CN101974450B - 一株肠膜明串珠菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株肠膜明串珠菌及其应用。该肠膜明串珠菌为肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)2号，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC №.3697。肠膜明串珠菌2号可以产生对多种病原菌和腐败菌具有抑制作用的细菌素，并且该细菌素具有很好的热稳定性和酸稳定性，并且对蛋白酶的敏感，抑菌谱广等优点。可以应用为具有广阔应用前景的天然食品防腐剂和饲料添加剂。
Description
技术领域
本发明涉及一株肠膜明串珠菌及其应用。
背景技术
乳酸菌细菌素(Bacteriocins of LAB)是指乳酸菌在代谢过程中通过核糖体合成的一类具有抗菌活性的多肽或蛋白质类物质。它们通常可以抑制一些常见的腐败菌和致病菌，如金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌等。而且大部分乳酸菌细菌素稳定性较好，可与食品一起加热使用，而且易被人体中的蛋白酶降解，不会在体内蓄积引起不良反应，被认为是一种具有广阔应用前景的天然食品防腐剂和饲料添加剂。
发明内容
本发明的目的是提供一株的产细菌素的肠膜明串珠菌及其应用，该菌株生产的细菌素抑制常见的G+和G-腐败菌和病原菌。
本发明提供的肠膜明串珠菌为肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)2号，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC №.3697。
上述肠膜明串珠菌是以一些最常见的G+和G-腐败菌和病原菌为指示菌，筛选出产广谱细菌素的肠膜明串珠菌菌株，已于2010年03月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院2号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC №.3697。
本发明提供的应用，即肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)2号CGMCC№.3698在抑制细菌中的应用，以及肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)2号CGMCC №.3698在生产细菌素中的应用。
上述细菌即为所述G+和G-腐败菌和病原菌，具体可为藤黄微球菌(Micrococcusluteus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、沙门氏菌(Salmonella enterica)、铜绿假单孢杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、大肠杆菌(Escherichia coli)，优选为藤黄微球菌(Micrococcus luteus)28001、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)26003、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)63501、沙门氏菌(Salmonella enterica)50094、铜绿假单孢杆菌(Pseudomonas aeruginosa)10104、大肠杆菌(Escherichia coli)30105。
本发明的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)2号可以产生对多种病原菌和腐败菌具有抑制作用的细菌素，并且该细菌素具有很好的热稳定性和酸稳定性，并且对蛋白酶的敏感，抑菌谱广等优点。可以应用为具有广阔应用前景的天然食品防腐剂和饲料添加剂。
附图说明
图1为细菌素对酶的敏感性检测结果；
图2为不同硫酸铵浓度下沉淀细菌素后，活性检测的结果；
图3为肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)2号产细菌素对藤黄微球菌生长曲线的影响
具体实施方式
实施例1、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)2号的获得
一、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)2号的获得
