates to the following (1) to (7).
  • a method for cultivating lactic acid bacteria comprising culturing a lactic acid bacterium having a metabolic ability to convert arginine into citrulline in a medium to which arginine is added in order to suppress a decrease in pH of the medium.
  • Lactic acid bacteria are Lactococcus lactis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus buchneri, Enterococcus faecalis, Oenococcus oeni, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus amyloborus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus reuteri, The method for cultivating a lactic acid bacterium according to any one of (1) to (4), wherein the lactic acid bacterium is one or more selected from the group consisting of Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus crispatus, and Lactobacillus delbrecky.
  • the lactic acid bacterium is one or more selected from the group consisting of Lactococcus lactis subspecies lactis, Lactococcus lactis subspecies Cremoris, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus brevis, (5) The culture
  • lactic acid bacteria having citrulline-producing ability are cultured in a medium to which arginine is added, and basically (in principle), only the culture temperature is managed and controlled.
  • lactic acid bacteria can be cultured at a high concentration. Therefore, according to the method for cultivating lactic acid bacteria of the present invention, for example, with addition of an alkali, an apparatus / equipment for measuring the pH of the culture solution, or a change (decrease) in the pH of the culture solution, the alkali is added to the culture solution. Lactic acid bacteria can be cultured at a high concentration without requiring the equipment and equipment to be added.
  • lactic acid bacteria can be cultured at a high concentration using only a normal culture tank without using special equipment / equipment.
  • the lactic acid bacteria culture method of the present invention is advantageous and extremely useful compared to the conventional methods in that lactic acid bacteria can be easily cultured at a high concentration.
  • lactic acid bacteria having a metabolic ability for converting at least arginine to citrulline are cultured in a medium to which arginine is added.
  • lactic acid bacteria can be cultured at high concentration.
  • the number of microbial cells per 1 mL of the culture solution of lactic acid bacteria is preferably 2 times or more, more preferably 3 times or more, compared to when cultured in a medium not containing arginine. More preferably, it can be achieved (realized) 4 times or more, particularly preferably 5 times or more.
  • the lactic acid bacteria may have at least a metabolic ability to convert arginine to citrulline, but in one embodiment of the present invention, the lactic acid bacteria have the metabolic ability to convert citrulline to ornithine after converting arginine to citrulline. It is preferable to have.
  • the mechanism (reason) for culturing lactic acid bacteria at a high concentration by adding arginine to the medium is considered as follows. That is, at least a lactic acid bacterium having a metabolic ability to convert arginine to citrulline, and a lactic acid bacterium having a metabolic ability to convert citrulline to ornithine after converting arginine to citrulline, arginine is converted to citrulline by arginine deiminase. Citrulline is converted to ornithine by ornithine carbamyltransferase. In these reactions, arginine and citrulline are deaminated to generate ammonia. It is believed that this ammonia can suppress the decrease in the pH of the medium accompanying the production of lactic acid and culture lactic acid bacteria at a high concentration.
  • lactic acid bacteria include Lactococcus lactis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus buchneri, Enterococcus faecalis, Oenococcus oeni, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus amyloborus, Lactobacillus brevis, Examples include Lactobacillus belonging to Lactobacillus reuteri, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus delbrecky.
  • lactic acid bacteria include Lactococcus lactis ssp lactis, Lactococcus lactis ssp cremoris, Lactococcus lactis ssp cremoris, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus brevis.
  • Lactococcus lactis ssp lactis JCM5805T Lactococcus lactis ssp lactis IFO12007
  • Lactococcus lactis ssp lactis MEP1706301 Lactococcus lactis ssp lactis MEP1706302
  • Lactococcus lactis ssp lactis MEP1706303 Lactococcus lactis ssp cremoris JCM16167T
  • Lactococcus lactis ssp cremoris MEP1706304 Lactococcus and lactis ssp cremoris MEP1706305
  • Lactobacillus reuteri JCM1112T Lactobacillus brevis JCM1061.
  • the medium may be appropriately selected.
  • skim milk, skim concentrated milk, skim milk powder (reduced skim milk), and protein products whey, whey concentrate, whey powder of these skim milk components (Reduced whey), and protein degradation products of these whey components, raw milk, pasteurized milk (full-fat milk), full-fat concentrated milk, full-fat powdered milk (reduced full-fat milk), and protein breakdown products of these full-fat milk components
  • a medium containing skim milk, skim milk powder, and a protein degradation product of these skim milk components, whey, whey powder, and a medium containing a protein degradation product of these whey components is more preferable, skim milk, skim milk powder, whey, A medium containing whey powder is more preferred.
  • lactic acid bacteria are cultured in a medium to which arginine is added.
  • the amount of arginine added to the medium may be appropriately determined in consideration of the amount of microbial cells (the number of microbial cells), the amount of lactic acid produced, the amount of ammonia produced that is thought to suppress the decrease in pH, and the like. For example, it is preferably 0.5 to 15% by mass, the lower limit is more preferably 1% by mass, still more preferably 2% by mass, and the upper limit is preferably 12% by mass. This is because, in particular, the production amount of ammonia considered to suppress the decrease in pH becomes appropriate.
