CN113025521B - 一种高发酵活性保加利亚乳杆菌菌粉制备工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及乳酸菌制品制备技术领域，提出了一种高发酵活性保加利亚乳杆菌菌粉制备工艺，包括以下步骤：S1、菌种活化：无菌条件下，将低温保存的菌种恢复至室温后，1％～3％接种量接种于12～15％无菌脱脂奶中培养；S2、将菌种按接种量1％‑3％接种于发酵培养基进行发酵培养；S3、离心浓缩得菌泥；S4、第一层抗氧化剂包埋；S5、第二层抗冷冻包埋保护剂包埋；S6、液氮深冷造粒：将S5所得乳化液用液氮深冷造粒设备喷淋至液氮中，瞬时形成冷冻颗粒，回收冷冻颗粒并转移至冻干机中进行干燥；S7、收集S6所得冻干颗粒并粉碎成菌粉。通过上述技术方案，解决了现有技术中的保加利亚乳杆菌工业化菌粉发酵活力低的问题。

Description

一种高发酵活性保加利亚乳杆菌菌粉制备工艺
技术领域
本发明涉及乳酸菌制品制备技术领域，具体的，涉及一种高发酵活性保加利亚乳杆菌菌粉制备工艺。
背景技术
由于我国乳品工业起步较晚，特别是发酵乳制品，因此对乳酸菌发酵剂的研究较少，特别是具有自主知识产权的乳酸菌发酵剂的研究和开发几乎是个空白。我国传统中小型加工企业生产酸奶时大多采用继代式酸奶发酵剂，由于在传代过程中的污染及各种菌种比例失衡等原因导致产品质量较差。1997年以后，中国的酸奶企业才开始使用国外进口的直投式酸奶发酵剂。直投式酸奶发酵剂由于具有质量稳定、生产易行等特点目前已被我国大多数大型乳品加工企业所采用。尽管目前大多数大型乳品加工企业采用直投式酸奶发酵剂生产发酵乳制品，但全部是进口产品，酸奶发酵剂市场长期被美国杜邦丹尼斯克、丹麦科·汉森、荷兰帝斯曼等国外企业所垄断。由于价格较高，导致乳品企业生产成本加大(吨产品发酵剂成本在200元以上)，限制了直投式酸奶发酵剂在中、小型乳品企业的使用。
中国发酵乳品市场规模从2014年至今持续上升。据统计，2019年我国酸奶市场规模达到1419.1亿元；2014-2018年，国内常温乳酸菌饮品市场规模从57.0亿元增长至137.7亿元，复合增长率为24.7％。前瞻根据2014-2018年常温乳酸菌饮料的复合增长率24.7％进行预测，预计到2024年市场规模将500亿元。
然而，与发酵乳市场规模的快速成长相比，目前我国自主发酵剂研发缓慢，生产规模不大，乳品加工企业97％以上采用的是进口的直投式酸奶发酵剂，其中酸奶发酵剂中重要的菌种之一——保加利亚乳杆菌生产活力低是制约酸奶发酵剂本土化的主要因素之一。
保加利亚乳杆菌是酸奶发酵必不可少的菌株，分解乳糖发酵过程产生特殊的风味发酵物质，如乙醛、双乙酰(丁二酮)、丙酮等，使酸奶等独具风味。另外，保加利亚乳杆菌同时具有调节胃肠健康、增强免疫力、降低胆固醇、抗肿瘤等生理功能。
保加利亚乳杆菌属于乳酸杆菌，革兰氏阳性菌，兼性厌氧菌。菌体长2-9μm，宽0.5-0.8μm，单体呈长杆状或成链，无运动性，不产生孢子。在MRS培养基上呈白色至淡灰色，表面粗糙不光滑菌落。
发明内容
本发明提出一种高发酵活性保加利亚乳杆菌菌粉制备工艺，解决了现有技术中的保加利亚乳杆菌工业化菌粉发酵活力低的问题。
本发明的技术方案如下：
一种高发酵活性保加利亚乳杆菌菌粉制备工艺，包括以下步骤：
S1、菌种活化：无菌条件下，将低温保存的菌种恢复至室温后，1％～3％接种量接种于12～15％无菌脱脂奶中培养；
S2、将菌种按接种量1％-3％接种于发酵培养基进行发酵培养；
S3、离心浓缩得菌泥；
S4、第一层抗氧化剂包埋；
S5、第二层抗冷冻包埋保护剂包埋；
