TWI750788B - 短乳桿菌gkjoy、含其之組合物及改善憂鬱症與促進神經功能之用途 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種短乳桿菌GKJOY、含其之組合物及其用途，藉由提升腦組織中多巴胺及/或血清素的含量，又或提升神經功能相關基因的表現量，以改善憂鬱症與促進神經功能。

Description

短乳桿菌GKJOY、含其之組合物及改善憂鬱症與促進神經功能之用途

本發明關於一種用於改善憂鬱症與促進神經功能的乳酸菌、含其之組合物及其用途；更明確地說，係關於一種能產生高量γ-氨基丁酸(GABA)的短乳桿菌(Lactobacillus brevis)之組合物，並將該組合物施予一受施者，以用於提升腦組織中多巴胺及/或血清素之含量以改善憂鬱症與促進神經功能。

憂鬱症

現代人課業、工作壓力大，使得越來越多人有焦慮問題，出現失眠、自律神經失調等症狀，引發專注力下降的問題，嚴重可能產生憂鬱問題。

γ-氨基丁酸(GABA)

γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid，簡稱GABA)為大腦內重要的神經傳導物質，其主要功能為抑制神經的活動。當神經過度興奮而造成緊張、焦慮、憂鬱、失眠等症狀時，GABA會使過度興奮的神經細胞安定、幫助大腦放鬆，來讓身心狀態更寧靜、平和及舒緩，以適時調節神經活動。當人體進入深層睡眠時，腦內的GABA含量會升高，幫助人體提升睡眠品質，是達成優質睡眠重要的 神經傳導物質。GABA濃度僅需微量變化就會對人體的生理或是心理產生作用，如鴉片能透過抑制GABA，使GABA無法有效抑制多巴胺分泌，進而讓人產生快感。GABA亦能應用於治療精神疾病，如抑制憂鬱症病患所可能會有的強烈自殺意念。研究指出憂鬱症患者在前扣帶迴皮質區(Perigenual Anterior Cingulate Cortex，簡稱PACC)會異常活化。當憂鬱症患者PACC的麩胺酸(Glutamate)濃度越高，該患者會傾向將周遭事物與自我連結，使該患者在思考上容易鑽牛角尖，進而陷入負面情緒的輪迴。若使用藥物促進GABA作用，就能夠有效抑制PACC腦區中麩胺酸的濃度，藉此讓憂鬱症患者能暫時擺脫負面思考的輪迴，以避免走向自殺一途。

多巴胺

多巴胺(dopamine)是一種刺激腦部動機、驅動力的腦內分泌物，能用來幫助細胞傳送脈衝，屬於神經傳導物質的一種，主要負責大腦的情慾、感覺，將興奮及開心的信息傳遞，也與上癮有關。多巴胺傳遞開心、興奮情緒的這功能，醫學上被用來治療抑鬱症。

多巴胺若不足或失調，則會令人缺乏動力、喪失活力、注意力不集中，或是失去控制肌肉的能力。更嚴重時會導致手腳不自主地顫動、乃至演變為帕金森氏症。但多巴胺若分泌過量，則會過度消耗體力和熱量因而導致早死。

血清素

血清素(Serotonin)的完整名稱為血清張力素，又稱5-羥色胺和血清胺，簡稱為5-HT，是一種單胺型神經遞質。血清素主要存在於動物的胃腸道、血小板和中樞神經系統中，在大腦中的含量為總量的2%，有九成位於黏膜 腸嗜鉻細胞和肌間神經叢，參與腸蠕動的調節。血清素給予人精神上的安定及平靜，控制人的情緒、壓力及專注力，普遍認為是幸福和快樂感覺的貢獻者。當血清素低落時，工作者容易焦慮不安、效率下降。

造成血清素減少的原因很多，包括壓力、缺乏睡眠、營養不良和缺乏鍛鍊等。在血清素含量降低到必需量以下時，就會出現注意力集中困難等問題，而會間接影響個人計劃和組織能力，故經常伴隨壓力和厭倦感。若血清素含量再進一步下降，還會引起抑鬱。其他和大腦血清素水平降低有關的症狀還包括易怒、焦慮、疲勞、慢性疼痛和焦躁不安等。若症狀惡化，最終還可能引起強迫症、慢性疲勞綜合症、關節炎、纖維肌痛和輕躁狂抑鬱症等疾病。

