CN112592854B - 高密度保加利亚乳杆菌的发酵培养基及发酵方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体公开了一种高密度保加利亚乳杆菌的发酵培养基及发酵方法和应用，发酵培养基包括以下重量份数的组分：胰蛋白胨5‑10份；大豆胨4‑6份；葡萄糖15‑25份；牛肉粉4‑6份；酵母浸出粉3‑5份；乳糖2.5‑10份；K2HPO4·7H2O 1‑3份；β‑甘油磷酸钠14‑16份、抗坏血酸钠0.25‑1份和甲酸0.05‑1份，所述发酵培养基的pH值为6.2‑6.8。本发明的发酵培养基中成分相互复配可以显著提高保加利亚乳杆菌的菌体增殖能力，达到了高密度发酵的菌体浓度，且降低了生产成本，提高了生产效率。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其是涉及一种高密度保加利亚乳杆菌的发酵培养基及发酵方法和应用。
背景技术
保加利亚乳杆菌属于革兰氏阳性，厌氧性菌。菌体长2μm-9μm，宽0.5μm-0.8μm，单个体呈长杆状或成链，两端钝圆，不具运动性，也不会产生孢子。保加利亚乳杆菌是乳酸菌类的益生菌，也是人体肠道中的重要微生物；由于保加利亚乳杆菌具有调节胃肠道健康、促进消化吸收、增加免疫功能、抗癌抗肿瘤等重要的生理功能，因此被规定为可用于保健食品的益生菌菌种之一，在食品发酵、工业乳酸发酵、饲料行业和医疗保健领域均有广泛的应用。
保加利亚乳杆菌可以和嗜热链球菌共同应用于发酵乳制品中，如乳酪、干酪、酸奶、植物基发酵乳等；这些可以用于乳制品发酵的菌种称为发酵剂。在发酵剂直投并发酵食品的过程中，菌剂的活菌密度对于发酵效果至为重要，因此菌种的高密度发酵获得高浓度菌种尤为关键。
目前市售菌剂均为混菌菌剂，菌剂的配比对于直投菌发酵也非常重要。我国较国外菌剂制造商生产菌剂的保加利亚乳杆菌浓度较低(如丹麦Hasen、美国Marshell公司、荷兰Nizo研究所等)，用量大，对于菌种直投有很大弊端。传统的静置发酵法得到的发酵液中菌体的发酵密度较低，为了得到更多的活菌数，就需要增加生物反应器的体积或增加发酵次数等，从而增加生物量的分离费用，延长生产周期，从而提高生产成本，降低生产效率。
因此，亟需一种高密度保加利亚乳杆菌的发酵培养基及发酵方法和应用。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种高密度保加利亚乳杆菌的发酵培养基及发酵方法和应用，本发明的发酵培养基中成分相互复配可以显著提高保加利亚乳杆菌的菌体增殖能力，达到了高密度发酵的菌体浓度，且降低了生产成本，提高了生产效率。
本发明的第一目的是提供了一种高密度保加利亚乳杆菌的发酵培养基，本发明采取的技术方案为：所述发酵培养基包括以下重量份数的组分：
胰蛋白胨5-10份；大豆胨4-6份；葡萄糖15-25份；牛肉粉4-6份；酵母浸出粉3-5份；乳糖2.5-10份；K2HPO4·7H2O 1-3份；β-甘油磷酸钠14-16份、抗坏血酸钠0.25-1份和甲酸0.05-1份，所述发酵培养基的pH值为6.2-6.8。
在本发明的发酵培养基中，乳糖的最佳添加量为2.5-10份，抗坏血酸钠的最佳添加量为0.25-1份，甲酸的最佳添加量为0.05-1份，发酵培养基中乳糖、抗坏血酸钠和甲酸的添加会促进保加利亚乳杆菌的菌体增殖，保加利亚乳杆菌活菌数可达2.94×1010CFU/mL，达到了高密度发酵的菌体浓度。胰蛋白胨、大豆胨、牛肉粉和酵母浸出粉作为氮源，葡萄糖提供碳源，在发酵培养基中添加K2HPO4·7H2O，可以调节培养基体系的pH值，有利于菌种的发酵；在发酵培养基中添加β-甘油磷酸钠，β-甘油磷酸钠具有一定的缓冲作用，也可作为碳源。
作为本发明所述发酵培养基的优选实施方式，所述发酵培养基还包括以下重量份数的组分：