S6、液氮深冷造粒：将S5所得乳化液用液氮深冷造粒设备喷淋至液氮中，瞬时形成冷冻颗粒，回收冷冻颗粒并转移至冻干机中进行干燥；
S7、收集S6所得冻干颗粒并粉碎成菌粉。
作为进一步的技术方案，所述步骤S2中，发酵培养基包括以下组分：乳糖15～30g/L、棉籽蛋白胨5～10g/L、酵母浸粉5～15g/L、鱼蛋白胨3～10g/L、浓缩乳清蛋白0.5～2g/L、核苷酸类物质2～15g/L、乙酸钠2～8g/L、柠檬酸0.2～0.5g/L、磷酸氢二钠3～8g/L、硫酸镁0.2～0.8g/L、硫酸锰0.05～0.4g/L、异-D抗坏血酸钠或抗坏血酸钠0.5-1.0g/L。
作为进一步的技术方案，所述核苷酸类物质包括5’-肌苷酸二钠、5’-鸟苷酸二钠、5’-呈味核苷酸二钠中的一种或两种及以上。
作为进一步的技术方案，所述步骤S2中发酵培养在42℃恒温静置培养发酵至发酵终止，以发酵液活力最高时的pH值为发酵终点。
作为进一步的技术方案，所述步骤S3具体为6000～9000rpm离心20～30min。
作为进一步的技术方案，其特征在于，所述步骤S4第一层抗氧化包埋按菌泥：抗氧化剂溶液质量比为1:(0.5-1.5)比例混合均匀，所述抗氧化剂为质量浓度1.0％-3.0％为的异-D抗坏血酸钠或抗坏血酸钠溶液，4℃放置15-20min。
作为进一步的技术方案，其特征在于，所述步骤S5中第二层抗冷冻包埋保护剂，包括以下组分：乳清水解蛋白5～15份，海藻糖5～15份、谷氨酸0.1～1份、β-环糊精3～10份、甘油0.5～1份、小麦肽粉2～6份。
作为进一步的技术方案，其特征在于，所述步骤S6中冻干机干燥时间为18～25h。
作为进一步的技术方案，其特征在于，所述菌泥与所述第二层抗冷冻包埋保护剂的质量比为1:(0.5-1.5)。
根据上述任意一项所述的一种高发酵活性保加利亚乳杆菌菌粉制备工艺制备得到的保加利亚乳杆菌菌粉在食品中的应用。
本发明的有益效果为：
1、由于保加利亚乳杆菌是酸奶发酵工艺中的必须菌种，但是保加利亚乳杆菌菌体较长，厌氧生长的特性，与其他乳杆菌不同，其发酵活力低是目前较大的问题。本发明基于这一问题，通过无数次的实验探究确定了一种高发酵活性保加利亚乳杆菌菌粉制备工艺制备，本发明制成的菌粉在3％蛋白含量的复原脱脂乳中，按60g/吨接种量，发酵6h，脱脂乳酸度可达50-55°T，满足工业发酵剂中对于保加利亚乳杆菌发酵活力的要求，本发明的制备工艺流程针对于保加利亚乳杆菌的特性，能够保证保加利亚乳杆菌的发酵活力，而对于其他的乳杆菌，本发明的制备工艺并不适用，例如植物乳杆菌、双歧杆菌一般用于益生菌，需要保证的是较高的活菌数，并不面临保加利亚乳杆菌发酵活力低的问题，因此无法采用本发明的制备工艺也没有必要采用本发明的制备工艺。
2、保加利亚乳杆菌属于化能异养型微生物，对生长环境及营养物质的要求比较苛刻。一般来说，脱脂乳和乳清是乳酸菌的最佳培养基，本发明经反复试验，确定了乳糖为唯一碳源，氮源为棉籽蛋白胨、酵母浸粉、鱼蛋白胨、浓缩乳清蛋白的组合，这有利于菌体发酵期间维持高活性状态。乳糖作为碳源，在细胞内分解代谢提供小分子碳架外，还产生能量供合成代谢需要的能量，更重要的是出于保持保加利亚乳杆菌的活性的目的，经过无数次的实验探究，本发明发明人发现当碳源为乳糖时，比其他常规碳源如葡萄糖等对菌体发酵期间维持高活性状态最为有利。本发明采用棉籽蛋白胨、酵母浸粉、鱼蛋白胨、浓缩乳清蛋白为组合氮源，除了促进微生物的生长发育外，还要保证保加利亚乳杆菌的活性。
3、保加利亚乳杆菌喜厌氧环境，在厌氧环境中能够保持较高发酵活力，因此，本发明同时使用抗氧化剂创造相对低氧发酵环境；除此之外，菌泥浓缩后也用抗氧化剂进行包埋，尽量减少氧气对菌体的伤害。
