CN113151107B - 一种肠膜明串珠菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)及其应用，该肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO.61344，为可用于食品的安全菌株，高产2‑甲基己酸，可以改善发酵发酵食品的风味，适用于大规模生产应用。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种肠膜明串珠菌及其应用。
背景技术
2-甲基己酸(2-methylhexanoic acid，C7H14O2)，是发酵食品中的重要风味化合物之一，通常赋予奶酪、红酒、泡菜等发酵食品奶油、脂质香气。当其浓度达到0.9μg/kg时，可贡献发酵蔬菜在风味感官品质方面的特有香气，使得发酵蔬菜香气更为醇厚而协调。通常情况下蔬菜发酵过程中2-甲基己酸产量较低，在生产中，为达到增香目的，可通过外源添加来改善发酵蔬菜制品的风味。
但通过外源添加的方式实现的2-甲基己酸含量提升，由于外源添加物存在杂质风险而造成产品的安全性差且品质不稳定。因而限制了外源添加式2-甲基己酸在发酵食品风味改善方面的大规模生产应用。
发明内容
有鉴于此，本申请提供一种肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)及其应用，该肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)为可用于食品的安全菌株，高产2-甲基己酸，可以改善发酵发酵食品的风味，适用于大规模生产应用。
为解决以上技术问题，本申请提供的技术方案是一种肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)，所述肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，邮编：510075，保藏编号为GDMCC NO.61344，保藏日期为2020年12月4日，命名为B-MS-PC-13。
上述肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的16S rDNA如SEQ ID NO.1所示:
CGGGCGTTGCGGCGTGCTATACATGCAAGTCGACGCACAGCGAAAGGTGCTTGCACCTTTCAAGTGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGACAACCTGCCTCAAGGCTGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGAATAAAACTTAGTGTCGCATGACAAAAAGTTAAAAGGCGCTTCGGCGTCACCTAGAGATGGATCCGCGGTGCATTAGTTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGACAATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCTGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGAAAGCCTGATGGAGCAACGCCGCGTGTGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAGCACTGTTGTATGGGAAGAACAGCTAGAATAGGAAATGATTTTAGTTTGACGGTACCATACCAGAAAGGGACGGCTAAATACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTATGTCCCGAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGACGGTTTATTAAGTCTGATGTGAAAGCCCGGAGCTCAACTCCGGAATGGCATTGGAAACTGGTTAACTTGAGTGCAGTAGAGGTAAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTACTGGACTGCAACTGACGTTGAGGCTCGAAAGTGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACACCGTAAACGATGAACACTAGGTGTTAGGAGGTTTCCGCCTCTTAGTGCCGAAGCTAACGCATTAAGTGTTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGAAGCTTTTAGAGATAGAGTGTTCTCTTCGGAGACAAAGTGACAGGTGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTC
本发明还提供了含所述肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的菌剂。
优选的，所述菌剂为发酵剂。
优选的，所述菌剂为直投式发酵剂。
优选的，所述菌剂所述肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)活菌浓度为107～109cfu/mL。
优选的，所述菌剂通过以下方法制备得到：将所述肠膜明串珠菌活化培养后经离心、缓冲液清洗、添加冻干保护剂，调整活菌浓度至107～109cfu/mL，然后冷冻干燥，即得。
本发明还提供了上述肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)或上述发酵剂在制备发酵食品中的应用。
优选的，所述发酵食品选择乳制品、豆制品和果蔬制品中的任意一种。
优选的，所述应用包括：赋予果蔬制品香味。
优选的，所述果蔬制品为发酵蔬菜或发酵蔬菜汁饮料。
本发明还提供了上述肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)或上述菌剂在生产2-甲基己酸中的应用。
本发明还提供了一种发酵食品的制备方法，包括：将含上述肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的菌剂按2％～4％(m/v)的接种量接入待发酵食材进行发酵。
优选的，发酵蔬菜的制备方法，包括：
蔬菜盐卤水混合物的制备：预处理蔬菜和盐卤水混合，得到蔬菜盐卤水混合物；
发酵培养：将所述发酵剂接种蔬菜盐卤水混合物发酵培养，即得所述发酵蔬菜。
优选的，所述发酵蔬菜的制备方法具体包括：
蔬菜预处理：蔬菜整理去除杂质及不可食用部分，然后将蔬菜加工切成块状或条状，清洗，备用，得到预处理蔬菜；
盐卤水制备：所述盐卤水包括：辅料与水混合，加热煮沸后冷却，过滤得到盐卤水；所述辅料包括盐；
蔬菜盐卤水混合物的制备：预处理蔬菜和盐卤水混合，得到蔬菜盐卤水混合物；
发酵培养：将所述发酵剂接种蔬菜盐卤水混合物发酵培养，即得所述发酵蔬菜。
优选的，所述蔬菜预处理具体包括：蔬菜整理去除杂质及不可食用部分，然后将蔬菜加工切成块状或条状，蔬菜用消毒液消毒处理3～5min，控制蔬菜的微生物数量≤300CFU/g，再用清水冲洗3～5min，沥干备用，得到预处理蔬菜。
优选的，所述盐卤水制备具体包括：称取1％(m/v)八角，2％(m/v)花椒，2％(m/v)桂皮，3％(m/v)食盐，3％(m/v)葡萄糖，加入纯净水使其充分溶解，加热煮沸60min后，冷却至室温(15～30℃)，200目滤布过滤，得到盐卤水。
优选的，所述盐卤水制备具体包括：称取2％(m/v)老姜，3％(m/v)野山椒，1％％(m/v)桂皮，4％(m/v)食盐，4％(m/v)葡萄糖，加入纯净水使其充分溶解，加热煮沸45min后，冷却至室温(15～30℃)，300目滤布过滤得到泡菜卤水，即得到盐卤水。
优选的，所述蔬菜盐卤水混合物的制备过程具体包括：预处理蔬菜和盐卤水按1:2(m/v)比例混合，得到蔬菜盐卤水混合物。
优选的，所述发酵培养具体包括：将所述发酵剂按接种量3％～4％(m/v)接种蔬菜盐卤水混合物，25℃～30℃发酵发酵10天～14天培养，至总酸1.0％，即得所述发酵蔬菜。
优选的，发酵蔬菜饮料的制备方法，包括：
蔬菜浆液的制备：预处理蔬菜打浆，得到蔬菜浆液；
发酵基料的制备：所述发酵剂接入蔬菜浆液中进行发酵。
优选的，所述发酵蔬菜饮料的制备方法具体包括：
蔬菜预处理；
蔬菜浆液的制备：取10％(m/v)预处理蔬菜、6％(m/v)葡萄糖和水混合，打浆，得到蔬菜浆液；
发酵基料的制备：所述发酵剂按2％(m/v)的接种量接入蔬菜浆液中进行发酵，得到发酵基料；
发酵蔬菜汁的调配：蔗糖、水、发酵基料混合，调节pH值；
均质、杀菌：均质后杀菌，即得所述发酵蔬菜饮料。
优选的，所述蔬菜浆液的制备过程具体包括：称取10％(m/v)蔬菜和6％(m/v)的葡萄糖，加入纯净水，放入打浆机中打浆，得到蔬菜浆液。
优选的，所述发酵基料的制备过程具体包括：所述发酵剂按2％(m/v)的接种量接入蔬菜浆液中，25℃发酵发酵7天培养，至总酸1.0％，得到发酵基料。
优选的，所述发酵蔬菜汁的调配过程具体包括：取2％(m/v)的蔗糖，与80℃的纯净水混合，搅拌溶解30min，95℃灭菌10min并冷却至30℃；加入30％(m/v)的发酵基料，搅拌15min，并用柠檬酸盐调节pH值至4.0。
优选的，所述均质、杀菌过程具体包括：在30℃、20Mpa下进行均质；然后在95℃条件下杀菌10min，在4℃下冷藏，即得到所述发酵蔬菜汁饮料。
本发明还提供了一种发酵食品，由上述的制备方法制备得到。
本申请与现有技术相比，其详细说明如下：
内源产生通过微生物代谢直接合成2-甲基己酸，可以改善发酵发酵食品的风味，可以产物2-甲基己酸可以自然释放至发酵食品环境中。但在蔬菜发酵过程中，能产生2-甲基己酸的乳酸菌的种类较少，因此尚缺乏对理想产量效果和产香效果的乳酸菌资源的挖掘。