菌种来源：分离自青海省发酵乳制品。本发明以一些最常见的G+和G-腐败菌和病原菌为指示菌，筛选出产广谱细菌素的肠膜明串珠菌菌株，具体方法为：具体方法为：在无菌条件下，取乳制品材料5g，加入到45mL无菌蒸馏水中，充分震荡5min，以10倍系列稀释，从10-1～10-7梯度，选合适的梯度，取100μL分别涂布于含有MRS培养基的培养皿，30℃静置培养并计数。其中，含MRS培养基培养皿为厌氧培养48h，厌氧培养设备采用三菱株式化学社出品的厌氧包与厌氧培养盒。从含MRS培养基的培养皿中挑取单菌落，划线纯化2次，并进行革兰氏染色试验，镜检。利用牛津杯双层平板法：含1.5％琼脂的指示菌培养基冷却至50℃左右，按每平皿15mL倾倒在无菌培养皿中，超净工作台中冷却；制备含0.8％琼脂的指示菌培养基，冷却至50℃左右，按1％的接种量加入指示菌菌悬液作为上层培养基，倾倒5mL上层培养基于含1.5％琼脂培养基的平板中冷却，然后用无菌镊子将牛津杯轻轻放置于平板上，将无细胞发酵上清液加入牛津杯中于超净工作台上扩散5h，置于适宜的培养条件下培养24h后观察抑菌圈的出现，选取牛津杯周围有明显抑菌圈的菌株做复筛。结果获得一株广泛抑制指示菌的菌株，命名为2号。
二、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)2号的鉴定
2号菌株生理生化实验结果如表1所示；16S rRNA基因序列如序列表中序列1所示。根据细胞显微形态、生理生化数据和16S rRNA基因序列数据，将2号菌株鉴定为肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)，并于2010年03月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院2号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC №.3697。
表1、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)2号理化实验结果
| 实验项目 | 结果 | 实验项目 | 结果 |
| 革兰氏染色 | 阳性 | 碳水化合物产酸续 | |
| 细胞形态 | 杆状 | 核糖 | + |
| 形成芽孢 | - | 海藻糖 | + |
| 接触酶 | - | 木糖 | + |
| 氧化酶 | - | 鼠李糖 | - |
| 在空气中生长 | + | 麦芽糖 | + |
| 45℃生长 | - | 乳糖 | + |
| 15℃生长 | + | 棉籽糖 | - |
| 6.5％NaCl生长 | - | 山梨醇 | - |
| pH9.6生长 | - | 蜜二糖 | - |
| pH 4.5生长 | + | 半乳糖 | + |
| 从蔗糖产葡聚糖 | + | 甘露醇 | - |
| 从葡萄糖产气 | + | 阿拉伯糖 | - |
| 碳水化合物产酸 | 葡萄糖酸钠 | - | |
| 葡萄糖 | + | 蔗糖 | + |
| 甘露糖 | + | 纤维二糖 | - |
| 松三塘 | - | 七叶灵 | - |
| 果糖 | + | 苦杏仁苷 | - |
| 水杨苷 | - |
实施例2、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)2号抑菌效果鉴定
从实施例1看出本发明的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)2号对一些最常见的G+和G-腐败菌和病原菌具有抑菌性，因此推测该菌株可能分泌细菌素，通过以下方法对肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)2号的抑菌效果和其抑菌物质进行鉴定
一、排除因素干扰
1、排除酸的干扰
抑制病原菌的试验方法为牛津杯双层平板法：含1.5％琼脂的指示菌培养基NA培养基(用于藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单孢杆菌、短小芽孢杆菌、沙门氏菌的培养)：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1.0L，pH7.0～7.2。LB培养基(用于大肠杆菌的培养)：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1.0L，pH7.0。PDA培养基(用于白色念珠菌)：马铃薯浸出粉4.0g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1.0L，pH5.6。)冷却至50℃左右，按每平皿15mL倾倒在无菌培养皿中，超净工作台中冷却；制备含0.8％琼脂的指示菌培养基(同上)，冷却至50℃左右，按1％(体积百分含量)的接种量加入指示菌(表2所示)菌悬液(用接种环挑取活化的指示菌一环接种于该菌适合的培养基中，37℃静置培养24h。并调整菌液浓度为107cfu/mL，4℃冰箱保存备用)混匀作为上层培养基，倾倒5mL上层培养基于上述制备的含1.5％琼脂培养基的平板中冷却，然后用无菌镊子将牛津杯轻轻放置于平板上，将上述待测液加入牛津杯中于超净工作台上扩散5h，置于适宜的培养条件下培养24h后观察抑菌圈。