4、保加利亚乳杆菌在乳酸菌常规培养基中，菌体个体大，发酵活力较低，不能满足工业需求，本发明的培养基组成，一方面提升发酵活力，另一方面使菌体变小，利于后期冷冻干燥。另外，本发明发现，培养基中添加核苷酸类物质食品添加剂5’-肌苷酸二钠(5’-IMP)、5’-鸟苷酸二钠(5’-GMP)、5’-呈味核苷酸二钠(5’-I+G)，可以促进保加利亚乳杆菌发酵活力提升，添加后发酵液活力从55-58°T增加至70-74°T，这主要是由于该物质参与了菌体的DNA和RNA修复，从而有助于酶的合成。
5、常规真空冷冻工艺，预冻结段一般需要1-2h，属于慢速冷冻。保加利亚乳杆菌相对于一般乳酸杆菌，其菌体更加粗长，在慢速冷冻条件下，其菌体中形成的冰晶数量少而晶体较大，大的冰晶更易造成菌体细胞膜及其上附着的酶系的破坏以及菌体细胞的内容物暴露而死亡。而在快速冷冻的条件下，菌体中形成的冰晶数量多且晶体细小，因此，本发明一方面选择合适的培养基组分，使其在发酵时期形成较短的菌体利于冷冻，细胞减少损伤，另一方面用液氮冷冻造粒，使菌体内在极短时间之内形成冰晶，减小冰晶的体积，保护菌体细胞的完整性。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1为本发明实施例与对比例的发酵液和接种量60g/t时菌粉的发酵活力；
图2为对比例1与本发明实施例1培养基显微镜下菌体大小比较(1600×)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都涉及本发明保护的范围。
实施例1
(1)菌种活化：无菌条件下，将-80℃保存的菌种恢复至室温后，2％接种量接种于12％无菌脱脂奶中，37℃培养14h。以上条件连续传代3次。
(2)配制发酵培养基：
准确称取20g/L乳糖、棉籽蛋白胨8g/L、酵母浸粉5g/L、鱼蛋白胨3g/L、浓缩乳清蛋白1g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸0.25g/L、磷酸氢二钠4g/L、硫酸镁0.6g/L、硫酸锰0.3g/L，以上成分加入90％发酵量的纯化水，调pH6.6，115℃灭菌20min得培养基A液。准确称取5’-呈味核苷酸二钠4g/L溶于发酵量5％的纯化水中，得培养基B液。
准确称取异D-抗坏血酸钠0.55g/L溶解于发酵量的5％纯化水中，过滤除菌后得培养基C液。与A、B液于50℃以下混合。
(3)发酵培养：将第三代菌种接种于发酵培养基，接种量1％，42℃恒温静置培养。
(4)发酵终止：发酵液pH值降至4.40-4.50时，立即停止发酵。检测发酵液发酵活力为70°T(1％接种量)
(5)离心浓缩：7000rpm离心20min，去掉上清，收集菌泥。
(6)第一层抗氧化包埋
抗氧化剂溶液：准确称取1.5g异D-抗坏血酸钠溶于纯化水中，混合均匀，制备质量浓度1.0％异D-抗坏血酸钠溶液，过滤除菌后使用。准确称取10g菌泥，加入抗氧化剂溶液15g，混合均匀后4℃放置15min。
(7)第二层抗冷冻包埋
抗冷冻包埋保护剂：准确称取乳清水解蛋白8g，海藻糖5g、谷氨酸0.5g、β-环糊精5g、甘油0.5g、小麦肽粉3g。加入100g纯化水中混匀，110℃灭菌20min。
取菌泥与抗氧化剂混合菌液，加入抗冷冻包埋保护剂10g，混合乳化均匀，形成乳化液。
(8)预冷冻干
乳化液用液氮深冷造粒设备喷淋至液氮中，瞬时形成冷冻颗粒。回收冷冻颗粒并转移至冻干机中进行干燥。
(9)冻干18h后收集冻干颗粒并粉碎成菌粉。检测菌粉发酵活力为50°T(60g/t接种量)