短乳桿菌

短乳桿菌(Lactobacillus brevis)是乳桿菌屬(Lactobacillus)中的革蘭氏陽性菌種，常見於酸菜與泡菜等食物中，最初是發現於酸麵團中。菌株被認定為動物的益生菌，且有幾種菌株被用於治療女性的泌尿生殖系統感染。

乳酸桿菌的應用

近年有少數文獻表明腸道微生物可能具有影響人的大腦發育、行為和情緒能力。有研究發現腸道微生物可藉由腦-腸軸線來影響老鼠的情緒，並引起其類焦慮(anxiety-like)或類憂慮(depression-like)的症狀(Fosterand McVey Neufeld,2013)。也有研究顯示，以母子分離而引發類焦慮及類憂鬱行為的小鼠，若給予該小鼠植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)，就會減少小鼠在強迫游泳試驗中的不動時間，並提高對糖水的偏好。此結果顯示植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)有助於改善小鼠的類憂鬱行為，且提升小鼠前額葉皮質中多巴胺總量及降低血清素代謝率(Liu et al.,2016)。其他實驗也發現將大鼠束縛21天以誘 導憂鬱和焦慮行為後，給予瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)能改善大鼠的憂慮及焦慮問題(Liang et al.,2015)。然而，目前市場中仍有需求開發其他菌種以改善神經失調的相關疾病。

本發明提供一種短乳桿菌(Lactobacillus brevis)GKJOY，其生產γ-氨基丁酸(GABA)。

較佳地，該短乳桿菌GKJOY係將麩胺酸鈉轉換以生產GABA。

較佳地，該短乳桿菌GKJOY以寄存編號BCRC910920寄存於財團法人食品工業發展研究所。

本發明為有效改善憂鬱症及/或促進神經功能提供一種組合物，其包含一短乳桿菌(Lactobacillus brevis)GKJOY的活性物質，其中該短乳桿菌GKJOY以寄存編號BCRC910920寄存於財團法人食品工業發展研究所。

較佳地，該短乳桿菌GKJOY係以下列方法製備：(a)取一短乳桿菌GKJOY菌落接種於培養基進行固態培養，形成菌體；(b)將步驟(a)培養的菌體接種於液體培養基進行液態培養；及(c)將步驟(b)培養的含菌體的液態培養基進行發酵培養，得到發酵全液。

較佳地，該方法進一步包含下列步驟：(d)將步驟(c)培養的發酵全液離心以獲得菌泥或上清液；及 (e)將步驟(d)所得的該菌泥或上清液進行冷凍乾燥。

較佳地，該組合物包含一種以上選自下列群組的添加劑：賦型劑、防腐劑、稀釋劑、填充劑、吸收促進劑、甜味劑或其組合。

較佳地，該組合物為一藥品、飼料、飲料、營養補充品、乳製品、食品或保健食品。

較佳地，該組合物的形態為粉劑、錠劑、造粒、栓劑、微膠囊、安瓶、液劑噴劑或塞劑。

本發明經過實驗證實短乳桿菌GKJOY可用於改善憂鬱症及/或促進神經功能的用途。

較佳地，該改善憂鬱症係指相對於未施予該短乳桿菌GKJOY的活性物質之受施者，施予該短乳桿菌GKJOY的活性物質之受施者的腦組織中的多巴胺含量提升。

較佳地，該改善憂鬱症指係相對於未施予該短乳桿菌GKJOY的活性物質之受施者，施予該短乳桿菌GKJOY的活性物質之受施者的腦組織中的血清素含量提升。

較佳地，該促進神經功能指係相對於未施予該短乳桿菌GKJOY的活性物質之受施者，施予該短乳桿菌GKJOY的活性物質之受施者的神經細胞中的促進神經功能基因的表現量提升。