用盐酸和乳酸分别调蒸馏水和MRS液体培养基的pH值为pH3.0、4.0、5.0、6.0，为对照pH值，利用牛津杯双层平板法，对上述各种pH值的蒸馏水和MRS液体培养基做抑菌试验。用乳酸和盐酸分别调蒸馏水和MRS液体培养基的pH值，结果表明不同pH值对6种指示菌的抑菌效果不同。用乳酸和盐酸调蒸馏水pH值在3.0～6.0对指示菌都没有抑菌效果；乳酸和盐酸调MRS液体培养基在pH3.0以下都有抑菌效果，pH4.0对大肠杆菌(Escherichia coli)30105、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)28001、铜绿假单孢杆菌(Pseudomonas aeruginosa)10104都有抑菌效果，而对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)26003、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)63501和沙门氏菌(Salmonella enterica)50094没有抑菌效果，pH5.0对藤黄微球菌和铜绿假单孢杆菌抑制作用较小，对其它四种指示菌无抑制作用，而pH6.0对六种指示菌都没有抑菌效果，选择pH6.0作为对照pH。
挑取MRS培养基上培养24小时的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)2号，接种于MRS液体培养基中，30℃静置培养24h，12000rpm，4℃离心15min后，测上清液的pH值，并用1mol/L NaOH(已灭菌)和1mol/L HCl调离心发酵上清液至上述确定的对照pH值，按照上述牛津杯双层平板法做抑菌试验。所用指示菌如表2所示，所有指示菌均购于河南省食品药品检验所。
MRS液体培养基：MRS培养基可购自上海沪峰生物科技有限公司，货号为HB0384，其配方为每升由蛋白胨10g，酵母膏5g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸铵2g，乙酸钠5g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，吐温80 1mL，琼脂15g，蒸馏水1.0L组成，pH6.5。
结果如表2所示，结果表明肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)2号不仅对藤黄微球菌(Micrococcus luteus)28001、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)26003、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)63501、沙门氏菌(Salmonella enterica)50094、铜绿假单孢杆菌(Pseudomonas aeruginosa)10104、大肠杆菌(Escherichia coli)30105均有明显的抑制作用，该抑制作用不受pH的影响。
表2.排除酸抑制作用的试验结果
注：抑菌圈直径包含牛津杯外径(7.8mm)
2、过氧化氢作用的排除
乳酸菌在代谢过程中可能产生过氧化氢抑制细菌的生长，因此必须排除过氧化氢的干扰。发酵上清液用过氧化氢酶处理，以未经过氧化氢酶处理的pH6.0的无细胞发酵上清液做对照，以藤黄微球菌为指示菌进行抑菌试验，乳酸菌的发酵上清液经过氧化氢酶处理后，抑菌圈直径和对照抑菌圈直径相比，从而证明发酵液中主要抑菌物质是不是过氧化氢。方法：挑取MRS培养基上培养24小时的肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)2号，接种于MRS液体培养基中，30℃静置培养24h，12000rpm，4℃离心15min后，获得发酵上清液。过氧化氢酶溶解在50mmol/L的磷酸缓冲液(pH 7.0)中，按照过氧化氢酶终浓度为5.0mg/mL加入到上述发酵上清液，37℃水浴2h，检测过氧化氢酶处理后无细胞发酵上清液的抑菌活性，方法同步骤1的牛津杯双层平板法。结果表明过氧化氢酶不影响该菌对藤黄微球菌(Micrococcus luteus)28001的抑制作用，还有另外的抑菌物质对指示菌起抑制作用。
3、蛋白酶检测抑菌物质的蛋白质性质
先用1mol/L NaOH(已灭菌)和1mol/L HCI分别调发酵上清液到胰蛋白酶(SIGMA公司，货号：C9322)最适作用pH值8.1和蛋白酶K(MERCK公司，货号：WL558668.609)的最适作用pH值8.0，按1.0mg/mL加入胰蛋白酶和蛋白酶K，37℃水浴2h，再将pH调回对照pH值6.0，牛津杯法检测抑菌活性，并用pH6.0无细胞发酵上清液作为对照，检测胰蛋白酶和蛋白酶K对肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)2号无细胞发酵上清液抑菌活性的影响。方法同步骤1的牛津杯双层平板法。结果表明如表3所示，胰蛋白酶和蛋白酶K作用后，该菌对藤黄微球菌(Micrococcus luteus)28001没有抑菌作用。说明该菌抑制藤黄微球菌(Micrococcusluteus)28001的物质为可被胰蛋白酶和蛋白酶K分解，是蛋白质类物质。
表3.过氧化氢酶和蛋白酶作用后的抑菌活性
| 号 |
注：抑菌圈直径包含牛津杯外径(7.8mm)，“-”代表对藤黄微球菌(Micrococcus luteus)28001抑菌圈直径低于8.0mm