  • arginine may be added to the medium before the start of cultivation of lactic acid bacteria, and it is not essential to add arginine to the culture medium during cultivation of lactic acid bacteria, but considering the pH of the culture liquid. However, this does not exclude an aspect (concept) in which arginine is additionally added to the culture solution during the cultivation of lactic acid bacteria.
  • the present invention also includes an embodiment in which arginine is added to the culture solution only during the cultivation of lactic acid bacteria, without adding arginine to the medium before the start of lactic acid bacteria culture. Addition of arginine during culturing of lactic acid bacteria may be performed intermittently, continuously, or a combination thereof. Even if arginine is added to the culture solution during cultivation of lactic acid bacteria, the amount of arginine added is preferably as described above in terms of the total amount.
  • “medium to which arginine is added” means a medium to which arginine is artificially or positively added for the purpose of suppressing a decrease in pH of the medium or the culture solution. Therefore, in the culture of lactic acid bacteria, for example, an aspect in which arginine is accidentally included in the medium or culture solution is not included in the scope of the present invention. However, the present invention does not exclude even a mode in which arginine is contained in a medium or a culture solution (for example, in a trace amount) in a situation where other people cannot be involved under the laws of nature.
  • the culture conditions are not particularly limited, and the culture temperature may be set to an optimum temperature for the lactic acid bacteria to be actually cultured, for example, preferably 28 to 40 ° C, more preferably 29 to 38 ° C. More preferably, it is 30 to 36 ° C.
  • the culture temperature is preferably controlled and controlled within a desired range during the cultivation of lactic acid bacteria.
  • the culture time may be appropriately set according to the type of lactic acid bacteria to be actually cultured. For example, it is preferably 4 to 48 hours, more preferably 8 to 36 hours, and further preferably 12 to 24 hours. .
  • lactic acid bacteria can be culture
  • the pH of the medium compared with the case where arginine is not added to the medium, a decrease in the pH of the culture solution is suppressed.
  • the pH of the medium often decreases as the culturing time elapses, but then starts to increase.
  • the pH of the medium may gradually decrease with the passage of the culture time, even if it is still in a high state, compared to the case where arginine is not added.
  • the history (profile) of the change in the pH of the medium is There is no particular limitation.
  • the culture conditions for this activation culture may be set as appropriate according to the type of lactic acid bacteria to be actually cultured.
  • the lactic acid bacteria obtained at a high concentration as described above are used as they are or after centrifuging the cells. Specifically, it can be used as a starter for producing fermented foods. At this time, by increasing the concentration of lactic acid bacteria, it is possible to obtain a large amount of effective components that affect the flavor, texture, physical properties, quality, etc. of fermented foods and functional components that are metabolized by lactic acid bacteria.
  • the bacterial cell concentration was measured by the method for measuring the number of lactic acid bacteria described in "Ministerial Ordinance on Milk and Dairy Product Component Standards (Ministerial Ordinance on Milk) (Japan)". However, the culture temperature of the BCP medium was 30 ° C. The ammonia concentration was measured with a biosensor (BF-7, manufactured by Oji Scientific Instruments). The arginine concentration, citrulline concentration, ornithine concentration, and lactic acid concentration were measured by the HPLC method.
  • Example 1 The following five strains of Lactococcus lactis ssp lactis having the metabolic ability to convert arginine to ornithine were prepared. (1) Lactococcus lactis ssp lactis JCM5805T (2) Lactococcus lactis ssp lactis IFO12007 (3) Lactococcus lactis ssp lactis MEP1706301 (4) Lactococcus lactis ssp lactis MEP1706302 (5) Lactococcus lactis ssp lactis MEP1706303 The above (3) to (5) are strains isolated from raw milk in Tokachi region by the applicant of the present invention.
  • the above-mentioned strain was activated several times in a normal MRS medium before use.
  • the culture solution of the activated strain at a ratio of 1% (based on the amount of the medium) Inoculated and cultured.
  • glucose is mixed with the MRS medium before sterilizing the MRS medium (121 ° C, 15 minutes), and arginine is sterilized by filtration after neutralizing with 0.4 volumes of citric acid after sterilizing the MRS medium.
  • MRS medium Since the MRS medium originally contains glucose at 2%, it will contain glucose at 3% at the time of the first start in this experiment.
  • the culture conditions were 30 ° C. and 16 hours, and no agitation was performed during the culture.
  • the cell density and culture medium OD (600 nm) after these cultures were measured. The results are shown in Table 1. In the medium added with arginine, the cell concentration increased 2.2 to 8.5 times and the OD of the culture solution increased 2.2 to 4.1 times compared to the medium not added with arginine.
  • arginine (Arg), citrulline (Cit), and ornithine (Orn) concentrations of the culture broth after these cultures were measured. The results are shown in Table 2. Most of the arginine initially added to the medium was converted to ornithine. From this result, lactic acid bacteria convert arginine to ornithine, release ammonia in the process, and raise the pH of the culture solution. It was thought that the bacterial cell concentration (the number of bacteria) increased.
  • Example 2 The following three strains of Lactococcus lactis ssp cremoris having the ability to convert arginine into ornithine were prepared and cultured under the same conditions as in Example 1. (6) Lactococcus lactis ssp cremoris JCM16167T (7) Lactococcus lactis ssp cremoris MEP1706304 (8) Lactococcus lactis ssp cremoris MEP1706305 The above (7) and (8) are strains isolated from raw milk in Tokachi region by the applicant of the present invention.