較佳地，該促進神經功能的基因包含NGF、BDNF、NeuroD1、NFH或其組合。

較佳地，該憂鬱症與促進神經功能的症狀包含失眠、自律神經失調、專注力下降、憂鬱症或其組合。

圖1顯示短乳桿菌GKJOY與其他品系菌株的GABA定性結果。

圖2顯示短乳桿菌GKJOY與其他品系菌株的GABA定量結果。

圖3顯示小鼠腦組織中的多巴胺含量。

圖4顯示小鼠腦組織中的血清素含量。

圖5顯示乳酸菌活性物質促進神經細胞功能的電泳圖。

菌種來源

本實驗中所使用的乳酸菌是乳桿菌屬的短乳桿菌(Lactobacillus brevis)。在一較佳的實施態樣中，此菌種採集自台灣原住民阿美族部落使用的釀製物。從天然發酵醃製30天以上的各種蔬果的泡菜產品中取樣，蒐集裝袋後標示，以冷藏箱低溫保存並於當天運送至實驗室進行菌株分離。

篩選培養

將檢體袋置於無菌操作台，以滅菌後的無菌吸管抽取濾液或蔬果葉片，再以檢體的十倍量無菌水進行鐵胃機均質處理。抽取1mL稀釋液放入含有0.1%溴甲酚綠(bromocresol green)的MRS培養基中進行37℃、16小時的增菌培養，以增加檢品中內含的乳酸桿菌數量，強化篩選樣品中數量較少的乳酸菌菌株被分離的機率。取增菌培養後的樣品，進行序列稀釋操作。稀釋至十萬倍及一百萬倍的序列稀釋操作後，分別取出0.1mL放到無菌培養皿中，在培養皿中分別放入Rogosa培養基瓊脂、BIM-25瓊脂、馬鈴薯澱粉+酵母萃取瓊脂、溴甲酚綠MRS瓊脂及溴甲酚紫瓊脂。經過37℃、40小時厭氧培養後，每種培養 基各挑選單一菌落15至20個菌株。將分離後的單一菌株培養於MRS培養液中以特定溫度培養16小時後添加50%菌種冷凍保存液(甘油)。

菌種鑑定

確認GKJOY為新穎菌株後，於2019年7月18日以「短乳桿菌Lactobacillus brevis GKJOY」的名稱，在寄存於食品工業發展研究所完成寄存並取得寄存編號BCRC 910920，且於2019年7月26日確認該菌株存活。

菌種培養

勾取上述短乳桿菌GKJOY的菌落(colony)接種於固態培養基上活化菌種。在一較佳的實施態樣中，該固態培養基為MRS瓊脂。待菌體生長完成後，將新鮮的菌體連同固態培養基接入於含有液態培養基的錐形瓶中進行液態培養。在一較佳的實施態樣中，於溫度25至40℃下、通氣量0至1vvm氮氣或二氧化碳、速率250至1000rpm的條件下液態培養。在一較佳的實施態樣中，液態培養的時間為16至24小時，更佳為18小時活菌數可達到最高點。在一較佳的實施態樣中，液態培養基為MRS液態培養基。在一較佳的實施態樣中，液態培養基的配方如下表1所示。液態培養完成後進行發酵培養。

凍乾粉的製備

將短乳桿菌GKJOY經發酵培養而完成生長後，收集包含菌體與培養液的發酵全液進行離心以獲得菌泥。在一較佳的實施態樣中，發酵全液投入15重量%脫脂乳粉靜置1至4小時始菌體凝集成團狀增加回收率，再以速率1000至15000rpm進行離心。離心後所得的菌泥與作為保護劑的6至50重量%脫脂奶粉混合後冷凍乾燥。最後，將冷凍乾燥後所得的凍乾粉置於低溫保存。在一較佳的實施態樣中，冷凍乾燥的預凍溫度設定為梯度設定，依序為0至-20℃儲放1至4小時，接著-15至-40℃儲放4至8小時，最終冷凍於-196至-40℃超過8小時。在一較佳的實施態樣中，冷凍乾燥溫度與時間為-5℃約2小時，接著-20℃約6小時，最後-50℃約16小時。在一較佳的實施態樣中，低溫保存的溫度為-30至0℃。保存的凍乾粉作為以下動物實驗中所要施予動物的餵食樣品的原料。本案所請的短乳桿菌GKJOY活性物質使用時的態樣，包括但不限於前述含有菌體與培養液的發酵全液、發酵全液離心而去除上清液後的菌泥、發酵全液離心而去除菌泥後的上清液、及發酵全液、菌泥、上清液所製備而成的凍乾粉。

