CN103540545A

CN103540545A - 一种戊糖片球菌及其应用

Info

Publication number: CN103540545A
Application number: CN201310449033.XA
Authority: CN
Inventors: 李兰娟; 吕龙贤; 胡新俊; 钱贵荣
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2013-09-28
Filing date: 2013-09-28
Publication date: 2014-01-29
Anticipated expiration: 2033-09-28
Also published as: CN103540545B

Abstract

本发明公开了一株戊糖片球菌及其应用。所述戊糖片球菌拉丁名为PediococcuspentosaceusLI05，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.7049。本发明公开了该菌的形态学特征为：菌体杆状，不产孢子，无运动性，革兰氏染色呈阳性。本发明公开了该菌的全细胞脂肪酸主要成份为：14:0约1.45%，16:1w7c/16:1w6c约3.26%，16:0约31.25%，18:1w9c约6.31%，18:1w7c约38.59%，18:0约1.37%，un18.846/19:1w6c约14.59%。本发明还公开了该菌的16S核糖体DNA(16SrDNA)全序列。本发明公开的戊糖片球菌及其制剂可用于调节人或动物肠道微生态平衡,促进消化吸收，减缓实验动物肝衰竭的发生发展。

Description

一种戊糖片球菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，涉及一种戊糖片球菌及其应用。

背景技术

人体肠道内定植着数目庞大（10¹⁴）、结构复杂（超过1000 种细菌）的微生物群落（约1.5公斤）。肠道菌群和宿主共生并共进化过程中，在调节宿主的消化吸收、免疫反应、代谢等方面发挥重要作用，已作为人体最重要的微生态系统日益受到重视。越来越多的研究结果表明，肠道微生态在多种疾病发病机制中发挥重要作用，如新生儿坏死性结肠炎、哮喘、湿疹、炎症性肠病、肥胖症、动脉粥样硬化、胰岛素抗药性和肿瘤等。

乳酸菌是发酵糖类且主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏阳性细菌的总称，广泛分布于自然界包括植物、土壤、发酵食品等之中。乳酸菌是人体中一类重要的有益菌，主要存在于肠道、泌尿生殖道和口腔等，对于维持所在系统的微生态平衡具有重要的作用，主要包括：促进蛋白质、单糖及钙、镁等营养物质的吸收，防治乳糖不耐症，产生维生素B族等大量有益物质；吸附在黏膜层，占位形成抗菌生物屏障，防止有害菌与黏膜直接作用；分泌抗菌素、乳酸等酸性物质甚至过氧化氢等化合物，保持泌尿生殖系统等特殊环境的pH值，抑制腐败菌的繁殖，防止感染；控制革兰氏阴性菌数量，降低人体内毒素水平，保护肝脏并增强肝脏的解毒、排毒功能；促进免疫系统的发育成熟，调节机体免疫，增强宿主的抵抗力；部分乳酸菌还有抑制胆固醇吸收，降血脂、降血压作用，抗肿瘤、预防癌症，抗衰老、延年益寿等作用。乳酸菌可用于制造酸奶、乳酪、酸菜、啤酒、葡萄酒、泡菜、腌渍食品和其他发酵食品。同时乳酸菌，也用于防治胃肠道疾病、阴道感染等。不同乳酸菌甚至同一种乳酸菌的不同菌株，对环境的耐受能力，抗菌、黏附、降胆固醇、免疫调节等生物活性差异巨大，筛选具有良好特性的乳酸菌一直是国内外研发的重点。目前，应用于药物或食品的乳酸菌主要包括：鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌、副干酪乳杆菌和唾液乳杆菌的某些菌株。

戊糖片球菌是革兰氏阳性、无运动性、不产孢子的球形细菌。因其代谢最终产物是乳酸，被归为“乳酸菌”。戊糖片球菌与食品工业密切相关，其重要性之一是作为肉类的发酵剂，同时在蔬菜和奶酪等奶制品中出现。戊糖片球菌能通过产乳酸和抗菌物提高发酵产品的质量、延长保质期。戊糖片球菌也可作为营养增强剂加入饲料。目前，戊糖片球菌主要用于食品发酵且现在使用的菌种主要来源于食品，人或动物肠道来源的菌种鲜有报道，从而限制了该菌的在动物和人体健康领域的应用。因此，根据目前要求，发现人或动物源的戊糖片球菌、研制开发一种戊糖片球菌制剂，具有广阔发展前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus LI05及其应用。

本发明所提供的戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus LI05，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2012年12月26日，保藏号为CGMCC No.7049，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码100101。

