CN108220193B - 一株乳双歧杆菌、一种乳双歧杆菌冻干粉及其制备方法 - Google Patents

一株乳双歧杆菌、一种乳双歧杆菌冻干粉及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本申请提供乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis BL9)，保藏号：CGMCC No.14536。本申请还提供一种制备所述乳双歧杆菌冻干粉的方法，所述方法在厌氧环境下进行包埋冻干处理，并且在冻干处理前分步骤使用多种抗氧剂对所述乳双歧杆菌进行包埋处理，有效防止氧气与所述乳双歧杆菌细胞膜系统的相互作用，从而阻止损害DNA合成的行为，并且能够清除在菌株冻干前产生的自由基，从而预防干燥过程中的氧化损伤，并使所述乳双歧杆菌在常温贮藏条件下不易失活。本申请还提供一种用所述方法制备的乳双歧杆菌冻干粉。

Description

一株乳双歧杆菌、一种乳双歧杆菌冻干粉及其制备方法
技术领域
本申请涉及生物技术领域，具体涉及一株乳双歧杆菌菌株，使用该乳双歧杆菌制备的乳双歧杆菌冻干粉及其制备方法。
背景技术
乳双歧杆菌是定植于人体肠道内的有益菌，是健康人群肠道内的优势菌群。人体肠道菌群中乳双歧杆菌的结构组成与宿主的年龄、性别相关，还和宿主的饮食结构、生活方式等相关。母乳喂养的婴儿肠道内厌氧菌乳双歧杆菌占肠道菌群总菌数的92％以上。普遍认为，乳双歧杆菌是严格的厌氧菌，具有调节肠道菌群，防治肠道相关疾病、降低胆固醇、增强机体免疫力、抗肿瘤、抗辐射和延缓衰老等生理功能。对于大多数的而言，其细胞内没有过氧化氢酶和超氧化物歧化酶，故有氧存在时，乳双歧杆菌细胞不能降解其代谢产生所累积的过氧化氢，进而抑制其糖代谢，引起氧中毒。
乳双歧杆菌不耐氧的特性导致在当前的工业生产中显现出一些问题，诸如菌种较易失活，生物活性有所降低等，故需对乳双歧杆菌进行耐氧处理。
目前对乳双歧杆菌的耐氧处理停留在冻干处理上，而冻干粉中活菌数量受冻干过程中多种因素的影响，导致通常冻干方法制备的乳双歧杆菌冻干粉中活菌数量不高，且在常温贮藏条件下活菌存活率低。
发明内容
本申请的目的之一是提供一株乳双歧杆菌，本申请的目的之二是提供一种将所述乳双歧杆菌制备成冻干粉的方法，以解决现有冻干方法成本高，而且冻干粉中活菌数量低及常温贮藏存活率低的问题。
为达到上述目的，本申请通过以下技术方案来实现：
乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis BL9)通过以下方法筛选得到：
所述乳双歧杆菌BL9(Bifidobacterium lactis BL9)是从健康儿童肠道中分离得到的耐酸和耐胆汁酸的益生菌；该菌菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号：CGMCC No.14536；分类命名为：乳双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)；保藏时间：2017年8月18日；保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本申请所分离的乳双歧杆菌BL9(Bifidobacterium lactis BL9)具有如下生物学特性：革兰氏阳性菌，无鞭毛、不运动，不形成芽孢，厌氧；菌体形状各异，典型的呈V形、Y形、棒球状，其菌落光滑且边缘完整，呈乳白色。最适生长温度为36℃～38℃；最适pH值为6.0～7.0。
本申请提供一种制备所述乳双歧杆菌BL9(Bifidobacterium lactis BL9)冻干粉的方法，包括：
步骤1-1，在厌氧环境中，向乳双歧杆菌BL9菌泥中加入半胱氨酸盐酸盐溶液和氯化钙溶液，混合；
步骤1-2，在厌氧环境中，向步骤1-1制得的体系中加入谷氨酰胺转氨酶溶液，混合；
步骤1-3，在厌氧环境中，向步骤1-2制得的体系中加入脱脂乳粉溶液，混合，降温；
