CN104152371A

CN104152371A - 一种直投式乳酸菌发酵乳用发酵剂的制作方法

Info

Publication number: CN104152371A
Application number: CN201410244634.1A
Authority: CN
Inventors: 侯保朝; 李言郡; 李宝磊; 赵建云; 葛红娟; 邢良英; 马广辉; 范秋领; 陈琳; 陈苏; 徐显睿; 陈丽娥
Original assignee: HANGZHOU WAHAHA TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: HANGZHOU WAHAHA TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2014-06-05
Filing date: 2014-06-05
Publication date: 2014-11-19

Abstract

本发明公开了一种直投式乳酸菌发酵乳用发酵剂的制作方法，本发明包括嗜热链球菌菌粉制备、德式乳杆菌保加利亚亚种菌粉制备、及将嗜热链球菌菌粉与德式乳杆菌保加利亚亚种菌粉按照1.5-2:1的重量比混合均匀，充氮气包装后得产品。本发明工艺简单易行，适合工业化生产，所得发酵剂具有含活性乳酸菌数量高、保质期长、发酵乳性能优良、使用简单、使用量少等优点。

Description

一种直投式乳酸菌发酵乳用发酵剂的制作方法

技术领域

本发明涉及一种发酵剂的制作方法，特别涉及一种直投式乳酸菌发酵乳用发酵剂的制作方法。

背景技术

近年来，直投式发酵乳发酵剂已广泛应用于乳制品行业，直投式发酵乳发酵剂作为生物研究的一个领域，对人类的营养和健康具有重大的意义。目前直投式发酵乳发酵剂在食品中主要应用于发酵乳制品，同时也逐步被应用于其他功能性食品，如果汁、冰激凌、糖果等。

2012年，市场研究机构Euromonitor International调研数据表明，2011全球类似于直投式发酵乳发酵剂的发酵食品和补充剂的销售额为280亿美元，预计到2016年，将以50%的增长达到420亿美元。在2012年的益生菌全球市场份额中，最大的收入来源是以直投式发酵乳发酵剂为基础开发的乳酸饮料，约140亿美元的市场份额，其次是直接采用直投式发酵乳发酵剂生产的酸奶已达113亿美元，然后为补充剂27亿美元及果汁1.35亿美元。欧洲市场上益生菌乳酸饮料领军的产品为Danone和Yaklut，在2003年它们的销售额就达到12亿欧元。在日本、法国、俄罗斯、德国等国家，直投式发酵乳发酵剂的研究与应用受到广泛重视，其中，法国每年用在此方面的研究开发经费高达数亿法郎，其重视程度可见一般。

但直投式发酵乳发酵剂在我国的研究与利用，与发达国家相比尚存在一定的距离。中国的直投式发酵乳发酵剂产业，起步很迟，是进入21世纪后才被重视和发展起来的。目前，中国直投式发酵乳发酵剂产业发展最为核心的菌种基本上都受制于他人。国内企业所使用的菌种几乎全部源自进口或由外资企业在华设厂所生产而提供的, 其中，最主要的是杜邦和科汉森两大企业。

目前，我司每年对益生菌菌粉的需求达到15万包（约合15吨），购买费用达到几千万元人民币。在此背景下，开发出和国外先进的直投式发酵菌剂功能及发酵乳风味相似的菌种发酵剂，从而完全替代目前生产所用的国外直投式发酵乳发酵剂。

经检测发现，目前生产上所用的直投式发酵乳发酵剂菌粉活力相对偏低，有的还不足10¹⁰CFU/g，在生产中需要添加的剂量过大，同时传代不稳定，容易出现产品质量问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种直投式乳酸菌发酵乳用发酵剂的制作方法，工艺简单易行，适合工业化生产，所得发酵剂具有含活性乳酸菌数量高、保质期长、发酵乳性能优良、使用简单、使用量少等优点。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种直投式乳酸菌发酵乳用发酵剂的制作方法，包括如下步骤：

一、嗜热链球菌菌粉制备

（1）配制嗜热链球菌培养基，将嗜热链球菌接种于嗜热链球菌培养基中进行高密度发酵培养，接种量为0.1-0.3wt%，嗜热链球菌发酵培养过程中：pH维持在6.6-7.0之间，培养温度设定为36.5-44.5℃，发酵时间设定为4-5小时，在发酵培养过程中采用5-10%的氨水进行发酵pH控制；