本发明肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)为可用于食品的安全菌株，高产2-甲基己酸；该菌株在盐卤水和蔬菜汁中生长特性良好，发酵14天时，肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)发酵蔬菜制品可产2-甲基己酸0.23μg/kg发酵蔬菜，且可达到0.97～1.12μg/kg发酵蔬菜。该菌株应用到发酵制品中，可改善发酵制品成熟过程的风味，赋予产品奶油、脂质香气，能有效提高发酵制品中发酵速率，增加产品风味，且有利于产品品质特性的提高，在发酵蔬菜制品领域具有广阔的应用前景。
本发明的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)生长温度范围较广，从15℃到45℃都生长，在30～37℃生长良好，最适生长温度为37℃；菌株的延迟期相对较短，6h进入对数生长期，16h达到稳定期。
具体实施方式
图1示本发明实施例1发酵蔬菜GC-MS总离子流图。
图2示本发明肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)菌落形态图；
图3示本发明肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的细胞形态图((×1600)；
图4示本发明肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的生长曲线图；
图5示本发明肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)不同温度下的OD值图；
图6示本发明肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)不同pH下的OD值图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
常规发酵剂为市售发酵剂(北京川秀科技有限公司，乳酸菌发酵粉-植物乳杆菌)
本发明实施例中总酸1.0％，为总酸(以乳酸计)含量达到发酵蔬菜质量的1.0％。
实施例1
肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)菌株分离方法
1、获得合适的稀释梯度并培养
从四川省眉山市传统泡菜(市售)中取样，称取5g，加入到装有45mL无菌水中，梯度稀释后取4个稀释度分别为10-1，10-2，10-3，10-4的菌悬液各100μL分别涂布于MRS琼脂培养基上，于温度37℃下培养48h。
2、分离纯化
用平板划线法，挑选典型单菌落，重复培养挑选操作得到优良性状的菌株。
3、菌株的初筛
革兰氏染色及过氧化氢酶实验
挑取单菌落，做革兰氏染色及过氧化氢酶实验，将革兰氏阳性、过氧化氢阴性菌通过平板纯化，经10000rpm离心5min后贮藏于30％(v/v)甘油管内，－80℃保藏。。
4、复筛
产2-甲基己酸能力的测定
(1)无菌脱脂乳的制备
称取12％(m/v)脱脂乳粉、6％(m/v)的葡萄糖和2％(v/v)的甘油，加入纯净水使其充分溶解，在115℃下灭菌20min，然后冷却至室温(15～30℃)，即得到无菌脱脂乳。
(2)菌种活化
将甘油管保藏的乳酸菌在MRS琼脂培养基平板上划线，在37℃培养箱中24h至长出单菌落，即得到平板活化菌种；
用接种环取上述所得的平板活化菌种一环接入装有50mL MRS肉汤培养基的250mL规格的三角瓶中，置于37℃的培养箱中恒温培养18～24h，得到培养液。
(3)工作发酵剂的制备
将上述所得的培养液控制转速为10000rpm离心20min，离心所得的沉淀用无菌磷酸盐缓冲溶液(50mM，pH6.8)清洗3次，然后在清洗后的沉淀中加入2mL无菌脱脂乳涡旋震荡重悬菌体，得到重悬后菌种培养液；
将重悬后的菌种培养液在无菌条件下导入玻璃安瓿瓶中，液面高度0.8～1cm，盖瓶塞后放入-80℃速冻，而后将玻璃安瓿瓶用托盘盛装，放入冻干机进行冷冻干燥，得到工作发酵剂，且工作发酵剂活菌浓度至107～109cfu/mL。
(4)蔬菜预处理
蔬菜整理去除杂质及不可食用部分，然后将蔬菜加工切成块状或条状，含次氯酸钠的消毒液消毒处理5min，控制蔬菜的微生物数量≤300CFU/g；再用清水冲洗5min，沥干备用，得到预处理蔬菜。
(5)盐卤水制备
称取2％(m/v)老姜，3％(m/v)野山椒，1％％(m/v)桂皮，4％(m/v)食盐，4％(m/v)葡萄糖，加入纯净水使其充分溶解，加热煮沸45min后，冷却至室温(15～30℃)，300目滤布过滤得到泡菜卤水，即得到盐卤水。
(6)蔬菜盐卤水混合物的制备
步骤(4)所得的预处理蔬菜与步骤(5)所得的盐卤水按1:2(m/v)比例混合，得到蔬菜盐卤水混合物。
(7)发酵培养
步骤(3)所得的工作发酵剂与常规发酵剂(市售)的接种量均为3％(m/v)进行接种，控制温度25℃，进行发酵14天，至总酸1.0％，即得到发酵蔬菜。
(8)GC-MS测蔬菜发酵过程中2-甲基己酸含量
色谱条件为：将上述所得的发酵蔬菜称取5g，加1.3gNaCl，定量采用庚酸甲酯为内标(1mg/mL，上样量1μL)置于顶空固相微萃取小瓶中，完成发酵蔬菜香气化合物的检测，从而测定得出发酵蔬菜中2-甲基己酸的含量。