吐温0.75-1.25份；Mg2+水溶性化合物0.2-0.3份；醋酸钠·3H2O 4-6份；柠檬酸三铵1-3份和Mn2+水溶性化合物0.04-0.06份。
在发酵培养基中加入吐温作为表面活性剂，可以降低液体表面张力，促进溶氧，利于菌种发酵；在发酵培养基中添加Mg2+水溶性化合物和Mn2+水溶性化合物，促进胞内能量物质ATP的合成，有利于菌体生长和酶的合成。
添加醋酸钠·3H2O、柠檬酸三铵可以改善发酵培养基缓冲体系，使得发酵培养基的pH值维持在6.2-6.8。
作为本发明所述发酵培养基的优选实施方式，所述发酵培养基包括以下重量份数的组分：
胰蛋白胨5-10份；大豆胨4-5份；葡萄糖15-20份；牛肉粉4-5份；酵母浸出粉3-4份；乳糖2.5-7.5份；K2HPO4·7H2O 1-2份；β-甘油磷酸钠15-16份；抗坏血酸钠0.25-0.75份；甲酸0.05-0.25份；吐温0.75-1份；Mg2+水溶性化合物0.2-0.25份；醋酸钠·3H2O 4-5份；柠檬酸三铵1-2份和Mn2+水溶性化合物0.04-0.05份，所述发酵培养基的pH值为6.2-6.8。
在本发明的技术方案中，对发酵培养基进行进一步的筛选，得到更为优选的配方组合，显著提高了保加利亚乳杆菌的菌体增殖能力，得到的保加利亚乳杆菌菌体增殖活菌数较多。
作为本发明所述发酵培养基的优选实施方式，所述发酵培养基包括以下重量份数的组分：
胰蛋白胨5份；大豆胨5份；葡萄糖20份；牛肉粉5份；酵母浸出粉3份；乳糖5份；K2HPO4·7H2O 2份；β-甘油磷酸钠15份；抗坏血酸钠0.5份；甲酸0.05份；吐温1份；Mg2+水溶性化合物0.25份；醋酸钠·3H2O 5份；柠檬酸三铵2份和Mn2+水溶性化合物0.05份，所述发酵培养基的pH值为6.8。
在本发明的技术方案中，本发明人通过大量的实验验证，终于筛选得到一组最优的组合，使得保加利亚乳杆菌菌体活菌数可达到2.94×1010CFU/mL，达到了高密度发酵的菌体浓度。
作为本发明所述发酵培养基的优选实施方式，所述Mg2+水溶性化合物包括MgSO4·7H2O；所述Mn2+水溶性化合物包括MnSO4·4H2O。
本发明人选择MgSO4·7H2O和MnSO4·4H2O，可以进一步促进胞内能量物质ATP的合成，更有利于菌体生长和酶的合成，使得保加利亚乳杆菌菌体活菌数更多。
本发明的第二目的是提供了一种高密度保加利亚乳杆菌的发酵培养基的发酵方法，包括以下步骤：
S1.嗜热链球菌的活化和培养：取冻存的嗜热链球菌，平板活化后挑选单菌接种于如上述的发酵培养基中发酵培养，形成发酵液A；
S2.废液的收集：将步骤S1制备的发酵液A离心，取离心后的发酵液A的上清液灭菌，弃去1/2体积的上清液，然后补加1/2体积的如上述的发酵培养基，混合均匀形成混合物；
S3.保加利亚乳杆菌的活化和培养：取冻存的保加利亚乳杆菌，平板活化后挑选单菌发酵培养形成发酵液B；将步骤S2制备的混合物与发酵液B充分混合培养。
从经济效益和社会效益角度方面，本发明利用收获了嗜热链球菌菌体后的培养废液再次用于保加利亚乳杆菌的增殖培养，充分利用了废液中嗜热链球菌产生的多种生长促进因子，减少了环境中发酵废液的排放量，节约了保加利亚乳杆菌的发酵原料成本。
作为本发明所述发酵方法的优选实施方式，所述步骤S2中离心速度为4000-4500rpm，离心时间为10-20min。
作为本发明所述发酵方法的优选实施方式，所述步骤步骤S2中取所述发酵液A的上清液灭菌温度为115℃，灭菌时间为15min。
本发明的第三目的是提供了一种发酵培养基在制备冻干菌剂中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
S1.本发明提供了一种高密度保加利亚乳杆菌的发酵培养基，乳糖、抗坏血酸钠和甲酸的添加会促进保加利亚乳杆菌的菌体增殖，使得保加利亚乳杆菌活菌数可达2.94×1010CFU/mL，达到了高密度发酵的菌体浓度；