步骤1-4，在厌氧环境中，向步骤1-3制得的体系中加入壳聚糖溶液，乳化；
步骤1-5，在厌氧环境中，向步骤1-4制得的体系中加入明胶溶液，乳化；
步骤1-6，在厌氧环境中，向步骤1-5制得的体系中加入海藻糖溶液和谷胱甘肽溶液；
步骤1-7，在厌氧环境中，向步骤1-6制得的体系中加入海藻酸钠溶液；
步骤1-8，将步骤1-7制得的体系通过液氮速冻，后经真空干燥制备成冻干菌粉。
本申请提供的方法是在厌氧环境下进行包埋冻干处理，并且在冻干处理前分步骤使用多种抗氧剂对所述乳双歧杆菌进行包埋处理，有效防止氧气与所述乳双歧杆菌细胞膜系统的相互作用，从而阻止损害DNA合成的行为，并且能够清除在菌株冻干前产生的自由基，从而预防干燥过程中的氧化损伤，并使所述乳双歧杆菌在常温贮藏条件下不易失活。
本申请提供的方法不仅限于对所述乳双歧杆菌BL9进行冻干，还适用于对其它厌氧菌的冻干处理，以获得相同或者相似的效果。
本申请还提供一种用所述方法制备的乳双歧杆菌BL9(Bifidobacterium lactisBL9)冻干粉，所述乳双歧杆菌冻干粉活菌数大于4000亿CFU/g，经25℃贮藏6个月活菌存活率为52％以上。
本申请获得的乳双歧杆菌冻干粉在食品、饲料及医药保健产品中常温贮藏过程中不易失活，货架期内能够有效保证活菌数，从而保证食品、饲料及医药保健产品等产品的功效。
本申请还提供一种用于制备所述乳双歧杆菌冻干粉的组合物，所述组合物包括：
Figure BDA0001541781140000021
其中，基于1kg计为1重量份。
可选地，所述用于制备所述乳双歧杆菌冻干粉的组合物还可以为用上述组分配制而成的溶液组合物，例如：
Figure BDA0001541781140000022
其中，基于1kg计为1重量份，各溶液的重量以其中溶质的重量计。
本申请提供的用于制备所述乳双歧杆菌冻干粉的组合物还可以用于制备其它厌氧菌冻干粉。
附图说明
图1为实施例1中各步骤制得乳双歧杆菌冻干粉的贮藏稳定性结果图。
具体实施方式
下面通过对本发明进行详细说明，本发明的特点和优点将随着这些说明而变得更为清楚、明确。
以下详述本发明。
本申请提供一株乳双歧杆菌BL9(Bifidobacterium lactis BL9)，所述乳双歧杆菌BL9(Bifidobacterium lactis BL9)是从健康儿童肠道中分离得到的耐酸和耐胆汁酸的益生菌；该菌菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号：CGMCC No.14536；分类命名为：乳双歧杆菌Bifidobacterium lactis；保藏时间：2017年8月18日；保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本申请提供一种制备所述乳双歧杆菌BL9(Bifidobacterium lactis BL9)冻干粉的方法，包括：
步骤1-1，在厌氧环境中，向乳双歧杆菌BL9菌泥中加入半胱氨酸盐酸盐溶液和氯化钙溶液，混合。
在本申请中，所述厌氧环境可以为N2环境，也可以为其它可实现的无氧环境。
在步骤1-1中，所述半胱氨酸盐酸盐溶液的浓度为40wt％～60wt％，如50wt％。
所述半胱氨酸盐酸盐溶液与所述乳双歧杆菌BL9菌泥的重量比为半胱氨酸盐酸盐溶液的重量:所述乳双歧杆菌BL9菌泥的重量＝(0.3～0.8):10，如0.5:10，其中，所述半胱氨酸盐酸盐溶液的重量以其中半胱氨酸盐酸盐的重量计。
本发明人发现，40wt％～60wt％的半胱氨酸盐酸盐能够使乳双歧杆菌BL9菌体均匀分散，并包覆于其中，形成抗氧化内核，且半胱氨酸盐酸盐溶液与乳双歧杆菌BL9菌泥重量比为0.5:10时，能够在不增加菌体渗透压的情况下迅速脱除菌体上的氧自由基，降低菌体的氧化损伤。
所述氯化钙溶液的浓度为40wt％～60wt％，如50wt％。所述氯化钙溶液与所述乳双歧杆菌BL9菌泥的重量比为氯化钙溶液的重量:所述乳双歧杆菌BL9菌泥的重量＝(0.3～0.8):10，如0.3:10，其中，所述氯化钙溶液的重量以其中氯化钙的重量计。