GABA定性分析

以薄層層析法(Thin-layer chromatography，TLC)篩選表2中高量產GABA的乳酸菌菌株。

將上表中的乳酸菌以1%(V/V)接種至含有1.5%麩胺酸鈉(Sodium glutamate)(W/V)的MRS培養基中，於37℃下培養36小時。培養後將培養基離心以取得上清液，並利用薄層層析法進行分析。薄層層析法展開液所使用溶劑以5：3：2(v/v/v)的比例混合正丁醇-乙酸-水，TLC片展開後則利用2%茚三酮(ninhydrin)進行顯影判讀。

薄層層析法的結果顯示於圖1。比對乳酸菌與作為對照的標準品10mg/mL的GABA色帶的位置，若於相同的位置中有色帶，則推測出該乳酸菌菌株具有生產GABA的能力。圖1顯示GKJOY與GABA標準品在相同位置有色帶，另外其他七株菌株在與GABA標準品在相同位置上卻沒有顯示色帶。此結果說明其他七株菌株即便在培養基中含有麩胺酸鈉，但該等菌株將麩胺酸鈉轉換成GABA的能力仍不如GKJOY來的顯著。據此，表2中的八種短乳桿菌菌株中，僅有GKJOY具有高生產GABA的能力。

GABA定量分析

利用HPLC進一步定量菌株所生產的GABA。將上表2的乳酸菌以1%(V/V)接種至含有4%麩胺酸鈉(Sodium glutamate)(W/V)的MRS培養基中，於37℃下培養72小時。培養後將培養基離心以取得上清液，將該上清液 進行冷凍乾燥獲得凍乾粉。樣品溶液的製備是取凍乾粉0.1g，加入70%乙醇10ml，以超音波震盪60分鐘進行萃取，過濾後再以70%乙醇定容至10ml。由於GABA對於紫外光幾乎無法吸收，需要將GABA衍生化再接上苯氨基硫代甲醯胺(phenyl isocyanate，PTC)，才能讓GABA易於由HPLC來偵測。因此，樣品溶液製備完成後還要進行PTC-GABA衍生化反應操作。標準溶液的配製則是精確秤取GABA標準品12mg，添加70%乙醇以震盪來溶解，定容至100ml來配製成濃度120μg/ml的標準品儲備溶液，並冷凍保存於-20℃。

量取上述樣品溶液及標準溶液各10μL，分別注入高效液相層析儀中，相關進行液相層析之條件如下表3。

就樣品溶液與標準溶液所得波峰之滯留時間及吸收圖譜比較並鑑別，再依下列式1計算以求出樣品溶液中GABA之含量(mg/g)。樣品溶液與標準溶液中GABA之含量(mg/g)如下表4。

C：由標準曲線求得檢品中GABA之濃度(μg/mL)

V：萃取檢品之溶液體積(mL)

M：取樣分析檢品之重量(g)

表4轉換為長條圖顯示如圖2。圖中可見除GKJOY以外的其他短乳桿菌(Lactobacillus brevis)菌株的GABA約為1000ppm，而相對於標準品之近10000ppm僅有其十分之一的含量。此結果說明，在培養基中縱使含有麩胺酸鈉(Sodium glutamate)，除GKJOY以外的其他短乳桿菌(Lactobacillus brevis)菌株生產GABA的能力不佳。但在相同條件下，GKJOY能成功將麩胺酸鈉轉換成GABA，其生產量高達17330ppm，而為其他菌株的十倍以上。此結果說明，GKJOY具有高生產GABA的能力。

動物試驗

試驗動物

ICR雄鼠36隻，每隻體重約20至25公克，購自BioLASCO(樂斯科生物科技)。小鼠飼養在常規籠中，室溫維持於23±2℃，濕度50±5%，定時12小時光照與黑暗，飼料及無菌逆滲透水均任由小鼠自由取食。在研究之前使小鼠適應實驗室環境一周。所有動物實驗程序皆由弘光科技大學實驗動物照護及使用委員會進行審查並核准。試驗動物餵食正常成鼠飼料和飲用蒸餾水，並於適應環境1週後，隨機分為對照組與實驗組A至E共6組，每組6隻。

試驗流程

實驗組A至E的小鼠，依下表5將不同菌株的發酵全液離心並去除上清液後的菌泥所作成的凍乾粉作為乳酸菌的活性物質，回溶於食鹽水中，每天餵食一次，對照組則給予同體積的0.9%食鹽水，餵食期間為四週。餵食採小鼠管灌，不鏽鋼餵食針平時浸泡在75%酒精溶液中，使用前再以0.9%生理食鹽水清洗潤濕，以1ml無菌塑膠針筒套上不鏽鋼餵食針餵食。