S2.本发明提供的发酵培养基的pH值控制在6.2-6.8，保证了保加利亚乳杆菌的菌体增殖；
S3.本发明提供了一种发酵方法，该发酵方法成本低，利用收获了嗜热链球菌菌体后的培养废液再次用于保加利亚乳杆菌的增殖培养，还充分利用了废液中嗜热链球菌产生的多种生长促进因子，减少了环境中发酵废液的排放量。
附图说明
图1为采用实施例3-7的发酵培养基对保加利亚乳杆菌菌体增殖活菌数测定的结果图；
图2为采用对比例1-6的发酵培养基对保加利亚乳杆菌菌体增殖活菌数测定的结果图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
在以下实施例和对比例中，嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌均为市售购买。
实施例1-7、一种高密度保加利亚乳杆菌的发酵培养基
本发明实施例1-7高密度保加利亚乳杆菌的发酵培养基的配方如下表1所示。
表1
实施例1-2及实施例4-7的高密度保加利亚乳杆菌的发酵培养基的制备方法，包括以下步骤：
(1)按照上述含量分别称取胰蛋白胨、大豆胨、葡萄糖、牛肉粉、酵母浸出粉、吐温80、乳糖、K2HPO4·7H2O、MgSO4·7H2O、醋酸钠·3H2O、β-甘油磷酸钠、柠檬酸三铵、抗坏血酸钠、MnSO4·4H2O各组分，用蒸馏水溶解，并定容至1L，分别调节培养基体系的pH值；
(2)将上述定容后的溶液置于121℃高压灭菌20min后，冷却后保存备用，过滤后加甲酸，制得发酵培养基。
实施例3的发酵培养基的制备方法与上述相似，区别在于，不进行过滤后加甲酸步骤。
对比例1-6、一种高密度保加利亚乳杆菌的发酵培养基
本发明对比例1-6高密度保加利亚乳杆菌的发酵培养基的配方如下表2所示。
表2
对比例1-6发酵培养基的制备方法与上述实施例1-7发酵培养基的制备方法相似。
实施例8、一种基于本发明发酵培养基的发酵方法
一种基于本发明发酵培养基的发酵方法，包括以下步骤：
S1.嗜热链球菌的活化和培养：取-80℃冻存的嗜热链球菌菌剂，接种于MRS液体培养基中，于恒温箱中37℃培养24h，用接种环蘸取少量液体，在固体MRS琼脂平板上划线培养48h，将活化好的嗜热链球菌挑选单菌接种于1mL MRS培养基，在温度为37℃条件下培养24h后，形成嗜热链球菌的一级种子液，再以1％的接种量接种于MRS培养基，在温度为37℃条件下培养24h后，形成嗜热链球菌的二级种子液；
S2.嗜热链球菌的发酵：将步骤S1制备的二级种子液按2％的接种量分别接种于上述实施例1-7及对比例1-6的发酵培养基中发酵培养，接种后在温度为37℃条件下静置培养24h，形成发酵液A；
S3.废液的收集：将步骤S2制备的发酵液A离心，离心速度为400rpm，离心时间为10min，取离心后的发酵液A的上清液在温度为115℃下灭菌15min，弃去1/2体积的上清液，然后分别补加1/2体积的如上述实施例1-7及对比例1-6的发酵培养基，混合均匀形成混合物；
S4.保加利亚乳杆菌的活化和培养：取-80℃冻存的保加利亚乳杆菌，接种于MRS液体培养基中，于恒温箱中37℃培养24h，用接种环蘸取少量液体，在固体MRS琼脂平板上划线培养48h，将活化好的保加利亚乳杆菌挑选单菌接种于1mL MRS培养基，在温度为37℃条件下培养24h后，形成保加利亚乳杆菌的一级种子液，再以1％的接种量接种于MRS培养基，在温度为37℃条件下培养24h后，形成保加利亚乳杆菌的二级种子液；
S5.保加利亚乳杆菌的发酵：将保加利亚乳杆菌的二级种子液按2％的接种量于上述实施例1-7及对比例1-6的发酵培养基中发酵培养，接种后在温度为37℃条件下静置培养24h，形成发酵液B；
S6.步骤S3制备的混合物与发酵液B充分混合培养得样品。
试验例、保加利亚乳杆菌的活菌数测定