本发明所提供的戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus LI05形态学特征为：菌体球状，不产孢子，无运动性，革兰氏染色呈阳性，在营养琼脂培养基上形成白色菌落。

本发明所提供的戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus LI05理化特征如下：能发酵葡萄糖，核糖，阿拉伯糖，半乳糖和果糖产酸。

本发明所提供的戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus LI05的16S核糖体DNA(16S rDNA)全序列为SEQ ID NO：1所示。

本发明所提供的戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus LI05的全细胞水解脂肪酸含量为：

脂肪酸种类	含量（％）
		14:0	1.45
16:0 iso	0.11
		16:1 w7c/16:1 w6c	3.26
16:1 w5c	0.47
		16:0	31.25
17:0 anteiso	0.37
		17:1 w8c	0.33
17:0	0.24
		18:1 w9c	6.31
18:1 w7c	38.59
		18:1 w5c	0.36
18:0	1.37
		19:0 iso	0.34
un 18.846/19:1 w6c	14.59
		20:1 w9c	0.52
20:1 w7c	0.44

本发明所提供的戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus LI05具有以下生物学特性：

1）在浓度为2%的胆盐中生长不受影响。

2）在pH3.0处理4小时后，生长速率达普通培养基中的70%以上。

3）能够明显抑制志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯菌等细菌生长。

4）在半乳糖胺诱导的肝损伤动物模型中，能够显著降低肝损伤程度，改善肝功能，降低细菌易位。

本发明所提供的戊糖片球菌制剂，它的活性成分含有所述的戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus LI05。

本发明所述的戊糖片球菌及戊糖片球菌制剂具有下述至少一种用途：

1）制备人或动物的微生态调节剂；

2）制备增强人或动物的非特异性免疫产品；

3）制备人或动物肝功能调节、肝病预防治疗的产品；

4）制备人或动物肥胖相关疾病防控的产品；

5）制备防治人或动物感染发病率的产品。

经与其他菌种和制剂比较、反复试验验证，本发明的优点是：

1）所述戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus LI05，具有良好的耐酸和耐胆盐性能，能够在活性损失较小的情况下，到达胃肠道。

2）所述的戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus LI05和戊糖片球菌制剂具有较广泛的抗菌谱，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、志贺氏菌、肺炎链球菌等都具有良好的抑制效果。

3）所述的戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus LI05和戊糖片球菌制剂在半乳糖胺诱导的肝损伤动物模型中，能够显著降低肝损伤程度，改善肝功能，降低细菌易位。

4）所提供的戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus LI05来源于健康人体肠道，戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus LI05和戊糖片球菌制剂安全性高。

具体实施方式

下述实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中，所用的试剂、材料、仪器设备等，均可从商业途径获得。

本发明的戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus LI05，可先接种于适合戊糖片球菌生长的固体培养基中进行厌氧培养，得到种子后再接种于戊糖片球菌液体培养基中进行培养。

所述的适合戊糖片球菌生长的固体培养基，可为现有技术任何适合戊糖片球菌培养的培养基，这为本领域技术人员所知晓，具体可为：蛋白胨1～10克,牛肉膏 1～10克,酵母提取物1～5克,麦芽汁提取物1～10克，葡萄糖1～10克,吐温80 0.5～1克,磷酸氢二钾1～2克,三水乙酸钠2～5克,柠檬酸二铵1～2克,七水硫酸镁0.2～0.5克, 四水硫酸锰 0.03～0.07克，pH6.0～7.0，琼脂10～30克，蒸馏水 900～1000毫升。

所述的适合戊糖片球菌生长的液体培养基，可为现有技术任何适合戊糖片球菌培养的液体培养基，这为本领域技术人员所知晓，具体可为：蛋白胨1～10克,酵母提取物1～5克,麦芽汁提取物1～10克，葡萄糖1～10克,吐温80 0.5～1克,磷酸氢二钾1～2克,三水乙酸钠2～5克,柠檬酸二铵1～2克,七水硫酸镁0.2～0.5克, 四水硫酸锰 0.03～0.07克，pH6.0～7.0，蒸馏水 900～1000毫升。