实施例2
(1)菌种活化：无菌条件下，将-80℃保存的菌种恢复至室温后，2％接种量接种于12％无菌脱脂奶中，37℃培养14h。以上条件连续传代3次。
(2)配制发酵培养基：
准确称取25g/L、棉籽蛋白胨5g/L、酵母浸粉8g/L、鱼蛋白胨5.0g/L、浓缩乳清蛋白1.5g/L、乙酸钠8g/L、柠檬酸0.35g/L、磷酸氢二钠5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸锰0.05g/L，以上成分加入95％发酵量的纯化水，调pH6.4，115℃灭菌20min得培养基A液。
准确称取5’-肌苷酸核苷酸二钠4g/L、5’-鸟苷酸核苷酸二钠2g/L溶于发酵量5％的纯化水中，得培养基B液。
准确称取异D-抗坏血酸钠0.80g/L、半胱氨酸0.5g/L溶解于发酵量的5％纯化水中，过滤除菌后得培养基B液。与A、B液于50℃以下混合。
(3)发酵培养：将第三代菌种接种于发酵培养基，接种量2％，42℃恒温静置培养。
(4)发酵终止：发酵液pH值降至4.50-4.55时，立即停止发酵。检测发酵液发酵活力为73°T(1％接种量)
(5)离心浓缩：6000rpm离心20min，去掉上清，收集菌泥。
(6)第一层抗氧化包埋
抗氧化剂溶液：准确称取1.8g异D-抗坏血酸钠溶于纯化水中，混合均匀，制备质量浓度1.0％异D-抗坏血酸钠溶液，过滤除菌后使用。准确称取10g菌泥，加入抗氧化剂溶液10g，混合均匀后4℃放置15min。
(7)第二层抗冷冻包埋
抗冷冻包埋保护剂：准确称取乳清水解蛋白5g、海藻糖6g、谷氨酸1.0g、β-环糊精6g、甘油1.0g、小麦肽粉6g。加入100g纯化水中混匀，110℃灭菌20min。
取菌泥与抗氧化剂混合菌液，加入抗冷冻包埋保护剂10g，混合乳化均匀，形成乳化液。
(8)预冷冻干
乳化液用液氮深冷造粒设备喷淋至液氮中，瞬时形成冷冻颗粒。回收冷冻颗粒并转移至冻干机中进行干燥。
(9)冻干24h后收集冻干颗粒并粉碎成菌粉。检测菌粉发酵活力为55°T(60g/t接种量)
实施例3
(1)菌种活化：无菌条件下，将-80℃保存的菌种恢复至室温后，1％接种量接种于15％无菌脱脂奶中，37℃培养14h。以上条件连续传代3次。
(2)配制发酵培养基：
准确称取15g/L、棉籽蛋白胨6g/L、酵母浸粉5g/L、鱼蛋白胨3g/L、浓缩乳清蛋白0.5g/L、乙酸钠2g/L、柠檬酸0.2g/L、磷酸氢二钠3g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.05g/L，以上成分加入95％发酵量的纯化水，调pH6.4，115℃灭菌20min得培养基A液。
准确称取5’-肌苷酸核苷酸二钠4g/L、呈味核苷酸二钠2g/L溶于发酵量5％的纯化水中，得培养基B液。
准确称取异D-抗坏血酸钠0.80g/L溶解于发酵量的5％纯化水中，过滤除菌后得培养基B液。与A、B液于50℃以下混合。
(3)发酵培养：将第三代菌种接种于发酵培养基，接种量1％，42℃恒温静置培养。
(4)发酵终止：发酵液pH值降至4.50-4.55时，立即停止发酵。检测发酵液发酵活力为68°T(1％接种量)
(5)离心浓缩：9000rpm离心20min，去掉上清，收集菌泥。
(6)第一层抗氧化包埋
抗氧化剂溶液：准确称取1.8g抗坏血酸钠溶于纯化水中，制备质量浓度1.5％异D-抗坏血酸钠溶液，混合均匀，过滤除菌后使用。准确称取10g菌泥，加入抗氧化剂溶液5g，混合均匀后4℃放置15min。
(7)第二层抗冷冻包埋