表5

灌食劑量的計算依據實驗動物與人體表面積比的等效劑量換算係數，其中小鼠與人的換算係數為12.3。小鼠每周秤量體重一次，每組計算出平均體重後，小鼠體重以25公克計算。提供之樣品成人(以體重60公斤計算)每日服用劑量為1000mg(約為每人每日1000億個活菌數)，加以換算每天管灌小鼠之劑量，公式如下所示：小鼠每日餵食產品劑量(g)={成人劑量/60公斤(成人體重)}×小鼠體重(公斤)×12.3(小鼠與人的換算係數)

經上述公式計算出實驗組餵食劑量為5.125mg。

實驗的第15天開始，各組別小鼠每天接受禁錮誘導，共14天。將各組小鼠每天一次放置於通風良好的透明限制器中(100×40mm)禁錮，一次達2小時。4週實驗結束後，小鼠以二氧化碳(CO₂)麻醉後犧牲，將血液收集至EDTA管中，於4℃離心，保存於-80℃。快速去除小鼠總海馬體，以低溫食鹽水均質後，於4℃下離心10分鐘(13000×g)，收集上清液，保存於-80℃以待後續生化評估。

多巴胺含量測定

以商業分析ELISA套組(Novus Biologicals,Littleton,CO,USA)測定大腦中多巴胺(dopamine)含量。各組別小鼠腦組織中多巴胺濃度結果如圖3所示。受禁錮誘導的小鼠的腦組織中多巴胺濃度明顯較低，試驗期間若同時給予短乳桿菌GKJOY(組別E)，可顯著增加小鼠腦組織中的多巴胺濃度(p<0.05)。相比其他株乳酸菌，例如植物乳桿菌BCRC-910787、短乳桿菌BCRC-23271、嗜酸乳桿菌BCRC-14064、發酵乳桿菌BCRC-910824，短乳桿菌GKJOY提升多巴胺的效果皆更為顯著。

血清素含量測定

以商業分析ELISA套組(Novus Biologicals,Littleton,CO,USA)測定大腦中血清素(5-HT)含量。各組別小鼠腦組織中血清素濃度結果如圖4所示。受禁錮誘導的小鼠的腦組織中血清素濃度也明顯較低，試驗期間若同時給予短乳桿菌GKJOY(組別E)，小鼠腦組織中的血清素濃度明顯增加(p<0.05)。相比其他株乳酸菌，例如植物乳桿菌BCRC-910787、短乳桿菌BCRC-23271、嗜酸乳桿菌BCRC-14064、發酵乳桿菌BCRC-910824，短乳桿菌GKJOY提升血清素的效果皆更為顯著。

數據統計分析

實驗結果以Means±SD表示，並利用SPSS(12版)商用統計軟體進行分析；以one-way ANOVA比較各組Mean值的差異性，再以Duncan’s multiple comparison進行事後檢定，當p<0.05時，即表示具有統計上的顯著差異性。

承上述結果，受禁錮誘導的小鼠在施予短乳桿菌GKJOY後能顯著提升腦組織中的多巴胺及血清素濃度。此結果說明短乳桿菌GKJOY能有效降低壓力造成的相關憂鬱症，且有利於促進神經功能。

細胞試驗

細胞培養

人類神經母細胞SH-SY5Y分讓自衛生福利部中國醫藥研究所蕭永基研究員，細胞培養在添加10% FBS、100U/ml青霉素(penicillin)和100U/ml链霉素(streptomycin)的DMEM/F12培養基中，置於37℃、5% CO₂的恆溫培養箱中培養，細胞約2~3天繼代一次。

將表5中的各菌株發酵全液離心並去除菌泥的上清液所作成的凍乾粉作為乳酸菌的活性物質。人類神經母細胞SH-SY5Y種於6cm培養皿培養一天後，以該凍乾粉作為乳酸菌的活性物質加入培養皿中處理細胞，24小時後收集細胞，