本发明人发现，40wt％～60wt％的氯化钙能够在不增加菌体细胞渗透压的情况下，迅速促进后续步骤中谷氨酰胺转氨酶对脱脂乳中蛋白质的交联作用，凝乳完全，质地紧密，无清液析出，凝胶硬度提升至450g，较空白处理组提升1.5倍，有效包覆乳双歧杆菌BL9菌体。
同时向所述乳双歧杆菌BL9菌泥中加入半胱氨酸盐酸盐和氯化钙，能够使半胱氨酸盐酸盐和氯化钙与乳双歧杆菌BL9菌泥形成均一的分散体，形成保护菌体细胞的内核，减少氧气对细胞膜直接损伤；同时能够促进步骤1-2、1-3中谷氨酰胺转氨酶对蛋白质的分子交联作用，形成对菌体的包被。在步骤1-1中，保持体系的温度为30℃～40℃，优选为37℃。本发明人发现，该温度为乳双歧杆菌BL9的最佳生长温度，同时有利于步骤1-2中谷氨酰胺酶活性的维持。
在步骤1-1中，所述混合可以为任意一种将两种液态物质混合均匀的方法，如使用乳化机乳化、均质机乳化等，优选为使用乳化机乳化15min。
在本申请步骤1-1中，所述乳双歧杆菌BL9菌泥中活菌数为2000-3000亿CFU/g。在一种可实现的方式中，所述乳双歧杆菌BL9菌泥可以根据以下方法制备：
步骤2-1，将冷冻保存的乳双歧杆菌BL9(Bifidobacterium lactis BL9)于TPY液体培养基中37℃厌氧培养24小时，如此传代培养2次得到3级种子液。
步骤2-2，将步骤2-1制得的3级种子液接种至121℃灭菌20min后的发酵培养基中，37℃恒温厌氧条件发酵，自动控制流加氨水控制发酵过程体系pH5.9-6.5，至产酸停止，停止流加中和剂氨水，得到乳双歧杆菌高密度培养液，所述乳双歧杆菌高密度培养液中乳双歧杆菌BL9活菌数为150亿CFU/mL。其中，所述发酵培养基包括：乳糖60kg，酵母蛋白胨10kg，大豆蛋白胨10kg，酪蛋白胨5kg，乙酸钠5.0kg，磷酸氢二钾2.0kg，柠檬酸钠2.0kg，MgSO4.7H2O0.2kg，MnSO4.5H2O 0.05kg，吐温-80 0.5kg，蒸馏水1000L；发酵培养基初始pH值为7.0，并在121℃下灭菌20min。
步骤2-3，将乳双歧杆菌高密度培养液经14000xg离心提取湿菌体，制得菌泥中活菌数为2000-3000亿CFU/g，该操作过程料液温度控制为37℃。
在制备乳双歧杆菌BL9菌泥的过程中，持续向发酵罐中通入氮气以保护菌株免于被氧化。
步骤1-2，在厌氧环境中，向步骤1-1制得的体系中加入谷氨酰胺转氨酶溶液，混合。
在步骤1-2中，所述谷氨酰胺转氨酶溶液的浓度为5wt％～15wt％，如10wt％。所述谷氨酰胺转氨酶溶液与所述乳双歧杆菌BL9菌泥的重量比为谷氨酰胺转氨酶溶液的重量:所述乳双歧杆菌BL9菌泥的重量＝(0.3～0.8):10，如0.5:10，其中，所述谷氨酰胺转氨酶溶液的重量以其中谷氨酰胺转氨酶的重量计。
本发明人发现，5wt％～15wt％的谷氨酰胺转氨酶能够有效且充分的促进后续步骤中脱脂乳中蛋白质分子之间及其分子内部的共价交联作用，在乳双歧杆菌BL9菌体细胞外层包覆一层致密的蛋白质外膜，减少氧气损伤，谷氨酰胺转氨酶在该浓度范围时，蛋白凝胶胶体强度达到最大值，随着谷氨酰胺转氨酶添加量的增加，蛋白凝胶胶体的强度减低。
在步骤1-2中，保持体系的温度为30℃～40℃，优选为37℃。本发明人发现，该温度为乳双歧杆菌BL9的最佳生长温度，同时有利于谷氨酰胺酶活性的维持。
在步骤1-2中，所述混合可以为任意一种将两种液态物质混合均匀的方法，如使用乳化机乳化、超声乳化、机械搅拌等，优选为使用机械搅拌。
步骤1-3，在厌氧环境中，向步骤1-2制得的体系中加入脱脂乳粉溶液，混合，降温。
在步骤1-3中，所述脱脂乳粉溶液的浓度为10wt％～20wt％，如15wt％。所述脱脂乳粉溶液与所述乳双歧杆菌BL9菌泥的重量比为脱脂乳粉溶液的重量:所述乳双歧杆菌BL9菌泥的重量＝(8～12):10，如10:10，其中，所述脱脂乳粉溶液的重量以其中脱脂乳粉的重量计。