  • Table 3 shows the microbial cell concentration and OD (600 nm) of the culture solution after culturing.
  • the bacterial cell concentration increased by 2.7 to 6.2 times and the OD of the culture broth increased by 1.4 to 4.5 times compared to the medium not added with arginine.
  • This result also suggests that lactic acid bacteria converted arginine to ornithine and released ammonia in the process to raise the pH of the culture solution, and the growth of the cell body was promoted by the increase in the pH of the culture solution. It was.
  • Example 3 The following two strains having the metabolic ability to convert arginine to ornithine were prepared and cultured under the same conditions as in Example 1. However, the culture temperature was 37 ° C. (9) Lactobacillus reuteri JCM1112T (10) Lactobacillus brevis JCM1061
  • FIG. 3 shows the change in pH over time during the culture. In the culture of all strains, the decrease in pH was suppressed in the medium supplemented with arginine.
  • Table 4 shows the OD (600 nm) of the cultures after these cultures.
  • the OD of the culture increased 1.1 to 1.4 times compared to the medium not added with arginine. This result also suggests that lactic acid bacteria converted arginine to ornithine and released ammonia in the process to raise the pH of the culture solution, and the growth of the cell body was promoted by the increase in the pH of the culture solution. It was.
  • Example 4 The following 3 strains used in Example 1 were cultured under the same conditions as in Example 1 except that the medium mainly composed of MRS medium was replaced with the medium mainly composed of milk medium.
  • Lactococcus lactis ssp lactis JCM5805T (4) Lactococcus lactis ssp lactis MEP1706302 (5) Lactococcus lactis ssp lactis MEP1706303
  • the above-mentioned strain was activated several times in a normal MRS medium before use.
  • a reduced skim milk medium (10% aqueous solution of skim milk powder (Low heat) containing 0.5% yeast extract (P2G: manufactured by Asahi Food & Healthcare), 2% arginine and 0.8% citric acid, Sterilized (95 ° C., 5 minutes) manufactured by Meiji Co., Ltd. (hereinafter also referred to as “reduced skim milk medium”) was used.
  • the reduced skim milk medium was inoculated with the culture solution of the activated strain at a ratio of 1% (vs. medium) and cultured. The culture conditions were 30 ° C. and 16 hours, and no agitation was performed during the culture.
  • FIG. 4 shows the change in pH over time during the culture. In the culture of all strains, the decrease in pH was suppressed in the medium supplemented with arginine.
  • Table 5 shows the cell concentrations after culturing.
  • the bacterial cell concentration increased 1.2 to 2.2 times compared to the medium not added with arginine.
  • the addition of arginine suppresses the decrease in the pH of the culture solution, and the growth of the bacterial cells. It was confirmed that lactic acid bacteria can be cultured at a high concentration.
  • Example 5 The following strains were cultured under the same conditions as in Example 4 except that the amount of arginine added was changed to change the composition of the medium. (4) Lactococcus lactis ssp lactis MEP1706302
  • Reduced skim milk medium containing yeast extract P2G: Asahi Food & Healthcare
  • yeast extract P2G: Asahi Food & Healthcare
  • citric acid 0.4 times the above arginine concentration Reduced by sterilization (95 ° C, 5 minutes) of 10% aqueous solution of skim milk powder (Low heat), 0.1% yeast extract, 3% arginine and 1.2% citric acid
  • a whey medium (10% aqueous solution of whey powder, manufactured by Meiji Co., Ltd.) sterilized (95 ° C., 5 minutes) (hereinafter also referred to as “reduced whey medium”) was used.
  • the reduced skim milk medium and the reduced whey medium were inoculated with the culture solution of the activated strain at a ratio of 1% (vs. medium) and cultured.
  • the culture conditions were 32.5 ° C. and 16 hours, and no agitation was performed during the culture.
  • arginine, ornithine, ammonia, lactic acid, and bacterial cell concentrations were measured 2, 4, 8, and 16 hours after the start of these cultures. The results are shown in Table 6. Between 8 and 16 hours after the start of these cultures, arginine is converted to ornithine, and arginine is converted to ornithine. Was confirmed to increase to about twice the ornithine concentration. Although the lactic acid concentration increased with the progress of culture, it was considered that the pH of the culture solution did not decrease because the pH was neutralized by the production of ammonia.
  • arginine Comparing the cell concentration in the reduced skim milk medium 16 hours after the start of culture, arginine is 3.0 ⁇ 10 9 at 0%, whereas arginine is 2 ⁇ 1.0 ⁇ 10 10 and arginine is 3%.
  • arginine was 3.0 ⁇ 10 9 at 0%
  • arginine is 2 ⁇ 1.0 ⁇ 10 10
  • arginine is 3%.
  • 4% arginine was 1.6 ⁇ 10 10
  • the addition of arginine suppresses the decrease in the pH of the culture solution, promotes the growth of the bacterial cells, and can cultivate lactic acid bacteria at a high concentration. confirmed.
  • Example 6 The following strains were cultured under the same conditions as in Example 5 except that the amount of arginine added was changed and the culture time was up to 22 hours. (4) Lactococcus lactis ssp lactis MEP1706302 Arginine, citrulline, ornithine, lactic acid, and bacterial cell concentrations were measured at 16 and 22 hours from the start of culture. The results were as shown in Table 7.