（2）发酵培养结束后，对所得发酵液进行离心，离心力控制在6000-10000g，离心时间10-30分钟，随后将离心得到的菌泥在无菌条件下复溶于0.8-1%的NaCl溶液中，再进行二次离心，二次离心力控制在6000-8000g，离心时间10-30分钟，随后将得到的二次离心菌泥与冻干保护剂按照1:1-2的重量比混合均匀；

（3）将二次离心菌泥与冻干保护剂混合物在0.1-0.5Mpa的输送压力下，经过喷嘴垂直喷射入液氮中形成固态颗粒，过滤收集固态颗粒获得液氮造粒半成品；

二次离心的主要目的有二个：1.进一步消除离心菌泥中的乳酸残留，从而避免底物反馈抑制的二次发生，2.防止培养基中不适合直接添加到发酵乳中的物质余量残留，由于培养基中某些成分直接加入食品中对人体不宜，因此通过二次离心可消除潜在的食品安全隐患。

（4）液氮造粒半成品在-40℃下真空冷冻干燥24-72小时得到嗜热链球菌菌粉；

二、德式乳杆菌保加利亚亚种菌粉制备

（a）配制德式乳杆菌保加利亚亚种培养基，将德式乳杆菌保加利亚亚种接种于德式乳杆菌保加利亚亚种培养基中进行高密度发酵培养，接种量为0.1-0.3wt%，德式乳杆菌保加利亚亚种发酵培养过程中：pH维持在5.1-5.6之间，培养温度设定为37.0-42.5℃，发酵时间设定为6-8小时，在发酵培养过程中采用5-10%的氨水进行发酵pH控制；

发酵培养过程中采用5-10%的氨水进行发酵pH控制，氨水溶解于培养基后所形成的的铵根离子可以作为微生物发酵的有限氮源供其生长所需,铵盐、硝酸盐等虽然不是乳酸菌的最适碳源，但乳酸菌依然可以利用其进行生物代谢，高密度发酵过程中氨水在调节pH的过程中，会有产生铵盐，这些铵盐在高密度发酵对数期，可以快速便捷的随着调节pH的进行，通过渗透扩散和膜蛋白运输等作用为乳酸菌快速增值提供氮源动力。

（b）发酵培养结束后，对所得发酵液进行离心，离心力控制在6000-10000g，离心时间10-30分钟，随后将离心得到的菌泥在无菌条件下复溶于0.8-1%的NaCl溶液中，再进行二次离心，二次离心力控制在6000-8000g，离心时间10-30分钟，随后将得到的二次离心菌泥与冻干保护剂按照1:1-2的重量比混合均匀；

（c）将二次离心菌泥与冻干保护剂混合物在0.1-0.5Mpa的输送压力下，经过喷嘴垂直喷射入液氮中形成固态颗粒，过滤收集固态颗粒获得液氮造粒半成品；

（d）液氮造粒半成品在-40℃下真空冷冻干燥24-72小时得到德式乳杆菌保加利亚亚种菌粉；

三、混合

将嗜热链球菌菌粉与德式乳杆菌保加利亚亚种菌粉按照1.5-2:1的重量比混合均匀，充氮气包装后得产品。

作为优选，所述嗜热链球菌培养基的配方由以下重量百分比计的组分组成：乳糖1-9%，脱脂乳酶解物1-10%，浓缩番茄汁1-5%，水溶性小麦蛋白1-3%，酵母抽提物0.1-2%，余量为无菌水。

由于嗜热链球菌在生长增值过程中，需要消耗大量的有机氮源，尤其是氨基酸类物质，但由于菌体自身不能产生大量的胞外蛋白酶，因此生长极易受到影响和抑制，而浓缩番茄汁、酵母抽提物这些成分富含氨基酸、维生素类，极易被乳酸菌利用，通过添加这些成分后，可大大刺激嗜热链球菌的生长增值；水溶性小麦蛋白中由于富含天然谷光氨肽功能成分，可有效刺激乳酸菌的快速生长繁殖，因此，本发明采用上述特定配比的嗜热链球菌培养基配方。