所述的适合戊糖片球菌培养条件，可为现有技术任何适合戊糖片球菌培养的条件，具体可为35～37⁰C，厌氧培养12～72小时。

实施例1.戊糖片球菌的分离纯化

1）取0.5克来自不同健康人的新鲜粪便样本，分别加入到10毫升戊糖片球菌液体培养基，混合均匀后，用上述液体培养基稀释10000倍。所述戊糖片球菌液体培养基的成份为：蛋白胨5克,酵母提取物3克,麦芽汁提取物5克，葡萄糖5克,吐温80 1.0克,磷酸氢二钾1.5克,三水乙酸钠2.0克,柠檬酸二铵1.0克,七水硫酸镁0.2克, 四水硫酸锰 0.05克，pH6.2，蒸馏水 960毫升。

2）取100微升上述稀释液，涂布到戊糖片球菌固体培养基平板上，在37⁰C、厌氧条件下，培养72小时。所述戊糖片球菌固体培养基的成份为：蛋白胨5克,牛肉膏 3克,酵母提取物3克,麦芽汁提取物2克，葡萄糖5克,吐温80 0.8克,磷酸氢二钾1.0克,三水乙酸钠2.0克,柠檬酸二铵1.5克,七水硫酸镁0.2克, 四水硫酸锰 0.05克，pH6.4，琼脂15.0克，蒸馏水 960毫升。

3）在生物安全柜内，用接种针挑取乳白色不同的克隆，接种到上述戊糖片球菌液体培养基中，在37⁰C、厌氧条件下，培养72小时。

4）提取基因组，利用PCR扩增16S rDNA，测序并比对，发现并保存戊糖片球菌菌株。

实施例2.耐酸戊糖片球菌筛选

制备pH2.0，2.5，3.0，4.0，5.0，6.4的戊糖片球菌培养基，按照1%接种已经培养18h的戊糖片球菌，在37⁰C、厌氧条件下，培养0，1，2，3h，24h，稀释适当比例后涂平板，培养24 计数，计算比较不同pH条件下戊糖片球菌的生长情况。结果发现戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus LI05等具有良好的耐酸性能，可在pH4.0下生长。

实施例3.耐胆盐的戊糖片球菌筛选

制备含有0.5%，1.0%，1.5%，2.0%的戊糖片球菌培养基，接种已经培养18h的戊糖片球菌菌液，接种量为1%，于在37⁰C、厌氧条件下培养24h。观察培养基的浑浊情况；同时取不同浓度胆盐培养物，稀释适当比例，涂平板计数。结果发现戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus LI05具有良好的抗胆盐的性能，2%的胆盐中对其生长速度几乎没有影响。

实施例4.可抗致病菌的戊糖片球菌筛选

1）挑取大肠杆菌等菌株的单克隆，接到5ml的培养基（胰蛋白胨10克/升,酵母提取物5克/升，NaCl 10克/升），在37℃ 200rpm条件下培养18小时左右。

2）用微量移液器取培养18h的戊糖片球菌2.5ul，滴在戊糖片球菌固体培养基上，于在37⁰C、厌氧条件下培养18h。所述戊糖片球菌固体培养基为：蛋白胨5克,牛肉膏 3克,酵母提取物3克,麦芽汁提取物2克，葡萄糖5克,吐温80 0.8克,磷酸氢二钾1.0克,三水乙酸钠2.0克,柠檬酸二铵1.5克,七水硫酸镁0.2克, 四水硫酸锰 0.05克，pH6.4，琼脂15.0克，蒸馏水 960毫升。

3）配制含0.7%琼脂的戊糖片球菌固体培养基，115℃灭菌后，冷却到45-50度；每100毫升 0.7%琼脂的戊糖片球菌固体培养基加20ul大肠杆菌等种子液；混匀后按照每块板7ml的倒在2%的上述滴有戊糖片球菌的培养平板上；冷却后，于37⁰C、厌氧条件下培养24h、48h，观察抑菌圈的大小。所述0.7%琼脂的戊糖片球菌固体培养基为：蛋白胨5克,牛肉膏 3克,酵母提取物3克,麦芽汁提取物2克，葡萄糖5克,吐温80 0.8克,磷酸氢二钾1.0克,三水乙酸钠2.0克,柠檬酸二铵1.5克,七水硫酸镁0.2克, 四水硫酸锰 0.05克，pH6.4，琼脂7.0克，蒸馏水 960毫升。

结果发现戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus LI05具有良好的抗大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌和肺炎克雷伯菌性能。

实施例5. 预防肝衰的戊糖片球菌筛选

1）取培养24h的戊糖片球菌，离心取菌体，用生理盐水洗涤3次并稀释到10¹⁹个/毫升左右；

2）取200～250g的SPF大鼠，按照每天每只1x10⁹至3x10⁹个戊糖片球菌的量连续灌胃7天；

3）腹腔注射D-半乳糖胺，构建肝损伤模型；

4）24h后取材，检测肝病理、肝功能、细菌易位、免疫等。

结果发现：戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus LI05能够显著降低D-半乳糖胺造成的肝损伤、改善肝功能、降低细菌移位、调节免疫。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。