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Abstract

　特に撹拌などしなくても、基本的には、培養温度のみを管理・制御するだけで、簡便に乳酸菌を高濃度化できる培養法が開示されている。この方法は、ラクトコッカス・ラクティス、ラクトバチルス・ロイテリまたはラクトバチルス・ブレビスなど、アルギニンをシトルリンに変換する代謝能を有する乳酸菌、あるいはアルギニンをシトルリンに変換した後に、シトルリンをオルニチンに変換する代謝能を有する乳酸菌を、培地のｐＨの低下を抑制するために、アルギニンを添加してなる培地で培養することを特徴とする。

Description

乳酸菌の高濃度の培養法
　本発明は、乳酸菌の培養法に関し、さらに詳しくは、乳酸菌を高濃度化できる培養法に関する。
　乳酸菌を培養すると、乳酸菌の作用により乳糖が乳酸に代謝される。一般的に、この乳酸は培地（培養液）のpHを低下させ、その結果、乳酸菌の増殖は抑制される。このような乳酸菌の増殖抑制を回避し、乳酸菌を高濃度で増殖させるために、従来、例えば、乳酸菌の培養中において、培地（培養液）のpHを測定しながら、アルカリ（炭酸カリウム、水酸化ナトリウムなど）を培地（培養液）に添加し、培地（培養液）のpHを所定の範囲に維持・管理して培養する方法が採られていた。
　例えば、乳酸菌を高濃度化できる培養方法として、炭酸マグネシウムを添加してpHの低下を防ぎながら、微生物を培養する方法（特開2004-057020号公報（特許文献１））、乳酸菌の増殖促進物質を使用する培養法（特開2006-230259号公報（特許文献２）、特開平07-099968号公報（特許文献３）、特開平07-099967号公報（特許文献４））、乳酸菌の培養中に乳酸を取り除く培養法（特開2001-211878号公報（特許文献５））、乳酸菌を培養液中から容易に回収できる培地の調製法（特開2007-089511号公報（特許文献６））、乳酸菌と糸状菌の共培養法（特開2006-238743号公報（特許文献７））などが提案されている。
　ところで、アルギニンを代謝するラクトコッカス属が知られており（非特許文献１および２）、また、その代謝経路において、アルギニンデイミナーゼやオルニチンカーバミルトランスフェラーゼが関与する反応が知られている。しかし、本発明者らの知る限り、アルギニン代謝時またはこれら反応時のpHの変化などに言及した内容は未だに報告されていない。
　また、特開平07-184687号公報（特許文献８）には、アルギニンを添加した乳酸菌生育培地を用いて、乳酸菌スターターを培養し、乳酸菌スターターを構成する乳酸菌を簡便に検査する方法が記載されている。しかし、アルギニンの添加量は微量であり、ここでは、pHの上昇は意図されていない。また、特開2009-112205号公報（特許文献９）には、乳酸菌を用いて、Ｌ－アルギニンを含むタンパク質を発酵させる、Ｌ－オルニチン含有物の製造方法が記載されている。しかし、Ｌ－アルギニン単体の添加は記載されていない。
特開2004-057020号公報 特開2006-230259号公報 特開平07-099968号公報 特開平07-099967号公報 特開2001-211878号公報 特開2007-089511号公報 特開2006-238743号公報 特開平07-184687号公報 特開2009-112205号公報
Crow V. L., T. D. Thomas. 1982. Arginine metabolism in lactic streptococci. J. Bacteriol. 150:1024-1032. Poolman B., A. J. M. Driessen, W. N. Konings. 1987. Regulation of arginine-ornithine exchange and arginine deiminase pathway in Streptococcus lactis. Bacteriol., 169 5597-5604
　本発明者らは、今般、シトルリン産生能を有する乳酸菌を、培地のｐＨの低下を抑制するために、アルギニンを添加してなる培地で培養することで、乳酸菌を高濃度に培養できるとの知見を得た。より具体的には、特に撹拌などしなくても、基本的には、培養温度のみを管理・制御することで、乳酸菌を高濃度に培養できるとの知見を得た。本発明は、これらの知見に基づくものである。
　従って、本発明は、簡便に乳酸菌を高濃度化できる培養法の提供をその目的としている。
　すなわち、本発明は、以下の（１）から（７）に関する。
（１）アルギニンをシトルリンに変換する代謝能を有する乳酸菌を、培地のｐＨの低下を抑制するために、アルギニンを添加してなる培地において培養することを特徴とする、乳酸菌の培養法。
（２）乳酸菌の培養液の１ｍＬあたりの菌体数がアルギニンを含まない培地で培養した時に比べて２倍以上となる、（１）に記載の乳酸菌の培養法。
（３）乳酸菌がアルギニンをシトルリンに変換した後に、シトルリンをオルニチンに変換する代謝能を有する、（１）または（２）に記載の乳酸菌の培養法。
（４）アルギニンを培地に０．５～１５質量％で添加する、（１）～（３）のいずれかに記載の乳酸菌の培養法。
（５）乳酸菌がラクトコッカス・ラクティス、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ブフネリ、エンテロコッカス・フェーカリス、オエノコッカス・オエニ、ペディオコッカス・ペントサセウス、ラクトバチルス・アミロボラス、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・クリスパータス、ラクトバチルス・デルブレッキーからなる群から選択される１種または２種以上である、（１）～（４）のいずれかに記載の乳酸菌の培養法。