作为优选，所述德式乳杆菌保加利亚亚种培养基的配方由以下重量百分比计的组分组成：乳糖1-9%，脱脂乳酶解物1-10%，浓缩番茄汁1-5%，酵母抽提物0.1-2%， K₂HPO₄·3H₂O 0.1-3%，Tween 0.01-6%，甲酸钠0.01-0.1%，余量为无菌水。

因此，本发明采用上述特定配比的德式乳杆菌保加利亚亚种培养基配方可有效刺激德式乳杆菌的生长繁殖能力，达到发酵周期短，乳酸菌活菌含量高的目的，并提高终发酵液中活性菌的得率。

作为优选，所述冻干保护剂由以下重量百分比计的组分混合制成：3-10%的甘油，0.1-1%的维生素C，1-3%的小牛血清，0.1-3%的甘露醇，1-5%的蔗糖，0.1-0.5%的明胶，1-10%的海藻多糖，余量为无菌水。

海藻多糖和小牛血清的添加目的是为了给乳酸菌提供一个适宜的保护外层；甘露醇、蔗糖、甘油的添加目的是为了通过胞膜的渗透作用对细胞膜的稳定性和完整性提供保护；Vc具有抗氧化作用，通过其添加可提高乳酸菌在加工过程中对空气中氧的耐受性；以上3类物质的添加，主要是为了增强乳酸菌在冷冻干燥过程中的耐受性，提高最终样品中的存活率。明胶的添加是为了提高冷冻干燥过程中的冻结冰点，同时可提高冻干菌种样品的玻璃化转化温度，随着玻璃化转化温度的提升，可有效节约能耗，研究表明，玻璃化温度每提升1℃，冷冻干燥过程中的能耗可节约13%左右，而随着明胶的加入，冻干保护剂各物质间的协同效应明显加强，玻璃化转化温度提高了近5℃，保护效果明显增加，最终活菌数可达10¹¹-10¹⁴cfu/g。

作为优选，步骤（3）及步骤（c）中喷嘴与液氮液面的垂直距离为20-50cm，喷嘴孔径为0.1-5mm。

由于在菌种的冷冻干燥过程中，菌泥和保护剂混合后的样品含水量较大，在冷冻过程中，随着温度的降低，样品中的水将逐渐凝结成冰晶，随着冰晶的长大，将会刺破胞膜，造成乳酸菌不可逆的损伤，影响最终产品中的活菌数。而本发明采取急速的温度降低，采用液氮造粒手段，将二次离心菌泥与冻干保护剂混合物喷射入液氮中，可迅速形成大量的微小冰核，而不会形成大颗粒冰晶，从而最大限度的减少对乳酸菌的损伤，最大限度的保证最终产品中较高的活菌数。

控制二次离心菌泥与冻干保护剂混合物的输送压力、喷嘴与液氮液面的垂直距离及喷嘴孔径保证二次离心菌泥与冻干保护剂混合物在进入液氮时都成为了液滴状，保证液氮造粒的效果。

作为优选，嗜热链球菌发酵培养过程中采用补料工艺，所述补料工艺为在嗜热链球菌接种后的第2-4小时，补加占嗜热链球菌培养基5-15%体积的嗜热链球菌补料培养基，嗜热链球菌补料培养基的配方由以下重量百分比计的组分组成：10-15%的乳糖，0.1-3%的酵母抽提物，0.1-5%的蛋白胨，余量为无菌水。

作为优选，德式乳杆菌保加利亚亚种发酵培养过程中采用补料工艺，所述补料工艺为在德式乳杆菌保加利亚亚种接种后的第2-4小时，补加德式乳杆菌保加利亚亚种培养基5-15%体积的德式乳杆菌保加利亚亚种补料培养基，德式乳杆菌保加利亚亚种补料培养基的配方由以下重量百分比计的组分组成：10-15%的乳糖，1-10%的脱脂乳酶解物，0.1-3%的酵母抽提物，1-5%的浓缩番茄汁，余量为无菌水。