本发明可用其他的不违背本发明的精神和主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江大学

<120> 一种戊糖片球菌及其应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1433

<212> DNA

<213> Pediococcus pentosaceus

<400> 1

ctcctaaagg ttaccccacc ggctttgggt gttacaaact ctcatggtgt gacgggcggt 60

gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgc ggcatgctga tccgcgatta ctagcgattc 120

cgacttcgtg taggcgagtt gcagcctaca gtccgaactg agaatggttt taagagatta 180

gcttaacctc gcggtctcgc gactcgttgt accatccatt gtagcacgtg tgtagcccag 240

gtcataaggg gcatgatgat ttgacgtcgt ccccaccttc ctccggtttg tcaccggcag 300

tctcactaga gtgcccaact taatgctggc aactagtaat aagggttgcg ctcgttgcgg 360

gacttaaccc aacatctcac gacacgagct gacgacaacc atgcaccacc tgtcattctg 420

tccccgaagg gaacctctaa tctcttagac tgtcagaaga tgtcaagacc tggtaaggtt 480

cttcgcgtag cttcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc ccgtcaattc 540

ttttgagttt caaccttgcg gtcgtactcc ccaggcggat tacttaatgc gttagctgca 600

gcactgaagg gcggaaaccc tccaacactt agtaatcatc gtttacggca tggactacca 660

gggtatctaa tcctgttcgc tacccatgct ttcgagcctc agcgtcagtt gcagaccaga 720

cagccgcctt cgccactggt gttcttccat atatctacgc atttcaccgc tacacatgga 780

gttccactgt cctcttctgc actcaagtct cccagtttcc aatgcacttc ttcggttgag 840

ccgaaggctt tcacattaga cttaaaagac cgcctgcgct cgctttacgc ccaataaatc 900

cggataacgc ttgccaccta cgtattaccg cggctgctgg cacgtagtta gccgtggctt 960

tctggttaaa taccgtcact gggtaaacag ttactcttac ccacgttctt ctttaacaac 1020

agagctttac gagccgaaac ccttcttcac tcacgcggcg ttgctccatc agacttgcgt 1080

ccattgtgga agattcccta ctgctgcctc ccgtaggagt ctgggccgtg tctcagtccc 1140

aatgtggccg attaccctct caggtcggct acgtatcact gccttggtga gcctttacct 1200

caccaactag ctaatacgcc gcgggtccat ccagaagtga tagcagagcc atcttttaaa 1260

agaaaaccat gcggttttct ctgttatacg gtattagcat ctgtttccag gtgttatccc 1320

ctacttctgg gcaggttacc cacgtgttac tcacccgttc gccactcact tcgtgttaaa 1380

atctcaatca gtacaagtac gtcataatca attaacggaa gttcgtcgac tgc 1433

Claims

1.一种戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus LI05，能发酵葡萄糖、核糖、阿拉伯糖、半乳糖和果糖产酸；

1）在浓度为2%的胆盐中生长不受影响，

2）在pH3.0处理4小时后，生长速率达普通培养基中的70%以上，

3）能够抑制志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯菌细菌生长；

保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.7049。

2.根据权利要求1所述的戊糖片球菌，其特征在于：所述的戊糖片球菌形态学特征为：菌体杆状，不产孢子，无运动性，革兰氏染色呈阳性，在MRS琼脂培养基上形成乳白色群落。

3.根据权利要求1所述的戊糖片球菌，其特征在于：所述戊糖片球菌的16S核糖体DNA全序列为SEQ ID NO：1所示。

4.根据权利要求1所述的戊糖片球菌，其特征在于：所述的戊糖片球菌的全细胞水解脂肪酸组成为：

Figure 201310449033X100001DEST_PATH_IMAGE001

。

5.一种戊糖片球菌制剂，其特征在于：所述制剂的活性成分含有权利要求1所述的戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus LI05。

6. 根据权利要求5所述的戊糖片球菌制剂，其特征在于：所述制剂具有下述至少一种用途：

1）制备人或动物的微生态调节剂；

2）制备增强人或动物的非特异性免疫产品；

3）制备人或动物肝功能调节、肝病预防治疗的产品；

4）制备人或动物肥胖相关疾病防控的产品；

5）制备防治人或动物感染发病率的产品。