将上述分别由实施例3-7及对比例1-6的发酵培养基所得到的样品，用无菌生理盐水进行十倍梯度稀释，稀释至10-10，分别取10-1-10-10这10个梯度的稀释液，吸取50μL，滴加于MRS平板，涂布均匀，保加利亚乳杆菌37℃厌氧培养48h后取出进行菌落计数。
其中，对照组为直接经过活化和培养的发酵液B(实施例8中的步骤S4和步骤S5)，且对照组未接种过嗜热链球菌的混合物(即不含有实施例8中的步骤S1-S3及S6)，然后采用上述方法稀释和菌落计数。
参照图1，与对照组相比，采用实施例4-7发酵培养基对保加利亚乳杆菌增殖具有促进作用，其中保加利亚乳杆菌的活菌数最多的为实施例5和实施例6，实施例5和实施例6的发酵培养基对保加利亚乳杆菌增殖效果相似，从经济角度考虑最合适的发酵培养基为实施例5的发酵培养基，其保加利亚乳杆菌的活菌数可达2.94×1010CFU/mL，达到了高密度发酵的菌体浓度。
实施例3的发酵培养基对保加利亚乳杆菌增殖促进效果远不及实施例4-7；
其中实施例1-2发酵培养基对对保加利亚乳杆菌增殖的效果与实施例3-7相似。
本发明利用了嗜热链球菌菌体的培养废液(含有实施例1-7的发酵培养基)再次用于保加利亚乳杆菌的增殖，还充分利用了废液中嗜热链球菌产生的多种生长促进因子共同发挥促进作用，减少了环境发酵废液的排放量，节约了保加利亚乳杆菌的发酵原料成本。
参照图2，与实施例5相比，对比例1-6促进保加利亚乳杆菌增殖的效果远不及实施例5，说明乳糖、抗坏血酸和甲酸的复配添加对保加利亚乳杆菌增殖有着促进效果，使得保加利亚乳杆菌活菌数较大，达到了高密度发酵的菌体浓度。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (4)
1.一种基于高密度保加利亚乳杆菌的发酵培养基的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.嗜热链球菌的活化和培养：取冻存的嗜热链球菌，平板活化后挑选单菌接种于发酵培养基中发酵培养，形成发酵液A；
S2.废液的收集：将步骤S1制备的发酵液A离心，取离心后的发酵液A的上清液灭菌，弃去1/2体积的上清液，然后补加1/2体积的发酵培养基，混合均匀形成混合物；
S3.保加利亚乳杆菌的活化和培养：取冻存的保加利亚乳杆菌，平板活化后挑选单菌发酵培养形成发酵液B；将步骤S2制备的混合物与发酵液B充分混合培养；
步骤S1和S2中的发酵培养基的配方为配方A或配方B：
配方A：5g胰蛋白胨、5g大豆胨、20g葡萄糖、5g牛肉粉、3g酵母浸出粉、1g吐温80、5g乳糖、2g K2HPO4·7H2O、0.25g MgSO4·7H2O、5g醋酸钠·3H2O、15gβ-甘油磷酸钠、2g柠檬酸三铵、0.5g抗坏血酸钠、0.05g MnSO4·4H2O和0.05g甲酸，发酵培养基的pH值为6.8；
配方B：
5g胰蛋白胨、5g大豆胨、20g葡萄糖、5g牛肉粉、3g酵母浸出粉、1g吐温80、5g乳糖、2gK2HPO4·7H2O、0.25g MgSO4·7H2O、5g醋酸钠·3H2O、15gβ-甘油磷酸钠、2g柠檬酸三铵、0.75g抗坏血酸钠、0.05g MnSO4·4H2O和0.75g甲酸，发酵培养基的pH值为6.2。
2.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述步骤S2中离心速度为4000-4500rpm，离心时间为10-20min。
3.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述步骤S2中取所述发酵液A的上清液灭菌温度为115℃，灭菌时间为15min。
4.一种如权利要求1所述的发酵方法中的发酵培养基在制备冻干菌剂中的应用。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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