本发明采用补料工艺，乳酸菌在高密度发酵过程中，当菌体处于延迟期时，由于菌体对新培养基有一个适应过程，因此物料中的碳源浓度一般不能太高，否则容易造成较高的渗透压，影响菌体增殖生长的启动，因此初始培养基中的糖浓度一般不会太高；当其生长达到对数生长中后期，培养基中的碳源（乳糖等）即将消耗完全，同时细胞合成及各种合成代谢活动需要大量的维生素及氨基酸类物质，因此在此时适时补充乳酸菌快速生长所需要的各种营养物质是保证获得最大发酵得率的有效手段，而补充的相关物质主要是乳糖、酵母抽提物、蛋白胨等，可以明显增加最终发酵液中的乳酸菌得率，最终活菌数比未补料工艺高出5-10倍的活菌数。

作为优选，所述脱脂乳酶解物的制备方法为：将质量浓度10-20%的脱脂乳水溶液加热到55-60℃，加入复合酶制剂，复合酶制剂添加量为脱脂乳水溶液重量的0.01-0.1%，100-150rpm/min转速的搅拌条件下，保温酶解1-3h，过200-300目筛网，得到的滤液即为脱脂乳酶解物。

采用本发明的工艺制备的脱脂乳酶解物发酵培养效果好。

作为优选，所述复合酶制剂由蛋白酶、脂肪酶及乳糖酶组成，蛋白酶：脂肪酶：乳糖酶的重量比=2-3:2-3:1。

本发明的有益效果是：

1、工艺简单易行，适合工业化生产。

2、具有含活性乳酸菌数量高、保质期长、发酵乳性能优良、使用简单、使用量少等优点。

3、在使用过程中，一般为一次性使用，方便、简单、准确，不需要像传统发酵剂使用那样，进行连续扩培繁殖传代，减少了相关菌种生产所需的投资和人员投入，同时可最大限度的降低杂菌或其他微生物污染的几率，确保每批次发酵乳产品的质量稳定，减少潜在的不必要浪费。

4、产品性能稳定，可在-18℃以下冷冻保存，保质期长达24月；在室温条件下也可维持12月的发酵活力。在使用过程中，操作简单，只需要简单复水或者溶解于1-10%的脱脂奶粉溶液中，就可直接用于生产；同时方便运输，适合长距离配送。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

本发明的原料浓缩番茄汁（5倍浓缩汁）、水溶性小麦蛋白、酵母抽提物等都为市售产品。

菌种来源：从市售发酵乳或自然发酵乳中分离出产粘能力强的嗜热链球菌和产酸性能好的德式乳杆菌保加利亚亚种。

实施例1：

一、嗜热链球菌菌粉制备

（1）配制嗜热链球菌培养基，嗜热链球菌培养基的配方由以下重量百分比计的组分组成：乳糖1%，脱脂乳酶解物10%，浓缩番茄汁1%，水溶性小麦蛋白1%，酵母抽提物2%，无菌水85%。将嗜热链球菌接种于嗜热链球菌培养基中进行高密度发酵培养，接种量为0.1wt%，嗜热链球菌发酵培养过程中：pH维持在6.6-7.0之间，培养温度设定为36.5℃，发酵时间设定为5小时，在发酵培养过程中采用质量浓度5%的氨水进行发酵pH控制。

（2）发酵培养结束后，对所得发酵液进行离心，离心力控制在6000g，离心时间30分钟，随后将离心得到的菌泥在无菌条件下复溶于0.8%的NaCl溶液中，再进行二次离心，二次离心力控制在6000g，离心时间30分钟，随后将得到的二次离心菌泥与冻干保护剂按照1:1的重量比混合均匀。

（3）将二次离心菌泥与冻干保护剂混合物在0.1Mpa的输送压力下，经过喷嘴垂直喷射入液氮中形成固态颗粒，过滤收集固态颗粒获得液氮造粒半成品，喷嘴与液氮液面的垂直距离为20cm，喷嘴孔径为0.1mm。

（4）液氮造粒半成品在-40℃下真空冷冻干燥24小时得到嗜热链球菌菌粉。

嗜热链球菌发酵培养过程中采用补料工艺，所述补料工艺为在嗜热链球菌接种后的第2小时，补加占嗜热链球菌培养基5%体积的嗜热链球菌补料培养基，嗜热链球菌补料培养基的配方由以下重量百分比计的组分组成：10%的乳糖，3%的酵母抽提物，5%的蛋白胨，无菌水82%。