本发明人发现，10wt％～20wt％的脱脂乳粉溶液所含有的乳蛋白与上一步骤中的谷氨酰胺转氨酶发生交联反应，能够形成致密的凝胶，将菌体细胞包覆、镶嵌于蛋白凝胶中，形成保护，所述蛋白凝胶硬度达450g，如果仅使用谷氨酰胺转氨酶能够促进脱脂乳粉乳蛋白发生交联反应而不采用步骤1-1处理，则凝胶硬度为300g，较不添加谷氨酰胺转氨酶的空白处理组，凝胶硬度提高10倍。
在步骤1-3中，保持体系的温度为30℃～40℃，优选为37℃。本发明人发现，该温度为乳双歧杆菌BL9的最佳生长温度，同时有利于步骤1-3中谷氨酰胺酶活性反应的进行。
该重量比例的谷氨酰胺转氨酶和脱脂乳粉能够形成致密的凝胶网络结构。此外步骤1-1中加入的氯化钙能够加强蛋白凝胶的强度和硬度，从而有效将乳双歧杆菌BL9菌体包覆其中，完成乳双歧杆菌BL9菌体的预包埋处理。
在步骤1-3中，所述混合可以为任意一种将两种液态物质混合均匀的方法，如使用乳化机乳化、超声乳化、机械搅拌等，优选为使用机械搅拌。
在步骤1-3中，搅拌后的体系降温至2℃～6℃，如4℃。本发明人发现，该温度能够降低谷氨酰胺酶活性，有效终止谷氨酰胺酶反应的进行，结束乳双歧杆菌BL9菌体预包埋进程。
步骤1-4，在厌氧环境中，向步骤1-3制得的体系中加入壳聚糖溶液，乳化。
在步骤1-4中，所述壳聚糖溶液的浓度为3wt％～8wt％，如5wt％。所述壳聚糖溶液与所述乳双歧杆菌BL9菌泥的重量比为壳聚糖溶液的重量:所述乳双歧杆菌BL9菌泥的重量＝(0.1～0.3):10，如0.2:10，其中，所述壳聚糖溶液的重量以其中壳聚糖的重量计。
本发明人发现，浓度为3wt％～8wt％的壳聚糖溶液能够与前述步骤中未能被包被而裸露在外的乳双歧杆菌BL9菌体发生凝聚反应，在乳双歧杆菌BL9菌体表面形成新的包被层。本发明人还发现，随着壳聚糖添加量的逐渐增大，制得的乳双歧杆菌BL9冻干粉中水分含量升高，不易于菌株休眠和活性的保持，而用3wt％～8wt％的壳聚糖溶液制备的乳双歧杆菌BL9冻干粉水分含量低于5％，有利于菌株休眠和活性的保持。
在步骤1-4中，保持体系的温度为2℃～6℃，如4℃。本发明人发现，该温度能够降低乳双歧杆菌BL9代谢，进入休眠状态，保持活性。因此，本申请提供的方法，从步骤1-4开始，体系的温度均保持在2℃～6℃。
在步骤1-4中，所述混合可以为任意一种将两种液态物质混合均匀的方法，如使用乳化机乳化、超声乳化、机械搅拌等，优选为使用乳化机乳化15min。
步骤1-5，在厌氧环境中，向步骤1-4制得的体系中加入明胶溶液，乳化。
在步骤1-5中，所述明胶溶液的浓度为3wt％～8wt％，如5wt％，优选所述明胶溶液经121℃灭菌15min。所述明胶溶液与所述乳双歧杆菌BL9菌泥的重量比为明胶溶液的重量:所述乳双歧杆菌BL9菌泥的重量＝(0.1～0.3):10，如0.2:10，其中，所述明胶溶液的重量以其中明胶的重量计。
本发明人发现，浓度为3wt％～8wt％的明胶溶液能够与步骤1-4中的壳聚糖等量地发生作用，形成凝胶，形成对乳双歧杆菌BL9菌体的低温包埋处理。
在步骤1-5中，保持体系的温度为2℃～6℃，如4℃。本发明人发现，该温度能够降低乳双歧杆菌BL9代谢，进入休眠状态，保持活性。
在步骤1-5中，所述混合可以为任意一种将两种液态物质混合均匀的方法，如使用乳化机乳化、超声乳化、机械搅拌等，优选为使用乳化机乳化15min。
步骤1-6，在厌氧环境中，向步骤1-5制得的体系中加入海藻糖溶液和谷胱甘肽溶液。
在步骤1-6中，所述海藻糖溶液的浓度为40wt％～60wt％，如50wt％，优选所述海藻糖溶液经121℃灭菌15min。所述海藻糖溶液与所述乳双歧杆菌BL9菌泥的重量比为海藻糖溶液的重量:所述乳双歧杆菌BL9菌泥的重量＝(0.1～0.3):10，如0.2:10，其中，所述海藻糖溶液的重量以其中海藻糖的重量计。