抗冷冻包埋保护剂：准确称取乳清水解蛋白5g、海藻糖5g、谷氨酸0.1g、β-环糊精3g、甘油0.5g、小麦肽粉2g。加入100g纯化水中混匀，110℃灭菌20min。
取菌泥与抗氧化剂混合菌液，加入抗冷冻包埋保护剂5g，混合乳化均匀，形成乳化液。
(8)预冷冻干
乳化液用液氮深冷造粒设备喷淋至液氮中，瞬时形成冷冻颗粒。回收冷冻颗粒并转移至冻干机中进行干燥。
(9)冻干25h后收集冻干颗粒并粉碎成菌粉。检测菌粉发酵活力为53°T(60g/t接种量)
实施例4
(1)菌种活化：无菌条件下，将-80℃保存的菌种恢复至室温后，3％接种量接种于15％无菌脱脂奶中，37℃培养14h。以上条件连续传代3次。
(2)配制发酵培养基：
准确称取30g/L乳糖、棉籽蛋白胨10g/L、酵母浸粉15g/L、鱼蛋白胨10g/L、浓缩乳清蛋白2g/L、乙酸钠8g/L、柠檬酸0.5g/L、磷酸氢二钠8g/L、硫酸镁0.8g/L、硫酸锰0.4g/L，以上成分加入90％发酵量的纯化水，调pH6.6，115℃灭菌20min得培养基A液。准确称取5’-鸟苷酸二钠12g/L溶于发酵量5％的纯化水中，得培养基B液。
准确称取异D-抗坏血酸钠1g/L溶解于发酵量的5％纯化水中，过滤除菌后得培养基C液。与A、B液于50℃以下混合。
(3)发酵培养：将第三代菌种接种于发酵培养基，接种量1％，42℃恒温静置培养。
(4)发酵终止：发酵液pH值降至4.40-4.50时，立即停止发酵。检测发酵液发酵活力为72°T(1％接种量)
(5)离心浓缩：9000rpm离心30min，去掉上清，收集菌泥。
(6)第一层抗氧化包埋
抗氧化剂溶液：准确称取2g异D-抗坏血酸钠溶于纯化水中，混合均匀，制备质量浓度3.0％异D-抗坏血酸钠溶液，过滤除菌后使用。准确称取10g菌泥，加入抗氧化剂溶液15g，混合均匀后4℃放置15min。
(7)第二层抗冷冻包埋
抗冷冻包埋保护剂：准确称取乳清水解蛋白8g，海藻糖5g、谷氨酸0.5g、β-环糊精5g、甘油0.5g、小麦肽粉3g。加入100g纯化水中混匀，110℃灭菌20min。
取菌泥与抗氧化剂混合菌液，加入抗冷冻包埋保护剂15g，混合乳化均匀，形成乳化液。
(8)预冷冻干
乳化液用液氮深冷造粒设备喷淋至液氮中，瞬时形成冷冻颗粒。回收冷冻颗粒并转移至冻干机中进行干燥。
(9)冻干18h后收集冻干颗粒并粉碎成菌粉。检测菌粉发酵活力为54°T(60g/t接种量)
对比例1
采用MRS培养基替代实施例1中的发酵培养基，其他操作与实施例1相同。
对比例2
不添加实施例1中的培养基B液，其他操作与实施例1相同。
对比例3
将实施例1中的采用常规真空冷冻工艺预冷冻干2h，其他操作与实施例1相同。
对比例4
不添加实施例1中棉籽蛋白胨、鱼蛋白胨，其他操作与实施例1相同。
对比例5
将实施例1中的5’-呈味核苷酸二钠替换为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，其他操作与实施例1相同。
对比例6
实施例1中棉籽蛋白胨替换为大豆蛋白胨，其他操作与实施例1相同
如图1所示，与常规培养液相比，本发明的实施例1发酵液的发酵活力由40°T提高到70°T，菌粉的发酵活力由25°T提高到50°T，提高了一倍。当不添加核苷酸类物质时，发酵液的发酵活力下降至55°T，经过冻干处理后，菌粉发酵活力与本发明的实施例1相比，降低了40％。当采用常规真空冷冻工艺时，由于慢速冷冻使得菌体细胞膜及其上附着的酶系的破坏以及菌体细胞的内容物暴露而死亡，降低了菌粉的活性，同时经过常规真空冷冻工艺时，无法得到菌粉颗粒。当培养基中的氮源缺少棉籽蛋白胨和鱼蛋白胨时，不仅对菌体的生长造成了影响，而且也降低了菌粉的活性。另外，可以发现本发明的实施例2中添加半胱氨酸，使得保加利亚乳杆菌的活性与其他实施例相比较高。而发明人经过对比发现，当使用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸提高发酵液活力时，发酵液的发酵活力与液氮深冷造粒后菌粉的活性都降低。发明人发现，当添加常规大豆蛋白胨作为氮源之一时，发酵活力不如本发明的棉籽蛋白胨。