二、德式乳杆菌保加利亚亚种菌粉制备

（a）配制德式乳杆菌保加利亚亚种培养基，德式乳杆菌保加利亚亚种培养基的配方由以下重量百分比计的组分组成：乳糖1%，脱脂乳酶解物10%，浓缩番茄汁1%，酵母抽提物2%， K₂HPO₄·3H₂O 0.1%，Tween 0.01%，甲酸钠0.01%，无菌水85.88%。将德式乳杆菌保加利亚亚种接种于德式乳杆菌保加利亚亚种培养基中进行高密度发酵培养，接种量为0.1wt%，德式乳杆菌保加利亚亚种发酵培养过程中：pH维持在5.1-5.6之间，培养温度设定为37.0℃，发酵时间设定为8小时，在发酵培养过程中采用5%的氨水进行发酵pH控制。

（b）发酵培养结束后，对所得发酵液进行离心，离心力控制在6000g，离心时间30分钟，随后将离心得到的菌泥在无菌条件下复溶于0.8%的NaCl溶液中，再进行二次离心，二次离心力控制在6000g，离心时间30分钟，随后将得到的二次离心菌泥与冻干保护剂按照1:1的重量比混合均匀。

（c）将二次离心菌泥与冻干保护剂混合物在0.1Mpa的输送压力下，经过喷嘴垂直喷射入液氮中形成固态颗粒，过滤收集固态颗粒获得液氮造粒半成品，喷嘴与液氮液面的垂直距离为20cm，喷嘴孔径为0.1mm。

（d）液氮造粒半成品在-40℃下真空冷冻干燥24小时得到德式乳杆菌保加利亚亚种菌粉。

德式乳杆菌保加利亚亚种发酵培养过程中采用补料工艺，所述补料工艺为在德式乳杆菌保加利亚亚种接种后的第2小时，补加德式乳杆菌保加利亚亚种培养基5%体积的德式乳杆菌保加利亚亚种补料培养基，德式乳杆菌保加利亚亚种补料培养基的配方由以下重量百分比计的组分组成：10%的乳糖，10%的脱脂乳酶解物，3%的酵母抽提物，1%的浓缩番茄汁，无菌水76%。

上述冻干保护剂由以下重量百分比计的组分混合制成：3%的甘油，0.1%的维生素C，1%的小牛血清（市售），3%的甘露醇，1%的蔗糖，0.1%的明胶（市售），10%的海藻多糖（市售），无菌水81.8%。

三、混合

将嗜热链球菌菌粉与德式乳杆菌保加利亚亚种菌粉按照1.5:1的重量比混合均匀，充氮气包装后得产品。

本发明中原料脱脂乳酶解物的制备方法为：将质量浓度10%的脱脂乳水溶液加热到55℃，加入复合酶制剂，复合酶制剂由蛋白酶、脂肪酶及乳糖酶组成，蛋白酶：脂肪酶：乳糖酶的重量比=3:3:1，复合酶制剂添加量为脱脂乳水溶液重量的0.01%，100rpm/min转速的搅拌条件下，保温酶解3h，过200目筛网，得到的滤液即为脱脂乳酶解物。

实施例2：

一、嗜热链球菌菌粉制备

（1）配制嗜热链球菌培养基，嗜热链球菌培养基的配方由以下重量百分比计的组分组成：乳糖9%，脱脂乳酶解物1%，浓缩番茄汁5%，水溶性小麦蛋白3%，酵母抽提物0.1%，无菌水81.9%。将嗜热链球菌接种于嗜热链球菌培养基中进行高密度发酵培养，接种量为0.3wt%，嗜热链球菌发酵培养过程中：pH维持在6.6-7.0之间，培养温度设定为44.5℃，发酵时间设定为4小时，在发酵培养过程中采用10%的氨水进行发酵pH控制。

（2）发酵培养结束后，对所得发酵液进行离心，离心力控制在10000g，离心时间10分钟，随后将离心得到的菌泥在无菌条件下复溶于1%的NaCl溶液中，再进行二次离心，二次离心力控制在8000g，离心时间10分钟，随后将得到的二次离心菌泥与冻干保护剂按照1: 2的重量比混合均匀。