本发明人发现，浓度为40wt％～60wt％的海藻糖溶液能够有效保护乳双歧杆菌BL9在真空冷冻干燥过程中的细胞活性，降低低温结冰对菌体细胞膜的物理损伤。经该处理后乳双歧杆菌BL9冻干存活率提升至85％，较空白处理组提高30％，显著提高了菌株活性。
在步骤1-6中，所述谷胱甘肽溶液的浓度为3wt％～8wt％，如5wt％，优选所述谷胱甘肽溶液经121℃灭菌15min。所述谷胱甘肽溶液与所述乳双歧杆菌BL9菌泥的重量比为谷胱甘肽溶液的重量:所述乳双歧杆菌BL9菌泥的重量＝(0.1～0.3):10，如0.2:10，其中，所述谷胱甘肽溶液的重量以其中谷胱甘肽的重量计。
本发明人发现，该重量比例的谷胱甘肽能够有效提高乳双歧杆菌BL9在真空冷冻干燥及冻干菌粉后期贮藏过程中细胞抗氧化损伤能力，降低细胞膜氧化损伤，较空白处理的冻干菌粉25℃贮藏6个月活菌存活率提高6％，显著增强了冻干菌粉的贮藏稳定性。
海藻糖降低冷冻形成的冰晶对细胞膜的物理损伤，避免细胞质外漏；谷胱甘肽能够保护细胞膜脂肪酸免受氧自由基损伤，二者协同保持细胞膜结构的完整性和功能性，共同保护菌体细胞对冷冻和氧气等不良环境的抵抗，保持菌株活性。在步骤1-6中，保持体系的温度为2℃～6℃，如4℃。本发明人发现，该温度能够降低乳双歧杆菌BL9代谢，进入休眠状态，保持活性。
步骤1-7，在厌氧环境中，向步骤1-6制得的体系中加入海藻酸钠溶液。
在步骤1-7中，所述海藻酸钠溶液的浓度为8wt％～12wt％，如10wt％，优选所述海藻酸钠溶液经121℃灭菌15min。所述海藻酸钠溶液与所述乳双歧杆菌BL9菌泥的重量比为海藻酸钠溶液的重量:所述乳双歧杆菌BL9菌泥的重量＝(0.1～0.3):10，如0.2:10，其中，所述海藻酸钠溶液的重量以其中海藻酸钠的重量计。
本发明人发现，该重量比例的海藻酸钠能够与步骤1-1、1-4、1-5中未作用完全的的氯化钙、壳聚糖和明胶形成凝胶网络结构，同时在所述乳双歧杆菌BL9菌体外层形成抗氧化剂(谷胱甘肽)保护层，完成对乳双歧杆菌BL9菌体的隔氧包埋处理，较空白处理的冻干菌粉25℃贮藏6个月活菌存活率提高10％。
在步骤1-7中，保持体系的温度为2℃～6℃，如4℃。本发明人发现，该温度能够降低乳双歧杆菌BL9代谢，进入休眠状态，保持活性。
在步骤1-7中，所述混合可以为任意一种将两种液态物质混合均匀的方法，如使用乳化机乳化、均质机乳化、机械搅拌等，优选为使用乳化机乳化15min。
步骤1-8，将步骤1-7制得的体系通过液氮速冻，后经真空干燥制备成冻干菌粉。
在本步骤1-8中，将步骤1-7制得的体系通过液氮速冻至-50℃，后在真空度为≤30pa的环境下按照程序升温进行干燥，程序升温的温度梯度可以为-50℃—-15℃—-5℃—5℃—15℃—30℃，35h后制备成冻干菌粉。
本发明人发现，向乳双歧杆菌BL9湿菌泥与抗氧剂中各组分的混合顺序以及混合比例，对乳双歧杆菌BL9冻干粉的贮藏稳定性影响存在巨大影响，具体请参见实施例1。
本申请还提供一种用所述方法制备的乳双歧杆菌BL9(Bifidobacterium lactisBL9)冻干粉，所述乳双歧杆菌冻干粉活菌数大于4000亿CFU/g，经25℃贮藏6个月活菌存活率为52％以上。
本申请获得的乳双歧杆菌冻干粉在食品、饲料及医药保健产品中常温贮藏过程中不易失活，货架期内能够有效保证活菌数，从而保证食品、饲料及医药保健产品等产品的功效。
本申请还提供一种用于制备所述乳双歧杆菌冻干粉的组合物，所述组合物包括：
Figure BDA0001541781140000061
Figure BDA0001541781140000071
例如，
Figure BDA0001541781140000072
其中，基于1kg计为1重量份。
可选地，所述用于制备所述乳双歧杆菌冻干粉的组合物还可以为用上述组分配制而成的溶液组合物，例如：
Figure BDA0001541781140000073
例如，
Figure BDA0001541781140000074
其中，基于1kg计为1重量份，各溶液的重量以其中溶质的重量计。
实施例