DB-WAX-UI毛细管柱；柱子规格：30m×0.25μm×0.25μm，进口温度为240℃，柱流速35cm/s，载气为氦气；程序升温：初始温度40℃，保持10min；10℃/min升温至90℃，保持15min,；20℃/min升温至130℃，保持5min；20℃/min升温至250℃，保持5min。
质谱条件为：离子化方式EI，发射能量为74eV，离子源温度230℃，接口温度280℃，四级杆温度：150℃，质荷比15～500。在NIST 2001标准谱库的检索及标准品比对进行物质定性，并采用峰面积归一化法计算各成分的峰面积，表示为μg/kg蔬菜制品。
(9)发酵过程中2-甲基己酸含量变化
通过测定发酵蔬菜中2-甲基己酸的含量筛选得到产2-甲基己酸的量最多的菌株肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)B-MS-PC-13。
采用肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)B-MS-PC-13的工作发酵剂，发酵14天时，2-甲基己酸含量为1.08μg/kg发酵蔬菜，发酵蔬菜GC-MS总离子流图见图1；常规发酵剂进行发酵2-甲基己酸含量为0.23μg/kg发酵蔬菜。
实施例2
肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)B-MS-PC-13的鉴定
1、PCR扩增16S rDNA
实施例1步骤3菌株的初筛过程中得到的的肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)B-MS-PC-13单菌落点种于MRS琼州平板上，37℃培养18～24h,长出的单菌落作为PCR模版。
1)PCR体系25μL，其中Mix为12.5μL，27F为0.5μL，1492R为0.5μL，ddH2O为11.5μL。
所用引物为27F：AGAgTT TGA TCC TGG CCT CA和1492R：gGT TAC CTTgTTACGACTT。扩增片段长度为1500bp。
2)PCR条件：
DNA双链在94℃，10min的条件下预变性；94℃，30s变性；50℃，30s，复火；72℃，80s延伸，并循环29次，最后72℃下保持7min。
2、琼脂凝胶电泳
称取0.5g琼脂糖溶于50mL TBE缓冲液中，加热溶解后加入EB染料5μL；注胶凝固后，每个点样孔加样3～5μL；于120V电压下运行20min；胶板在UV下观察图像，挑选清晰条带的PCR产物送北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序。
3、16S rDNA序列分析鉴定
经北京六合华大基因科技股份有限公司测序，该肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)B-MS-PC-13的16S rDNA如SEQ ID NO.1所示：
CGGGCGTTGCGGCGTGCTATACATGCAAGTCGACGCACAGCGAAAGGTGCTTGCACCTTTCAAGTGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGACAACCTGCCTCAAGGCTGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGAATAAAACTTAGTGTCGCATGACAAAAAGTTAAAAGGCGCTTCGGCGTCACCTAGAGATGGATCCGCGGTGCATTAGTTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGACAATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCTGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGAAAGCCTGATGGAGCAACGCCGCGTGTGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAGCACTGTTGTATGGGAAGAACAGCTAGAATAGGAAATGATTTTAGTTTGACGGTACCATACCAGAAAGGGACGGCTAAATACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTATGTCCCGAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGACGGTTTATTAAGTCTGATGTGAAAGCCCGGAGCTCAACTCCGGAATGGCATTGGAAACTGGTTAACTTGAGTGCAGTAGAGGTAAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTACTGGACTGCAACTGACGTTGAGGCTCGAAAGTGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACACCGTAAACGATGAACACTAGGTGTTAGGAGGTTTCCGCCTCTTAGTGCCGAAGCTAACGCATTAAGTGTTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGAAGCTTTTAGAGATAGAGTGTTCTCTTCGGAGACAAAGTGACAGGTGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTC
采用BLAST分析工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)将所分离B-MS-PC-1316S rDNA序列与GenBank/EMBL/DDBJ数据库比对，经分析鉴定为菌株肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)。
该菌菌落图如图2所示，菌落特征为：细胞呈球状，MRS琼脂培养基上菌落为白色，菌落大小0.5mm-0.8mm，凸起，光滑，湿润，不透明。
该菌细胞形态图(×1600)如图3所示，菌体特征：菌体呈球状多排列成长短不一的链状，也有单个分散排列，菌体大小一般为0.5μm×1.5μm，革兰氏染色阳性。
依据形态特征、生理生化特征等微生物学特性及其遗传特性16s rDNA将该菌鉴定为肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)。该肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)B-MS-PC-13已保藏于中国典型培养物保藏中心(简称GDMCC)，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，邮编：510075，保藏编号为GDMCCNO.61344，保藏日期为2020年12月4日，命名为B-MS-PC-13。
实施例3
肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的生长特性和发酵特性
(1)肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)菌株的生长曲线
将-80℃保存的实施例1肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)B-MS-PC-13接种于MRS肉汤培养基中，37℃培养24h，得到活化好的菌株。
将活化好的菌按2～4％(v/v)接种量接种入MRS肉汤培养基中，37℃恒温培养26h，每隔2h于600nm测定培养液的OD值，以OD值对时间作图得到菌株的生长曲线，其结果见图4(肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)生长曲线图)。结果表明：表明：肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)B-MS-PC-13在MRS培养基中生长迅速，在18h后达到最大菌量6.8*109CFU/mL。，菌株的延迟期相对较短，6h进入对数生长期，16h达到稳定期。
(2)肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)菌株最适生长温度测定
将上述活化好的菌株按2～4％(V/V)接种量分别接于10mL MRS肉汤培养基中，分别置于15℃、25℃、32℃、37℃、40℃和45℃条件下恒温培养24h，以未接种的MRS肉汤培养基作对照，于600nm测定不同温度下培养液的OD值，确定最适生长温度，其结果见图5(肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)不同温度下的OD值图)。
结果表明：肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)B-MS-PC-13的生长温度范围较广，从15℃到45℃都生长，在30～37℃生长良好，最适生长温度为37℃。
(3)肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)菌株最适生长pH测定
将上述活化好的菌按2～4％(v/v)接种量分别接种入pH为8.0、7.0、6.0、4.0、3.5的MRS液体培养基中，37℃恒温培养72h，测定培养液的OD值，其结果见图6(肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroide不同pH的生长OD图)。
结果表明：酵母菌在pH为3.5～8.0均生长良好，最适生长pH为6.0。
实施例4
含肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的发酵剂
(1)无菌脱脂乳的制备