上述步骤1-3的实验结果说明：肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)2号发酵液中主要抑菌物质不是过氧化氢，也不是因为酸的作用，还有另外的抑菌物质对指示菌起抑制作用。该抑菌物质可被胰蛋白酶和蛋白酶K的酶解，说明它们是蛋白质类物质，是一类细菌素。
二、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)2号发酵条件的优化
优化肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)2号发酵条件方法：按照实施例1中的牛津杯法方法测定不同浓度(质量百分含量)的葡萄糖，胰蛋白胨，蛋白胨，酵母膏，硫酸镁和吐温80，以及不同质量百分含量的接种量，培养时间，温度和起始pH值条件下的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)2号培养液对抑制藤黄微球菌(Micrococcus luteus)28001的影响，得到最佳条件。
通过对培养基碳源、氮源、培养时间、温度、接种量、pH值等条件的优化后，最佳培养温度为30℃，培养时间为28h，最佳起始pH值为6.0，最佳接种量为106cfu/ml，培养基(质量百分含量)：即葡萄糖3％，胰蛋白胨1.5％，蛋白胨2％，酵母膏1.5％，硫酸镁0.087％，吐温80 0.2％。培养方法为静置培养。
效价标准方程的测定
效价检测平板中，分别加入50IU/mL、100IU/mL、500IU/mL、1000IU/mL、1500IU/mL、2000IU/mL、5000IU/mL的Nisin(SIGMA公司，货号：N5764)标准溶液，以藤黄微球菌为指示菌，30℃培养24h，以效价对数值为横坐标，抑菌圈直径为纵坐标，添加直线渐近线，获得效价测定标准方程。然后对应标准曲线计算出肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)2号产细菌素的相对效价。
优化前挑取MRS培养基上培养24小时的肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)2号，接种于MRS液体培养基中，30℃静置培养24h，初始pH值6.0。接种量为106cfu/ml。
结果如表4所示，结果表明，经过优化后肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)2号产细菌素的抑菌活性明显增加。
表4发酵条件优化结果
| 优化前效价(IU/mL) | 优化后效价(IU/mL) | 优化前/优化后 | |
| Leuconostoc | 271.70 | 1122.65 | 413.19％ |
三、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)2号分泌的细菌素生物学特性的研究
1、细菌素对热的稳定性
挑取活化的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)2号单菌落接种于MRS液体培养基中，密封，30℃静置培养24h，发酵液以12000rpm，4℃离心15min，收集上清液，上清液用0.22μm孔径的无菌滤膜过滤，除去菌体及其它杂质。获得肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)2号的无细胞发酵上清液。
将肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)2号的pH6.0无细胞发酵上清液分别放置在60℃、80℃、100℃和121℃处理15min和30min，按照步骤一所述的牛津杯双层平板法，在30℃条件下做抑菌试验，确定不同温度处理后对细菌素抑制藤黄微球菌(Micrococcus luteus)28001活性的影响。
结果如表5所示，结果表明肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)2号对100℃条件下保持相当的热稳定性，但是不耐121℃的高温。
表5.温度对细菌素活性的影响
注：抑菌圈直径包含牛津杯外径(7.8mm)，“-”代表抑菌圈直径低于8.0mm
2、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)2号分泌的细菌素对酸的稳定性
将肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)2号无细胞发酵上清液(按照步骤1的方法获得)分别用1mol/L HCL和1mol/L NaOH调其pH值为2.0～10.0，37℃下温育2h，调pH值为6.0，然后按照步骤一所述的牛津杯双层平板法做抑菌试验测抑菌活性。同等条件下，分别用1mol/L HCL和1mol/L NaOH调整灭过菌的液体MRS培养基pH值为2.0～10.0，37℃下温育2h，调整pH值为6.0，同样按照步骤一所述的牛津杯双层平板法做对照。