图2左、右分别为对比例1、实施例1培养基显微镜下菌体大小比较(1600×)。按照本发明实施例1的方法得到的菌体远小于常规培养基的菌体，而且大小均匀。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种高发酵活性保加利亚乳杆菌菌粉制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：
S1、菌种活化：无菌条件下，将低温保存的菌种恢复至室温后，1%~3%接种量接种于12~15%无菌脱脂奶中培养；
S2、将菌种按接种量1%-3%接种于发酵培养基进行发酵培养；
S3、离心浓缩得菌泥；
S4、第一层抗氧化剂包埋；
S5、第二层抗冷冻包埋保护剂包埋；
S6、液氮深冷造粒：将S5所得乳化液用液氮深冷造粒设备喷淋至液氮中，瞬时形成冷冻颗粒，回收冷冻颗粒并转移至冻干机中进行干燥；
S7、收集S6所得冻干颗粒并粉碎成菌粉；
所述步骤S2中，发酵培养基包括以下组分：乳糖15~30g/L、棉籽蛋白胨5~10g/L、酵母浸粉5~15g/L、鱼蛋白胨3~10g/L、浓缩乳清蛋白0.5~2g/L、核苷酸类物质2~15g/L、乙酸钠2~8g/L、柠檬酸0.2~0.5g/L、磷酸氢二钠3~8g/L、硫酸镁0.2~0.8g/L、硫酸锰0.05~0.4g/L、异-D抗坏血酸钠或抗坏血酸钠0.5-1.0g/L；所述核苷酸类物质包括5’-肌苷酸二钠、5’-鸟苷酸二钠、5’-呈味核苷酸二钠中的一种或两种及以上。
2.根据权利要求1所述的一种高发酵活性保加利亚乳杆菌菌粉制备工艺，其特征在于，所述步骤S2中发酵培养在42℃恒温静置培养发酵至发酵终止，以发酵液活力最高时的pH值为发酵终点。
3.根据权利要求1所述的一种高发酵活性保加利亚乳杆菌菌粉制备工艺，其特征在于，所述步骤S3具体为6000~9000rpm离心20~30min。
4.根据权利要求1所述的一种高发酵活性保加利亚乳杆菌菌粉制备工艺，其特征在于，所述步骤S4第一层抗氧化包埋按菌泥：抗氧化剂溶液质量比为1:(0.5-1.5)比例混合均匀，所述抗氧化剂为质量浓度为1.0%-3.0%的异-D抗坏血酸钠或抗坏血酸钠，4℃放置15-20min。
5.根据权利要求1所述的一种高发酵活性保加利亚乳杆菌菌粉制备工艺，其特征在于，所述步骤S5中第二层抗冷冻包埋保护剂，包括以下组分：乳清水解蛋白5~15份，海藻糖5~15份、谷氨酸0.1~1份、β-环糊精3~10份、甘油0.5~1份、小麦肽粉2~6份。
6.根据权利要求1所述的一种高发酵活性保加利亚乳杆菌菌粉制备工艺，其特征在于，所述步骤S6中冻干机干燥时间为18~25h。
7.根据权利要求5所述的一种高发酵活性保加利亚乳杆菌菌粉制备工艺，其特征在于，所述菌泥与所述第二层抗冷冻包埋保护剂的质量比为1:(0.5-1.5)。
8.根据权利要求1~7任意一项所述的一种高发酵活性保加利亚乳杆菌菌粉制备工艺制备得到的保加利亚乳杆菌菌粉在食品中的应用。
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