（６）乳酸菌がラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・ブレビスからなる群から選択される１種または２種以上である、（５）に記載の乳酸菌の培養法。
（７）培養液を攪拌しない、（１）～（６）のいずれかに記載の乳酸菌の培養法。
　本発明の乳酸菌の培養法によれば、シトルリン産生能を有する乳酸菌を、アルギニンを添加してなる培地で培養して、基本的には（原則的には）、培養温度のみを管理・制御することで、乳酸菌を高濃度に培養できる。従って、本発明の乳酸菌の培養法によれば、例えば、アルカリを添加しながら、培養液のpHを測定する装置・設備や、培養液のpHの変化（低下）に伴い、アルカリを培養液に添加する装置・設備を必須とせずに、乳酸菌を高濃度に培養できる。すなわち、基本的には、特殊な装置・設備を使用せず、通常の培養槽のみを使用して、乳酸菌を高濃度に培養できるため、培養工程で不具合が発生しにくい。このため、本発明の乳酸菌の培養法では、簡便に乳酸菌を高濃度に培養できる点で、従来法に比べて有利であり、その有用性は極めて高いと言える。
アルギニンを添加したMRS培地における、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスJCM5805T株、IFO12007株、MEP1706301株、MEP1706302株およびMEP1706303株の培養時のpHの変化を示すグラフである。 アルギニンを添加したMRS培地における、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスJCM16167T株、MEP1706304株およびMEP1706305株の培養時のpHの変化を示すグラフである。 アルギニンを添加したMRS培地における、ラクトバチルス・ロイテリJCM1112T株およびラクトバチルス・ブレビスJCM1061株の培養時のpHの変化を示すグラフである。 アルギニンを添加した還元脱脂乳培地における、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスJCM5805T株、MEP1706302株およびMEP1706303株の培養時のpHの変化を示すグラフである。 アルギニンを添加した還元脱脂乳培地と還元ホエイ培地における、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスMEP1706302株の培養時のpHの変化を示すグラフである。
高濃度の培養
　本発明では、少なくともアルギニンをシトルリンに変換する代謝能を有する乳酸菌を、アルギニンを添加してなる培地において培養する。これにより、乳酸菌を高濃度に培養できることとなる。具体的には、本発明では、乳酸菌の培養液の１ｍＬあたりの菌体数（生菌数）がアルギニンを含まない培地で培養した時に比べて、好ましくは２倍以上、より好ましくは３倍以上、さらに好ましくは４倍以上、特に好ましくは５倍以上を達成（実現）することができる。
乳酸菌
　本発明では、乳酸菌が少なくともアルギニンをシトルリンに変換する代謝能を有すればよいが、本発明の一つの態様では、乳酸菌がアルギニンをシトルリンに変換した後に、シトルリンをオルニチンに変換する代謝能を有することが好ましい。
　本発明では、アルギニンを培地に添加することで、乳酸菌を高濃度に培養できる機構（理由）について、下記のように考えている。すなわち、少なくともアルギニンをシトルリンに変換する代謝能を有する乳酸菌、さらにアルギニンをシトルリンに変換した後に、シトルリンをオルニチンに変換する代謝能を有する乳酸菌では、アルギニンデイミナーゼにより、アルギニンをシトルリンに変換し、さらにオルニチンカーバミルトランスフェラーゼにより、シトルリンをオルニチンに変換する。そして、これらの反応では、アルギニンおよびシトルリンの脱アミノ化が起こり、アンモニアを発生する。このアンモニアが乳酸の産生に伴う培地のpHの低下を抑制して、乳酸菌を高濃度に培養できると考えている。
　本発明では、乳酸菌の好ましい例として、ラクトコッカス・ラクティス、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ブフネリ、エンテロコッカス・フェーカリス、オエノコッカス・オエニ、ペディオコッカス・ペントサセウス、ラクトバチルス・アミロボラス、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・クリスパータス、ラクトバチルス・デルブレッキーに属する乳酸菌が挙げられる。
　本発明では、乳酸菌のより好ましい例として、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Lactococcus lactis ssp lactis）、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Lactococcus lactis ssp cremoris）、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・ブレビスが挙げられ、具体的には、Lactococcus lactis ssp lactis JCM5805T、Lactococcus lactis ssp lactis IFO12007、Lactococcus lactis ssp lactis MEP1706301、Lactococcus lactis ssp lactis MEP1706302、Lactococcus lactis ssp lactis MEP1706303、Lactococcus lactis ssp cremoris JCM16167T、Lactococcus lactis ssp cremoris MEP1706304、Lactococcus lactis ssp cremoris MEP1706305、Lactobacillus reuteri JCM1112T、Lactobacillus brevis JCM1061が挙げられる。