（3）将二次离心菌泥与冻干保护剂混合物在0.5Mpa的输送压力下，经过喷嘴垂直喷射入液氮中形成固态颗粒，过滤收集固态颗粒获得液氮造粒半成品，喷嘴与液氮液面的垂直距离为50cm，喷嘴孔径为5mm。

（4）液氮造粒半成品在-40℃下真空冷冻干燥72小时得到嗜热链球菌菌粉。

嗜热链球菌发酵培养过程中采用补料工艺，所述补料工艺为在嗜热链球菌接种后的第4小时，补加占嗜热链球菌培养基15%体积的嗜热链球菌补料培养基，嗜热链球菌补料培养基的配方由以下重量百分比计的组分组成：15%的乳糖，0.1%的酵母抽提物，0.1%的蛋白胨，无菌水84.8%。

二、德式乳杆菌保加利亚亚种菌粉制备

（a）配制德式乳杆菌保加利亚亚种培养基，德式乳杆菌保加利亚亚种培养基的配方由以下重量百分比计的组分组成：乳糖9%，脱脂乳酶解物1%，浓缩番茄汁5%，酵母抽提物0.1%， K₂HPO₄·3H₂O 3%，Tween 6%，甲酸钠0.1%，无菌水75.8%。将德式乳杆菌保加利亚亚种接种于德式乳杆菌保加利亚亚种培养基中进行高密度发酵培养，接种量为0.3wt%，德式乳杆菌保加利亚亚种发酵培养过程中：pH维持在5.1-5.6之间，培养温度设定为42.5℃，发酵时间设定为6小时，在发酵培养过程中采用10%的氨水进行发酵pH控制。

（b）发酵培养结束后，对所得发酵液进行离心，离心力控制在10000g，离心时间10分钟，随后将离心得到的菌泥在无菌条件下复溶于1%的NaCl溶液中，再进行二次离心，二次离心力控制在8000g，离心时间10分钟，随后将得到的二次离心菌泥与冻干保护剂按照1: 2的重量比混合均匀。

（c）将二次离心菌泥与冻干保护剂混合物在0.5Mpa的输送压力下，经过喷嘴垂直喷射入液氮中形成固态颗粒，过滤收集固态颗粒获得液氮造粒半成品，喷嘴与液氮液面的垂直距离为50cm，喷嘴孔径为5mm。

（d）液氮造粒半成品在-40℃下真空冷冻干燥72小时得到德式乳杆菌保加利亚亚种菌粉。

德式乳杆菌保加利亚亚种发酵培养过程中采用补料工艺，所述补料工艺为在德式乳杆菌保加利亚亚种接种后的第4小时，补加德式乳杆菌保加利亚亚种培养基15%体积的德式乳杆菌保加利亚亚种补料培养基，德式乳杆菌保加利亚亚种补料培养基的配方由以下重量百分比计的组分组成： 15%的乳糖，1%的脱脂乳酶解物，0.1%的酵母抽提物， 5%的浓缩番茄汁，无菌水78.9%。

上述冻干保护剂由以下重量百分比计的组分混合制成：10%的甘油， 1%的维生素C， 3%的小牛血清（市售），0.1%的甘露醇， 5%的蔗糖， 0.5%的明胶（市售），1%的海藻多糖（市售），无菌水79.4%。

三、混合

将嗜热链球菌菌粉与德式乳杆菌保加利亚亚种菌粉按照2:1的重量比混合均匀，充氮气包装后得产品。

本发明中原料脱脂乳酶解物的制备方法为：将质量浓度20%的脱脂乳水溶液加热到60℃，加入复合酶制剂，复合酶制剂由蛋白酶、脂肪酶及乳糖酶组成，蛋白酶：脂肪酶：乳糖酶的重量比=2:2:1，复合酶制剂添加量为脱脂乳水溶液重量的0.1%，150rpm/min转速的搅拌条件下，保温酶解1h，过300目筛网，得到的滤液即为脱脂乳酶解物。