本实施例中所述药品的商购信息如下：
TPY液体培养基：广东环凯微生物科技有限公司，250g/瓶。
(一)乳双歧杆菌培养液的制备
1.菌种活化：将冷冻保存的乳双歧杆菌BL9(Bifidobacterium lactis BL9)于TPY液体培养基中37℃厌氧培养24小时，如此传代培养2次得到3级种子液。
2.接种发酵：将步骤1制得的3级种子液接种至121℃灭菌20min后的发酵培养基中，37℃恒温厌氧条件发酵，自动控制流加氨水控制发酵过程体系pH＝5.9，至产酸停止，停止流加中和剂氨水，得到乳双歧杆菌高密度培养液，所述乳双歧杆菌高密度培养液中乳双歧杆菌BL9活菌数为150亿CFU/mL。其中，所述发酵培养基包括：乳糖60kg，酵母蛋白胨10kg，大豆蛋白胨10kg，酪蛋白胨5kg，乙酸钠5.0kg，磷酸氢二钾2.0kg，柠檬酸钠2.0kg，MgSO4.7H2O0.2kg，MnSO4.5H2O 0.05kg，吐温-80 0.5kg，蒸馏水1000L；发酵培养基初始pH值为7.0，并在121℃下灭菌20min。
3.将乳双歧杆菌高密度培养液经14000xg离心提取湿菌体，制得菌泥中活菌数为2500亿CFU/g，该操作过程料液温度控制为37℃，且发酵罐中持续通入氮气全程保护菌株免于被氧化。
实施例1
1.包埋保护剂的预制
①将0.01kg谷氨酰胺转氨酶配制成10％的酶溶液，酶溶液经0.22μm无菌滤膜过滤除菌后，冷藏备用；
②将0.05kg氯化钙配制成50％溶液经121℃灭菌15min备用；
③将0.05kg半胱氨酸盐酸盐配制成50％溶液经121℃灭菌15min备用；
④将1kg脱脂乳粉配制成15％溶液经121℃灭菌7min备用；
⑤将0.02kg壳聚糖置成5％的溶液经121℃灭菌15min备用；
⑥将0.02kg明胶配制成5％的溶液经121℃灭菌15min备用；
⑦将1kg海藻糖配制成50％的溶液经121℃灭菌15min备用；
⑧将0.02kg海藻酸钠配制成5％的溶液经121℃灭菌15min备用；
⑨将0.04kg谷胱甘肽配制成10％的溶液，经0.22μm无菌滤膜过滤除菌后，避光冷藏备用。
2.冻干方法：
(1)菌体预包埋：
步骤1-1，在厌氧环境中，将③制得的半胱氨酸盐酸盐溶液和②制得的氯化钙溶液加入到1kg(一)中制得的菌泥中，经乳化机分散乳化15min形成混合液；
步骤1-2，在厌氧环境中，将①制得的谷氨酰胺转氨酶溶液加入混合液中，搅拌混合均匀；
步骤1-3，在厌氧环境中，向步骤1-2制得的混合液加入④制得的脱脂乳粉溶液，于37℃微搅拌作用30min后降温至4℃。
(2)菌体低温包埋：
步骤1-4，将⑤制得的壳聚糖溶液加入到步骤1-3制得的体系中，经乳化机分散乳化15min形成混合液；
步骤1-5，将⑥制得的明胶溶液加入步骤1-4制得的混合液中，经乳化机分散乳化15min形成混合液，以上混合乳化过程在4℃厌氧环境中进行。
(3)低温隔氧包埋
步骤1-6，将⑦制得的海藻糖溶液和⑨制得的谷胱甘肽溶液加入到步骤1-5制得的体系中，分散形成混合液；
步骤1-7，将⑧制得的海藻酸钠溶液加入步骤1-6制得的混合液中，经乳化机分散乳化15min形成混合液，以上混合乳化过程在4℃厌氧环境中进行。
(4)低温真空冷冻干燥
步骤1-8，将步骤1-7制得的乳双歧杆菌BL9混合菌液通过液氮速冻至-50℃，后经真空干燥(真空度≤30pa，)35h后制备成冻干菌粉。
分别对上述步骤(1)～(4)制得的体系进行冻干处理，并测定其中的活菌数以及在25℃贮藏6个月后的活菌存活率，具体效果见图1。
具体地，如图1曲线a所示，未经过包被处理的乳双歧杆菌冻干粉中活菌数3015亿CFU/g，经25℃贮藏6个月后活菌存活率为0.004％；
如图1曲线b所示，仅经过(1)菌体预包埋处理的乳双歧杆菌冻干粉中活菌数3058亿CFU/g，经25℃贮藏6个月后活菌存活率为22.401％；
如图1曲线c所示，经过(2)菌体低温包埋处理的乳双歧杆菌冻干粉中活菌数3517亿CFU/g，经25℃贮藏6个月后活菌存活率为29.793％；