RNA萃取

使用賽默飛世爾科技股份有限公司(Thermo Fisher Scientific Inc.)的GeneJET RNA純化套組來純化mRNA。將收集的細胞加入內含14.3M的β-巰基乙醇(β-Mercaptoethanol，簡稱β-ME或BME)的600μl細胞組織裂解緩衝液(lysis Buffer)中。再加入360ul的100%酒精藉由(vortex)混合完全獲得混合液。混合液通過核酸純化柱(spin column)，核酸純化柱以緩衝液清洗三次後，用無核酸酶水(Rnase free water)將RNA溶出。最後測量RNA濃度並保存於-20℃。

反轉錄(Reverse Transcription)反應

使用柏瑞股份有限公司(Bio-Rad Laboratories Inc.)的iScript^TM cDNA合成套組進行cDNA的合成。將各樣品取1ug的mRNA加入核糖核酸酶H(Ribonuclease H,RNase H)、多聚胸腺嘧啶(oligo dT)與隨機六聚體引子 (random hexamer primers)，經25℃作用5分鐘、46℃作用20分鐘、95℃作用1分鐘，即完成cDNA的合成。

PCR

取1ul各樣品的cDNA加到iTaq DNA聚合酶中，其中採用的引子對的序列如下表6且引子對的濃度為100nM。首先以95℃活化iTaq DNA聚合酶5分鐘，以95℃變性30秒鐘，共進行30個循環，最後以60℃接合並延長產物30秒，完成後得到增幅的DNA片段。

神經功能基因的表現量檢測

以瓊脂糖電泳(Agarose gel electrophoresis)檢測增幅DNA片段中神經功能相關的基因的表現量。促進神經功能的基因包含NGF、BDNF、NeuroD1、NFH，該等基因與神經功能的關聯如下表7所示。神經細胞中的mRNA經反轉錄及PCR增幅後的產物中，所偵測到該等基因的多寡，即反映該等基因於神經細胞的表現量。若該等基因表現量高，則顯示神經細胞的神經功能提升。

瓊脂糖電泳檢測結果顯示如圖5。電泳圖的橫軸分別是對照組(標示為CTL)、NGF組、A至E組的實驗組，其中A至E的實驗組配製0.05μg/ml與0.1μg/ml的兩種不同濃度進行檢測。A至E組的實驗組的菌株同表5，其中E組即菌株GKJOY。由結果來看，施予菌株GKJOY的E組之電泳圖中的條帶，與對照組相比顯著較寬。此結果顯示，相較於未施予菌株GKJOY乳酸菌活性物質的神經細胞，施予菌株GKJOY的神經細胞中的神經相關基因如NGF、BDNF、NeuroD1、NFH的表現量較高。此檢測結果說明施予菌株GKJOY發酵上清液作為活性物質，有助於維持神經元生長、促進神經元分化及調控神經功能。 A至D組其他乳酸菌的基因表現量雖然部分相較於對照組也有改善，但皆不如E組的菌株GKJOY。

本發明提供一組合物，包含有短乳桿菌GKJOY活性物質，該組合物具有改善憂鬱症與促進神經功能的功效。

視情況，該組合物可進一步包含添加劑。在一較佳的實施態樣中，該添加劑可為賦型劑、防腐劑、稀釋劑、填充劑、吸收促進劑、甜味劑、或其組合。該賦型劑可選自檸檬酸鈉、碳酸鈣、磷酸鈣、蔗糖或其組合。該防腐劑可延長組合物的儲藏期限，例如苯甲醇、對羥基苯甲酸(parabens)。該稀釋劑可選自水、乙醇、丙二醇、甘油或其組合。該填充劑可選自乳糖、牛乳糖、高分子量舉乙二醇或其組合。該吸收促進劑可選自二甲基亞碸(DMSO)、月桂氮卓酮、丙二醇、甘油、聚乙二醇或其組合。該甜味劑可選自安塞甜(Acesulfame K)、阿斯巴甜(aspartame)、糖精(saccharin)、三氯蔗糖/蔗糖素(sucralose)、紐甜(neotame)或其組合。除上述所列舉的添加劑以外，在不影響短乳桿菌GKJOY的效果前提下，可依需求選用適合的其他添加劑。

該組合物可依市場需求開發為不同商品。在一較佳實施態樣中，該組合物為一藥品、飼料、飲料、營養補充品、乳製品、食品或保健食品。

該組合物可根據受施予者之需要，而採用不同形態。在一較佳實施態樣中，該組合物的形態為粉劑、錠劑、造粒、栓劑、微膠囊、安瓶(ampoule/ampule)、液劑噴劑或塞劑。