实施例3：

一、嗜热链球菌菌粉制备

（1）配制嗜热链球菌培养基，嗜热链球菌培养基的配方由以下重量百分比计的组分组成：乳糖3%，脱脂乳酶解物5%，浓缩番茄汁3%，水溶性小麦蛋白2%，酵母抽提物1%，无菌水86%。将嗜热链球菌接种于嗜热链球菌培养基中进行高密度发酵培养，接种量为0.2wt%，嗜热链球菌发酵培养过程中：pH维持在6.6-7.0之间，培养温度设定为40℃，发酵时间设定为4.5小时，在发酵培养过程中采用8%的氨水进行发酵pH控制。

（2）发酵培养结束后，对所得发酵液进行离心，离心力控制在8000g，离心时间20分钟，随后将离心得到的菌泥在无菌条件下复溶于0.9%（质量浓度）的NaCl溶液中，再进行二次离心，二次离心力控制在7000g，离心时间20分钟，随后将得到的二次离心菌泥与冻干保护剂按照1:1的重量比混合均匀。

（3）将二次离心菌泥与冻干保护剂混合物在0.2Mpa的输送压力下，经过喷嘴垂直喷射入液氮中形成固态颗粒，过滤收集固态颗粒获得液氮造粒半成品，喷嘴与液氮液面的垂直距离为30cm，喷嘴孔径为1mm。

（4）液氮造粒半成品在-40℃下真空冷冻干燥48小时得到嗜热链球菌菌粉。

嗜热链球菌发酵培养过程中采用补料工艺，所述补料工艺为在嗜热链球菌接种后的第3小时，补加占嗜热链球菌培养基10%体积的嗜热链球菌补料培养基，嗜热链球菌补料培养基的配方由以下重量百分比计的组分组成：12%的乳糖，1%的酵母抽提物，2%的蛋白胨，无菌水85%。

二、德式乳杆菌保加利亚亚种菌粉制备

（a）配制德式乳杆菌保加利亚亚种培养基，德式乳杆菌保加利亚亚种培养基的配方由以下重量百分比计的组分组成：乳糖3%，脱脂乳酶解物5%，浓缩番茄汁3%，酵母抽提物1%， K₂HPO₄·3H₂O 1%，Tween （市售）1%，甲酸钠0.05%，无菌水85.95%。将德式乳杆菌保加利亚亚种接种于德式乳杆菌保加利亚亚种培养基中进行高密度发酵培养，接种量为0.2wt%，德式乳杆菌保加利亚亚种发酵培养过程中：pH维持在5.1-5.6之间，培养温度设定为40℃，发酵时间设定为7小时，在发酵培养过程中采用8%的氨水进行发酵pH控制。

（b）发酵培养结束后，对所得发酵液进行离心，离心力控制在8000g，离心时间20分钟，随后将离心得到的菌泥在无菌条件下复溶于0.9%的NaCl溶液中，再进行二次离心，二次离心力控制在7000g，离心时间20分钟，随后将得到的二次离心菌泥与冻干保护剂按照1:1的重量比混合均匀。

（c）将二次离心菌泥与冻干保护剂混合物在0.2Mpa的输送压力下，经过喷嘴垂直喷射入液氮中形成固态颗粒，过滤收集固态颗粒获得液氮造粒半成品，喷嘴与液氮液面的垂直距离为30cm，喷嘴孔径为1mm。

（d）液氮造粒半成品在-40℃下真空冷冻干燥48小时得到德式乳杆菌保加利亚亚种菌粉。

德式乳杆菌保加利亚亚种发酵培养过程中采用补料工艺，所述补料工艺为在德式乳杆菌保加利亚亚种接种后的第3小时，补加德式乳杆菌保加利亚亚种培养基10%体积的德式乳杆菌保加利亚亚种补料培养基，德式乳杆菌保加利亚亚种补料培养基的配方由以下重量百分比计的组分组成：12%的乳糖，5%的脱脂乳酶解物，1%的酵母抽提物，3%的浓缩番茄汁，无菌水79%。

上述冻干保护剂由以下重量百分比计的组分混合制成：5%的甘油，0.5%的维生素C，2%的小牛血清（市售），1%的甘露醇，2%的蔗糖，0.3%的明胶（市售），4%的海藻多糖（市售），无菌水85.2%。