表6.肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)2号细菌素对酸的稳定性
注：抑菌圈直径包含牛津杯外径(7.8mm)，“-”代表抑菌圈直径低于8.0mm
3、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)2号分泌的细菌素对酶的敏感性
取等量的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)2号菌pH6.0无细胞发酵上清液(按照步骤1的方法获得)，用1mol/L HCL和1mol/L NaOH调节pH为以下各酶的最适作用pH值，按终浓度1mg/mL分别加入胃蛋白酶(最适作用pH值3，Amresco公司，货号：0685)、胰蛋白酶(最适作用pH值8.1，GLBCO公司，27250018)、蛋白酶K(最适作用pH值8.0，MERCK公司，WL558668.609)、木瓜蛋白酶(最适作用pH值6.0，MERCK公司，107147)和糜蛋白酶(最适作用pH值8.5，SIGMA公司，C8660)，37℃下温育2h，调整pH达到6.0，按照实施例一所述的牛津杯双层平板法做抑菌实验，重复3次，同时以未经过蛋白酶处理的pH6.0无细胞发酵上清液做对照。
结果如图1所示，结果表明，Leuconostoc mesenteroides 2号所产细菌素能被胃蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和糜蛋白酶完全失活，说明此菌产生的细菌素是一种蛋白质类物质，具有较高的安全性，食品加工中作为食品防腐剂开发具有较好的应用前景。图1中，1为胃蛋白酶；2为蛋白酶K；3为胰蛋白酶；4为木瓜蛋白酶；5为糜蛋白酶；CK为发酵液。
4、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)2号分泌的细菌素的抑菌谱的测定
取等量的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)2号菌pH6.0无细胞发酵上清液(按照步骤1的方法获得)，按照实施例1中的所述的牛津杯双层平板法对表7中的各种指示菌做抑菌实验，同时以pH6.0的液体MRS培养基为对照。结果如表7所示，在所选的指示菌范围内，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)3号分泌的细菌素对藤黄微球菌28001、金黄色葡萄球菌26003、枯草芽孢杆菌63501、短小芽孢杆菌63202、巨大芽孢杆菌63201、铜绿假单孢杆菌10104、沙门氏菌50094、大肠杆菌30105有抑制作用，对白色念珠菌98001、啤酒酵母98002、黑曲霉98003和青霉98005没有抑制作用。
表7.肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)2号分泌的细菌素的抑菌谱
| 指示菌(均购于河南省食品药品检验所) | 抑菌圈直径(单位：mm) |
| 藤黄微球菌28001 | 18.16 |
| 金黄色葡萄球菌26003 | 15.10 |
| 枯草芽孢杆菌63501 | 14.92 |
| 短小芽孢杆菌63202 | 15.64 |
| 巨大芽孢杆菌63201 | 15.97 |
| 铜绿假单孢杆菌10104 | 13.64 |
| 沙门氏菌50094 | 13.81 |
| 大肠杆菌30105 | 12.86 |
| 白色念珠菌98001 | - |
| 啤酒酵母98002 | - |
| 黑曲霉98003 | - |
| 青霉98005 | - |
注：抑菌圈直径包含牛津杯外径(7.8mm)，“-”代表抑菌圈直径低于8.0mm
四、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)2号分泌的细菌素的提取
1、硫酸铵盐析法粗提细菌素
各取等量肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)2号的无细胞发酵上清液(按照步骤三中步骤1的方法获得)80℃下处理10min防止细菌素降解，分别调整硫酸铵的饱和度为30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，缓慢搅拌1h后，放置4℃冰箱中过夜。离心弃上清(10000rpm，4℃，30min)，沉淀溶于1mL的磷酸盐缓冲液中(pH6.0)，检测各浓度沉淀物溶液的抑菌活性，指示菌为藤黄微球菌28001，同时以同样浓度处理过的MRS液体培养基离心(10000rpm，4℃，30min)后弃上清，溶于1mL的磷酸盐缓冲液中(pH6.0)做对照。
结果如图2所示。
2、产细菌素最小抑菌浓度(MIC)
用液体倍比稀释法确定乳酸菌素的最小抑菌浓度(MIC)。以常见的腐败菌和致病菌为指示菌：藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、铜绿假单孢杆菌和沙门氏菌。方法如下：