如图1曲线d所示，经过(3)低温隔氧包埋处理的乳双歧杆菌冻干粉中活菌数3800亿CFU/g，经25℃贮藏6个月后活菌存活率为41.158％；
如图1曲线e所示，经过第(4)步低温真空冷冻干燥处理的乳双歧杆菌BL9冻干粉中活菌数大于4000亿CFU/g，经25℃贮藏6个月后活菌存活率为52.361％。
由上述结果可知，在乳双歧杆菌BL9真空冷冻干燥过程中，采用预包埋处理、低温包埋处理、低温隔氧包埋处理，能够有效减少菌体对外界不良环境的胁迫作用，减少细胞损伤，提高乳双歧杆菌冻干菌粉贮藏稳定性，采用该微囊包被工艺制备的乳双歧杆菌BL9(Bifidobacterium lactis BL9)冻干菌粉，避免了乳酸菌冻干粉剂在常温贮藏过程中易失活，货架期内无法有效保证活菌数，影响其功效的弊端，可以广泛应用于食品、饲料及医药产品中，稳定产品品质和发挥其健康功效。
以上结合具体实施方式和范例性实例对本申请进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本申请的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本申请精神和范围的情况下，可以对本申请技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本申请的范围内。本申请的保护范围以所附权利要求为准。
序列表
<110> 金华银河生物科技有限公司
<120> 一株乳双歧杆菌、一种乳双歧杆菌冻干粉及其制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1446
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
agaggtctcc ccttagacgg ctccccccac aagggtcggg ccaccggctt cgggtgctac 60
ccactttcat gacttgacgg gcggtgtgta caaggcccgg gaacgcattc accgcggcgt 120
tgctgatccg cgattactag cgactccgcc ttcacgcagt cgagttgcag actgcgatcc 180
gaactgagac cggttttcag cgatccgccc cacgtcaccg tgtcgcaccg cgttgtaccg 240
gccattgtag catgcgtgaa gccctggacg taaggggcat gatgatctga cgtcatcccc 300
accttcctcc gagttgaccc cggcggtccc acatgagttc ccggcatcac ccgctggcaa 360
catgcggcga gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga 420
cgacgaccat gcaccacctg tgaaccggcc ccgaagggaa accgtgtctc cacggcgatc 480
cggcacatgt caagcccagg taaggttctt cgcgttgcat cgaattaatc cgcatgctcc 540
gccgcttgtg cgggcccccg tcaatttctt tgagttttag ccttgcggcc gtactcccca 600
ggcggrakgc ttaacgcrtk ggytccgaca csggacccgt ggaaagggcc ccacatccca 660
gcatccaccg ttacggcgtg gactaccagg gtattwatcc tgttcgctcc cacgctttcg 720
ctcctcagcg tcagtgacgg cccagagacc tgccttcgcc attggtgttc ttcccgatat 780