本發明的組合物可使用於動物或是人類。在不影響短乳桿菌GKJOY發揮效果的前提下，包含乳酸菌的組合物可製為任何藥物型態，並根據藥物型態以適用的途徑施予該動物或人類。

組合物製備

例示本發明之GKJOY若應用於食品用途，則以下組合物1之態樣作為性實例。

組合物1：取GKJOY的凍乾粉(20wt%)，與作為防腐劑之苯甲醇(8wt%)、作為稀釋劑之甘油(7wt%)充分混合，並溶於純水(65wt%)中，存放於4℃備用。前述wt%係指各成分佔組合物總重之比例。

本發明之GKJOY若以液體劑型應用於醫藥用途，則以下組合物2之態樣作為例示性實例。

組合物2：取GKJOY的凍乾粉(20wt%)，與作為防腐劑之苯甲醇(8wt%)、作為稀釋劑之甘油(7wt%)、作為稀釋劑之蔗糖(10wt%)充分混合，並溶於純水(55wt%)中，存放於4℃備用。前述wt%係指各成分佔組合物總重之比例。

【生物材料寄存】

短乳桿菌GKJOY：BCRC910920

<110> 葡萄王生技股份有限公司

<120> 短乳桿菌GKJOY、含其之組合物及改善憂鬱症與促進神經功能之用途

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<170> PatentIn version 3.5

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Claims (12)

1. 一種短乳桿菌(Lactobacillus brevis)GKJOY菌株(寄存編號為BCRC 910920)，其生產γ-氨基丁酸(GABA)。
2. 如請求項1所述之短乳桿菌，其係將麩胺酸鈉轉換以生產GABA。
3. 一種改善憂鬱症及/或促進神經功能的組合物，其包含一短乳桿菌(Lactobacillus brevis)GKJOY的活性物質，其中該短乳桿菌GKJOY以寄存編號BCRC910920寄存於財團法人食品工業發展研究所；其中該短乳桿菌GKJOY的活性物質以下列方法製備：(a)取一短乳桿菌GKJOY菌落接種於培養基進行固態培養，形成菌體；(b)將步驟(a)培養的菌體接種於液體培養基進行液態培養；(c)將步驟(b)培養的含菌體的液態培養基進行發酵培養，得到發酵全液；(d)將步驟(c)培養的發酵全液離心以獲得菌泥或上清液；及(e)將步驟(d)所得的該菌泥或該上清液進行冷凍乾燥。
4. 如請求項3所述之組合物，其進一步包含一種以上選自下列群組的添加劑：賦型劑、防腐劑、稀釋劑、填充劑、吸收促進劑、甜味劑或其組合。
5. 如請求項3所述之組合物，其為一藥品、飼料、飲料、營養補充品、乳製品或保健食品。
6. 如請求項3所述之組合物，其形態為粉劑、錠劑、造粒、栓劑、微膠囊、安瓶、液劑噴劑或塞劑。
7. 一種如請求項3至6中任一項之組合物用於製備改善憂鬱症及/或促進神經功能之藥物的用途。
8. 如請求項7所述之用途，其中該改善憂鬱症係指相對於未施予該短乳桿菌GKJOY的活性物質之受施者，施予該短乳桿菌GKJOY的活性物質之受施者的腦組織中的多巴胺含量提升。
9. 如請求項7所述之用途，其中該改善憂鬱症係指相對於未施予該短乳桿菌GKJOY的活性物質之受施者，施予該短乳桿菌GKJOY的活性物質之受施者的腦組織中的血清素含量提升。
10. 如請求項7所述之用途，其中該促進神經功能係指相對於未施予該短乳桿菌GKJOY的活性物質之受施者，施予該短乳桿菌GKJOY的活性物質之受施者的神經細胞中的促進神經功能基因的表現量提升。
11. 如請求項10所述之用途，其中該促進神經功能的基因包含NGF、BDNF、NeuroD1、NFH或其組合。
12. 如請求項7至11中任一項所述之用途，其中該憂鬱症及/或促進神經功能的症狀包含失眠、自律神經失調、專注力下降、憂鬱症或其組合。

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