培地
　本発明では、培地は適宜選択されればよいが、例えば、脱脂乳、脱脂濃縮乳、脱脂粉乳（還元脱脂乳）、およびこれら脱脂乳成分のタンパク質分解物、ホエイ、ホエイ濃縮物、ホエイ粉（還元ホエイ）、およびこれらホエイ成分のタンパク質分解物、生乳、殺菌乳（全脂乳）、全脂濃縮乳、全脂粉乳（還元全脂乳）、およびこれら全脂乳成分のタンパク質分解物などを含む培地が好ましく、脱脂乳、脱脂粉乳、およびこれら脱脂乳成分のタンパク質分解物、ホエイ、ホエイ粉、およびこれらホエイ成分のタンパク質分解物を含む培地がより好ましく、脱脂乳、脱脂粉乳、ホエイ、ホエイ粉を含む培地がさらに好ましい。
アルギニンの添加
　本発明では、アルギニンを添加してなる培地で、乳酸菌を培養する。アルギニンの培地への添加量は、菌体量（菌体数）、乳酸の産生量、pHの低下を抑制していると考えられるアンモニアの産生量などを勘案して適宜決定されればよいが、例えば、好ましくは０．５～１５質量％であり、下限がより好ましくは１質量％、さらに好ましくは２質量％であり、上限が好ましくは１２質量％である。これは特に、pHの低下を抑制していると考えられるアンモニアの産生量が適切になるためである。
　本発明では、乳酸菌の培養の開始前に、アルギニンを培地に添加すればよく、乳酸菌の培養中に、アルギニンを培養液に追加で添加することは必須ではないが、培養液のpHを勘案しながら、乳酸菌の培養中に、アルギニンを培養液に追加で添加する態様（概念）を除外するものではない。また、本発明では、乳酸菌の培養の開始前に、アルギニンを培地に添加せずに、乳酸菌の培養中にのみ、アルギニンを培養液に添加する態様も包含する。乳酸菌の培養中におけるアルギニンの添加は、断続的に行ってもよいし、継続的に行ってもよく、またこれらを組合せた態様であってもよい。なお、乳酸菌の培養中に、アルギニンを培養液に添加する態様であっても、アルギニンの添加量は、その総量において、上記の通りであることが好ましい。
　本発明において、「アルギニンを添加してなる培地」とは、培地または培養液のｐＨの低下を抑制することを少なくとも目的として、アルギニンが人為的または積極的に添加された培地を意味する。したがって、乳酸菌の培養にあって、例えば偶発的に培地または培養液にアルギニンが含まれる態様は本発明の範囲には包含されない。もっとも、自然法則の下その他の人が関与し得ない状況下でアルギニンが培地または培養液に（例えば、極微量に）含まれる態様までをも除外するものではない。
培養条件
　本発明では、培養条件は特に限定されず、培養温度は、実際に培養する乳酸菌の至適温度に設定すればよいが、例えば、好ましくは２８～４０℃、より好ましくは２９～３８℃、さらに好ましくは３０～３６℃である。このとき、培養温度は、乳酸菌の培養中に所望の範囲に管理・制御されていることが好ましい。そして、培養時間は、実際に培養する乳酸菌の種類などに合せて適宜設定すればよいが、例えば、好ましくは４～４８時間、より好ましくは８～３６時間、さらに好ましくは１２～２４時間である。ところで、本発明では、乳酸菌の培養中に培養液を攪拌しなくてもよく、そのような条件でも、乳酸菌を高濃度に培養できることとなる。そのため、乳酸菌の培養中に培養液を攪拌するためのエネルギーや電気代などの使用量を低減する観点から、培養液を攪拌しないことが好ましい。なお、本発明では、乳酸菌の培養中に培養液を攪拌することは必須ではないが、乳酸菌の培養中に培養液を攪拌する態様（概念）を排除するものではない。つまり、乳酸菌の培養中に培養液を適宜攪拌することで、乳酸菌をより高濃度に培養できることとなる。
　本発明では、アルギニンを培地に添加しない場合と比べて、培養液のpHの低下が抑制される。後記の実施例に示される通り、本発明では、しばしば培地のpHは、培養時間の経過と共に、一旦は低下することがあるが、その後に上昇に転じる。また、本発明では、アルギニンを添加していない場合と比べて、培地のpHは、培養時間の経過と共に、依然として高い状態にあっても、徐々に低下することがある。なお、本発明では、アルギニンを添加していない場合と比べて、培地のpHの低下が抑制され、菌体濃度が所望の高い状態を実現できる限り、培地のpHの変化の経緯（プロフィール）は特に限定されない。
　また、本発明では、上記の培養の前に、乳酸菌を賦活培養することが好ましい。この賦活培養の培養条件は、実際に培養する乳酸菌の種類などに合せて適宜設定すればよい。
　以上のようにして高濃度で得られた乳酸菌は、そのまま、あるいは菌体を遠心分離などしてから利用される。具体的には、発酵食品の製造のためのスターターとして利用することができる。このとき、乳酸菌を高濃度化することで、発酵食品の風味、食感、物性、品質などに影響する有効な成分や、乳酸菌の代謝する機能性の成分などを多量に得ることができる。
　以下、本発明を実施例により、さらに詳しく説明する。ただし、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。
　なお、下記の実施例において特に断らない限り、百分率は質量基準である。また、菌体濃度は「乳及び乳製品の成分規格等に関する省令（乳等省令）（日本国）」に記載の乳酸菌数の測定法により測定した。ただし、ＢＣＰ培地の培養温度は３０℃とした。アンモニア濃度は、バイオセンサー（BF-7、王子計測機器株式会社製）により測定した。また、アルギニン濃度、シトルリン濃度、オルニチン濃度、乳酸濃度はＨＰＬＣ法により測定した。
実施例１
　アルギニンをオルニチンに変換する代謝能を有するラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Lactococcus lactis ssp lactis）の下記の５菌株を用意した。