ctacacattc caccgttaca ccgggaattc cagtctcccc taccgcactc cagcccgccc 840
gtacccggsg caratccacc gttaggcgat ggactttcwc accggackcg acgaaccscc 900
tacsagccct ttacgcccaa taaatccgga taacgctcgc accctacgta ttaccgcggc 960
tgctggcacg tagttagccg gtgcttattc gaacaatcca ctcaacacgg ccgaaaccgt 1020
gccttgccct tgaacaaaag cggtttacaa cccgaaggcc tccatcccgc acgcggcgtc 1080
gctgcatcag gcttgcgccc attgtgcaat attccccact gctgcctccc gtaggagtct 1140
gggccgtatc tcagtcccaa tgtggccggt caccctctca ggccggctac ccgtcaacgc 1200
cttggtgggc catcaccccg ccaacaagct gataggacgc gaccccatcc catgccgcaa 1260
aagcatttcc caccccacca tgcgatggag cggagcatcc ggtattacca cccgtttcca 1320
ggagctattc cggtgcacag ggcaggttgg tcacgcatta ctcacccgtt cgccactctc 1380
accccgacag caagctgcca gggatcccgt tcgactgcat gtgtaagcac gccgccagcg 1440
tacccc 1446

Claims (2)

1.一种制备乳双歧杆菌冻干粉的方法，其特征在于，所述乳双歧杆菌的微生物保藏编号为CGMCC No.14536，所述方法包括：
步骤1-1，在厌氧环境中，向乳双歧杆菌BL9菌泥中加入半胱氨酸盐酸盐溶液和氯化钙溶液，混合；
步骤1-2，在厌氧环境中，向步骤1-1制得的体系中加入谷氨酰胺转氨酶溶液，混合；
步骤1-3，在厌氧环境中，向步骤1-2制得的体系中加入脱脂乳粉溶液，混合，降温；
步骤1-4，在厌氧环境中，向步骤1-3制得的体系中加入壳聚糖溶液，乳化；
步骤1-5，在厌氧环境中，向步骤1-4制得的体系中加入明胶溶液，乳化；
步骤1-6，在厌氧环境中，向步骤1-5制得的体系中加入海藻糖溶液和谷胱甘肽溶液；
步骤1-7，在厌氧环境中，向步骤1-6制得的体系中加入海藻酸钠溶液；
步骤1-8，将步骤1-7制得的体系通过液氮速冻，后经真空干燥制备成冻干菌粉；其中，步骤1-1中，所述乳双歧杆菌BL9菌泥中活菌数为2000-3000亿CFU/g；所述半胱氨酸盐酸盐溶液与所述乳双歧杆菌BL9菌泥的重量比为半胱氨酸盐酸盐溶液的重量:所述乳双歧杆菌BL9菌泥的重量=（0.3~0.8）:10，其中，所述半胱氨酸盐酸盐溶液的重量以其中半胱氨酸盐酸盐的重量计；体系的温度为30℃~40℃；
步骤1-3中，搅拌后的体系降温至2℃~6℃；
所述半胱氨酸盐酸盐溶液的浓度为40wt%~60wt%；
所述氯化钙溶液的浓度为40wt%~60wt%；
所述谷氨酰胺转氨酶溶液的浓度为5wt%~15wt%；
所述脱脂乳粉溶液的浓度为10wt%~20wt%；
所述壳聚糖溶液的浓度为3wt%~8wt%；
所述明胶溶液的浓度为3wt%~8wt%；
所述海藻糖溶液的浓度为40wt%~60wt%；
所述谷胱甘肽溶液的浓度为3wt%~8wt%；
所述海藻酸钠溶液的浓度为8wt%~12wt%。
2.根据权利要求1所述方法制备的乳双歧杆菌冻干粉，其特征在于，所述乳双歧杆菌冻干粉活菌数大于4000亿CFU/g，经25℃贮藏6个月活菌存活率为52%以上。
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