三、混合

本发明中原料脱脂乳酶解物的制备方法为：将质量浓度15%的脱脂乳水溶液加热到60℃，加入复合酶制剂，复合酶制剂由蛋白酶、脂肪酶及乳糖酶组成，蛋白酶：脂肪酶：乳糖酶的重量比=3:2:1，复合酶制剂添加量为脱脂乳水溶液重量的0.05%，120rpm/min转速的搅拌条件下，保温酶解2h，过200目筛网，得到的滤液即为脱脂乳酶解物。

采用本发明方法生产的发酵剂，其中含乳酸菌活菌数可达1.1-6.1×10¹¹CFU/g，使用量仅为0.0001-0.0006%的即可达到发酵乳基本要求，发酵过程中，菌种活力强，完全可满足生产所需。

采用本发明方法制成的产品按照0.0001-0.0006%的量接种到灭菌处理的复原乳或鲜牛奶中，经4-5小时发酵，形成凝乳，发酵乳pH约为4.3-4.6左右，酸度维持87-95°T，并且发酵乳基本无乳清析出，风味良好，即可作为优良的直投式发酵乳发酵剂进行使用。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims

1.一种直投式乳酸菌发酵乳用发酵剂的制作方法，其特征在于，包括如下步骤：

一、嗜热链球菌菌粉制备

二、德式乳杆菌保加利亚亚种菌粉制备

三、混合

2.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于：所述嗜热链球菌培养基的配方由以下重量百分比计的组分组成：乳糖1-9%，脱脂乳酶解物1-10%，浓缩番茄汁1-5%，水溶性小麦蛋白1-3%，酵母抽提物0.1-2%，余量为无菌水。

3.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于：所述德式乳杆菌保加利亚亚种培养基的配方由以下重量百分比计的组分组成：乳糖1-9%，脱脂乳酶解物1-10%，浓缩番茄汁1-5%，酵母抽提物0.1-2%， K₂HPO₄·3H₂O 0.1-3%，Tween 0.01-6%，甲酸钠0.01-0.1%，余量为无菌水。

4.根据权利要求1或2或3所述的制作方法，其特征在于：所述冻干保护剂由以下重量百分比计的组分混合制成：3-10%的甘油，0.1-1%的维生素C，1-3%的小牛血清，0.1-3%的甘露醇，1-5%的蔗糖，0.1-0.5%的明胶，1-10%的海藻多糖，余量为无菌水。

5.根据权利要求1或2或3所述的制作方法，其特征在于：步骤（3）及步骤（c）中喷嘴与液氮液面的垂直距离为20-50cm，喷嘴孔径为0.1-5mm。

6.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于：嗜热链球菌发酵培养过程中采用补料工艺，所述补料工艺为在嗜热链球菌接种后的第2-4小时，补加占嗜热链球菌培养基5-15%体积的嗜热链球菌补料培养基，嗜热链球菌补料培养基的配方由以下重量百分比计的组分组成：10-15%的乳糖，0.1-3%的酵母抽提物，0.1-5%的蛋白胨，余量为无菌水。

7.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于：德式乳杆菌保加利亚亚种发酵培养过程中采用补料工艺，所述补料工艺为在德式乳杆菌保加利亚亚种接种后的第2-4小时，补加德式乳杆菌保加利亚亚种培养基5-15%体积的德式乳杆菌保加利亚亚种补料培养基，德式乳杆菌保加利亚亚种补料培养基的配方由以下重量百分比计的组分组成：10-15%的乳糖，1-10%的脱脂乳酶解物，0.1-3%的酵母抽提物，1-5%的浓缩番茄汁，余量为无菌水。

8.根据权利要求2或3或6或7所述的制作方法，其特征在于：所述脱脂乳酶解物的制备方法为：将质量浓度10-20%的脱脂乳水溶液加热到55-60℃，加入复合酶制剂，复合酶制剂添加量为脱脂乳水溶液重量的0.01-0.1%，100-150rpm/min转速的搅拌条件下，保温酶解1-3h，过200-300目筛网，得到的滤液即为脱脂乳酶解物。

9.根据权利要求8所述的制作方法，其特征在于：所述复合酶制剂由蛋白酶、脂肪酶及乳糖酶组成，蛋白酶：脂肪酶：乳糖酶的重量比=2-3:2-3:1。