（１）Lactococcus lactis ssp lactis JCM5805T
（２）Lactococcus lactis ssp lactis IFO12007
（３）Lactococcus lactis ssp lactis MEP1706301
（４）Lactococcus lactis ssp lactis MEP1706302
（５）Lactococcus lactis ssp lactis MEP1706303
　上記（３）～（５）は、本発明の出願人が十勝地方の生乳から分離した菌株である。
　通常のMRS培地にて、上記の菌株を数回で賦活してから使用した。まず、グルコースを1%とアルギニンを2%で添加したMRS培地、またはグルコースを1%で添加したMRS培地に、前記の賦活した菌株の培養液を1%の比率（培地量に対して）で接種して培養した。ここで、グルコースは、MRS培地を滅菌（121℃、15分間）する前に、MRS培地に混合し、アルギニンは、MRS培地を滅菌した後に、0.4倍量のクエン酸で中和して濾過滅菌して、MRS培地に混合した。なお、MRS培地は、元からグルコースを2%で含むため、本実験における初発の時点でグルコースを3%で含むこととなる。培養条件は30℃、16時間とし、培養中に撹拌しなかった。
　これらの培養中におけるpHの経時変化を図１に示した。全ての菌株の培養において、アルギニンを添加しない培地では、培養液のpHが4.5付近まで低下した。一方、アルギニンを添加した培地では、pHが5.5前後まで低下してから上昇に転じ、pHの低下が抑制された。
　これらの培養後における菌体濃度と培養液のOD（600 nm）を測定した。その結果を表１に示した。アルギニンを添加した培地では、アルギニンを添加しない培地に比べて、菌体濃度は2.2～8.5倍に、培養液のODは2.2～4.1倍に上昇した。
　これらの培養後における培養液のアルギニン（Arg）、シトルリン（Cit）、オルニチン（Orn）濃度を測定した。その結果を表２に示した。最初に培地へ添加したアルギニンの大部分がオルニチンに変換されていた。この結果から、乳酸菌がアルギニンをオルニチンへ変換し、その過程でアンモニアを放出して、培養液のpHを上昇させると共に、培養液のpHの上昇により、菌体の増殖が促進され、培養後の菌体濃度（菌数）が高まったと考えられた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例２
　アルギニンをオルニチンに変換する代謝能を有するラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Lactococcus lactis ssp cremoris）の下記の３菌株を用意し、実施例１と同様の条件で培養した。
（６）Lactococcus lactis ssp cremoris JCM16167T
（７）Lactococcus lactis ssp cremoris MEP1706304
（８）Lactococcus lactis ssp cremoris MEP1706305
　上記（７）および（８）は、本発明の出願人が十勝地方の生乳から分離した株である。
　これらの培養中におけるpHの経時変化を図２に示した。全ての菌株の培養において、アルギニンを添加した培地では、pHの低下が抑制された。
　これらの培養後における菌体濃度と培養液のOD（600 nm）を表３に示した。アルギニンを添加した培地では、アルギニンを添加しない培地に比べて、菌体濃度は2.7～6.2倍、培養液のODは1.4～4.5倍に上昇した。この結果からも、乳酸菌がアルギニンをオルニチンへと変換し、その過程でアンモニアを放出して、培養液のpHを上昇させると共に、培養液のpHの上昇により、菌体の増殖が促進されたと考えられた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
実施例３
　アルギニンをオルニチンに変換する代謝能を有する下記の２菌株を用意し、実施例１と同様の条件で培養した。ただし、培養温度は37℃とした。
（９）Lactobacillus reuteri JCM1112T
（１０）Lactobacillus brevis JCM1061
　これらの培養中におけるpHの経時変化を図３に示した。全ての菌株の培養において、アルギニンを添加した培地では、pHの低下が抑制された。
　これらの培養後における培養液のOD（600 nm）を表４に示した。アルギニンを添加した培地では、アルギニンを添加しない培地に比べて、培養液のODは1.1～1.4倍に上昇した。この結果からも、乳酸菌がアルギニンをオルニチンへと変換し、その過程でアンモニアを放出して、培養液のpHを上昇させると共に、培養液のpHの上昇により、菌体の増殖が促進されたと考えられた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
実施例４
　実施例１において用いた下記３菌株を、MRS培地を主成分とする培地から、乳培地を主成分とする培地に代えて、実施例１と同様の条件で培養した。
（１）Lactococcus lactis ssp lactis JCM5805T
（４）Lactococcus lactis ssp lactis MEP1706302
（５）Lactococcus lactis ssp lactis MEP1706303
　通常のMRS培地にて、上記の菌株を数回で賦活してから使用した。そして、培地として、酵母エキス（P2G：アサヒフード＆ヘルスケア製）を0.5%、アルギニンを2%、クエン酸を0.8%で添加した還元脱脂乳培地（脱脂粉乳（Low heat）の10%水溶液、株式会社明治製）を殺菌（95℃、5分間）したもの（以下「還元脱脂乳培地」ともいう。）を使用した。上記の還元脱脂乳培地に、前記の賦活した菌株の培養液を1%の比率（対・培地）で接種して培養した。培養条件は30℃、16時間とし、培養中に撹拌しなかった。