(1)将各乳酸菌细菌素粗提液加入到各指示菌培养液中，用二倍稀释法稀释得到各种浓度，接入指示菌，并调整菌浓为106cfu/mL，最适温度培养过夜。以不加细菌素粗提液但接菌的试管作为阳性对照，以加细菌素粗提液但不接种菌的试管作为阴性对照。
(2)依次将未见菌生长的各管培养物分别吸取100uL注入指示菌平板培养基中，30℃培养24h，试验组无菌生长组所对应的细菌素粗提液的最低浓度，为最小抑菌浓度(MIC)。
结果如表8所示，结果表明，六种指示菌在125IU/mL-31.25IU/mL浓度的平板上有明显的菌落生长，藤黄微球菌和金黄色葡萄球菌在250IU/mL及其以上浓度的平板上完全不能生长，枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、铜绿假单孢杆菌和沙门氏菌在250IU/mL浓度的平板上仍可见少量的菌落生长，在浓度为500IU/mL及其以上的平板则无完全不能生长。所以Leuconostoc mesenteroides 2号产细菌素对藤黄微球菌和金黄色葡萄球菌的MIC为250IU/mL，对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、铜绿假单孢杆菌和沙门氏菌的MIC为500IU/mL。
表8.Leuconostoc mesenteroides 2号产细菌素对几种指示菌最小抑菌浓度(MIC)
注：“-”对指示菌的抑制圈直径低于8.0mm(牛津杯的直径7.8mm)
“+”对指示菌的抑制圈直径大于8.0mm。
Leuconostoc mesenteroides 2号产细菌素对指示菌(藤黄微球菌)生长曲线的影响
用接种环挑取藤黄微球菌28001接种于NA液体培养基(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1.0L，pH7.0～7.2)中，分别取部分菌液，然后用液体培养基稀释成活菌数为106cfu/mL的菌悬液，继续培养，每隔2h取样，测OD600nm吸光值，连续测定48h，制作出对照生长曲线。
取剩余的部分菌液，向其中添加MIC和1/2MIC的Leuconostoc mesenteroides 2号产细菌素粗提液，使培养基中活菌数为106cfu/mL，继续培养并每隔2h取样，测OD600nm，制作出细菌素作用下的藤黄微球菌的生长曲线。
结果如图3所示，结果表明和对照相比，MIC含量的细菌素对藤黄微球菌28001完全抑制，而1/2MIC含量的细菌素也大大抑制了藤黄微球菌28001的生长，其对数生长期出现的时间延长，生长的最大菌生物量也减少。
Claims (8)
1.肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)2号，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC №.3697。
2.肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)2号CGMCC №.3697在抑制病细菌中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述细菌为藤黄微球菌(Micrococcusluteus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、铜绿假单孢杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、沙门氏菌(Salmonella enterica)和大肠杆菌(Escherichia coli)。
4.肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)2号CGMCC №.3697在生产细菌素中的应用。
5.肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)2号CGMCC №.3697在制备食品或饲料防腐剂中的应用。
6.培养肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)2号CGMCC №.3697的培养基，由葡萄糖3％，胰蛋白胨1.5％，蛋白胨2％，酵母膏1.5％，硫酸镁0.087％，吐温800.2％和水组成，其中百分含量为质量百分含量。
7.肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)2号CGMCC №.3697在制备细菌抑制剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述细菌为藤黄微球菌(Micrococcusluteus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、铜绿假单孢杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、沙门氏菌(Salmonella enterica)和大肠杆菌(Escherichia coli)。
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