　これらの培養中におけるpHの経時変化を図４に示した。全ての菌株の培養において、アルギニンを添加した培地では、pHの低下が抑制された。
　これらの培養後における菌体濃度を表５に示した。アルギニンを添加した培地では、アルギニンを添加しない培地に比べて、菌体濃度は1.2～2.2倍に上昇した。つまり、乳培地を主成分に使用した場合でも、MRS培地を主成分に使用した場合と同様に、アルギニンを添加することで、培養液のpHの低下が抑制されると共に、菌体の増殖が促進され、乳酸菌を高濃度で培養できることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
実施例５
　下記の菌株を、アルギニンの添加量を変えて、培地の組成を変えた以外は、実施例４と同様の条件で培養した。
（４）Lactococcus lactis ssp lactis MEP1706302
　培地として、酵母エキス（P2G：アサヒフード＆ヘルスケア製）を0.1%、アルギニンを0、2、3、または4%、クエン酸を前述の各アルギニン濃度の0.4倍量で添加した還元脱脂乳培地（脱脂粉乳（Low heat）の10%水溶液、株式会社明治製）を殺菌（95℃、5分間）したものと、酵母エキスを0.1%、アルギニンを3%、クエン酸を1.2%で添加した還元ホエイ培地（ホエイ粉の10%水溶液、株式会社明治製）を殺菌（95℃、5分間）したもの（以下「還元ホエイ培地」ともいう）を使用した。上記の還元脱脂乳培地と還元ホエイ培地に、前記の賦活した菌株の培養液を1%の比率（対・培地）で接種して培養した。培養条件は32.5℃、16時間とし、培養中に撹拌しなかった。
　これらの培養中におけるpHの経時変化を図５に示した。アルギニンを添加した培地では、培養の開始から8～10時間後に、pHが上昇していたが、その後に、pHは低下した。アルギニンの添加量が多いほど、pHの低下する時期が遅くなり、pHの上昇する変化幅が大きくなった。なお、還元脱脂乳培地と還元ホエイ培地では、pHの経時変化に明らかな差異は見られなかった。
　これらの培養の開始から2、4、8、および16時間後におけるアルギニン、オルニチン、アンモニア、乳酸、菌体濃度を測定した。その結果を表６に示した。これらの培養の開始から8時間後と16時間後の間に、アルギニンがオルニチンへと変換されていること、アルギニンのオルニチンへの変換が開始されると同時に、アンモニアの生産も開始され、アンモニア濃度はオルニチン濃度の約2倍に増加することが確認された。培養の経過に伴って、乳酸濃度が上昇しているにも関わらず、培養液のpHが低下していないのは、アンモニアの生産により、pHが中和されているものと考えられた。
　培養の開始から16時間後の、還元脱脂乳培地における菌体濃度を比較すると、アルギニンが0%では3.0×109であるのに対し、アルギニンが2%では1.0×1010、アルギニンが3%では1.3×1010、アルギニンが4%では1.6×1010であり、アルギニンを高濃度で添加するにつれて、菌体濃度が上昇していた。また、還元脱脂乳培地と還元ホエイ培地では、菌体濃度に明らかな差異は見られなかった。つまり、還元ホエイ培地でも、還元脱脂乳培地と同様に、アルギニンを添加することで、培養液のpHの低下が抑制されると共に、菌体の増殖が促進され、乳酸菌を高濃度で培養できることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
実施例６
　下記の菌株を、アルギニンの添加量を変え、培養時間を２２時間までとした以外は、実施例５と同様の条件で培養した。
（４）Lactococcus lactis ssp lactis MEP1706302
　培養の開始から１６時間および２２時間語におけるアルギニン、シトルリン、オルニチン、乳酸、および菌体濃度を測定した。その結果は表７に示される通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 

Claims (7)

  1. 　アルギニンをシトルリンに変換する代謝能を有する乳酸菌を、培地のｐＨの低下を抑制するために、アルギニンを添加してなる培地において培養することを特徴とする、乳酸菌の培養法。
  2. 　乳酸菌の培養液の１ｍＬあたりの菌体数が、アルギニンを含まない培地で培養したときに比べて２倍以上となる、請求項１に記載の乳酸菌の培養法。
  3. 乳酸菌がアルギニンをシトルリンに変換した後に、シトルリンをオルニチンに変換する代謝能を有する、請求項１または２に記載の乳酸菌の培養法。
  4. 　アルギニンを培地に０．５～１５質量％で添加する、請求項１～３のいずれか一項に記載の乳酸菌の培養法。
  5. 　乳酸菌がラクトコッカス・ラクティス、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ブフネリ、エンテロコッカス・フェーカリス、オエノコッカス・オエニ、ペディオコッカス・ペントサセウス、ラクトバチルス・アミロボラス、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・クリスパータス、ラクトバチルス・デルブレッキーからなる群から選択される１種または２種以上である、請求項１～４のいずれか一項に記載の乳酸菌の培養法。
  6. 　乳酸菌がラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・ブレビスからなる群から選択される１種または２種以上である、請求項５に記載の乳酸菌の培養法。
  7. 　培養液を攪拌しない、請求項１～６のいずれか一項に記載の乳酸菌の培養法。
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