称取10％(m/v)脱脂乳粉、6％(m/v)的葡萄糖和2％(v/v)的甘油，加入纯净水使其充分溶解，在115℃下灭菌20min，然后冷却到37℃，即得到无菌脱脂乳；
(2)菌种活化
用接种环取无菌水溶解的冷冻干燥管保存的肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)B-MS-PC-13一环在MRS琼脂培养基平板上划线，在37℃培养箱中培养48h至长出单菌落，即得到平板活化菌种；
(3)发酵剂的制备
挑取一环MRS琼脂培养基平板上的单菌落接种到MRS肉汤培养基，置于37℃恒温培养箱中培养18h，得到培养液；
将所得的培养液控制转速为10000rpm进行离心20min，离心所得的沉淀用无菌磷酸盐缓冲溶液(50mM，pH6.8)清洗3次，然后在清洗后的沉淀中加入2mL无菌脱脂乳溶液涡旋震荡重悬菌体，得到重悬后菌种培养液；
将重悬后的菌种培养液在无菌条件下导入玻璃安瓿瓶中，液面高度0.8～1cm，盖瓶塞后放入-80℃速冻，而后将玻璃安瓿瓶用托盘盛装，放入冻干机进行冷冻干燥，即得到含肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)B-MS-PC-13的发酵剂。
所述发酵剂中肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)B-MS-PC-13活菌数为107～109CFU/mL。
实施例5
含肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)B-MS-PC-13的发酵蔬菜
(1)蔬菜预处理
蔬菜整理去除杂质及不可食用部分，然后将蔬菜加工切成块状或条状，含次氯酸钠的消毒液消毒处理5min，控制蔬菜的微生物数量≤300CFU/g；再用清水冲洗5min，沥干备用，得到预处理蔬菜。
(2)盐卤水制备
称取1％(m/v)八角，2％(m/v)花椒，2％(m/v)，桂皮3％(m/v)食盐，3％葡萄糖，加入纯净水使其充分溶解，加热煮沸60min后，冷却至室温(15～30℃)，200目滤布过滤得到泡菜卤水，即得到盐卤水。
(3)蔬菜盐卤水混合物的制备
步骤(1)所得的预处理蔬菜与步骤(2)所得的盐卤水按1:2(m/v)比例混合，得到蔬菜盐卤水混合物。
(4)发酵培养
实施例4的发酵剂按接种量为4％(m/v)进行接种，控制温度30℃，进行发酵10天，至总酸1.0％，即得到含肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)B-MS-PC-13的发酵蔬菜。
测定产品中2-甲基己酸含量，含肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)B-MS-PC-13的发酵蔬菜中2-甲基己酸的含量为0.97μg/kg发酵蔬菜。
实施例6
含肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)B-MS-PC-13的发酵蔬菜饮料
(1)蔬菜预处理
蔬菜整理去除杂质及不可食用部分，然后将蔬菜切成块状，含次氯酸钠的消毒液消毒处理5min，控制蔬菜的微生物数量≤300CFU/g；再用清水冲洗5min，沥干备用，得到预处理蔬菜。
(2)蔬菜浆液的制备
称取10％(m/v)蔬菜和6％(m/v)的葡萄糖，加入纯净水，放入打浆机中打浆，得到蔬菜浆液。
(3)发酵基料的制备
实施例4的发酵剂按2％(m/v)的接种量接入蔬菜浆液中，控制温度25℃，进行发酵7天，至总酸1.0％，过滤所得清液经过冷藏即得到含肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)B-MS-PC-13的发酵基料。
(4)发酵蔬菜汁的调配
取2％(m/v)的蔗糖，用80℃的纯净水处理，搅拌溶解30min，95℃灭菌10min并冷却至30℃；取30％(m/v)的发酵基料加入上述溶液中，搅拌15min，并用柠檬酸盐调节pH值至4.0。
(5)均质、杀菌
在30℃、20Mpa下进行均质；然后在95℃条件下杀菌10min，在4℃下冷藏即得到含肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)B-MS-PC-13的发酵蔬菜汁饮料。
测定产品中2-甲基己酸含量，含肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)B-MS-PC-13的发酵蔬菜汁饮料中2-甲基己酸的含量为1.12μg/kg发酵蔬菜汁饮料。
对比例1
本对比例和实施例5的区别仅在于：采用常规发酵剂(市售)替换实施例5中的发酵剂进行发酵培养。
测定产品中2-甲基己酸含量，发酵蔬菜中2-甲基己酸的含量为0.13μg/kg发酵蔬菜。
对比实施例5和对比例1，证明肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)B-MS-PC-13在发酵蔬菜中具有较高的2-甲基己酸产生能力，并且在发酵过程中能大幅提高发酵蔬菜的内源产香，在发酵蔬菜中具有广阔的应用前景。
对比例2
本对比例和实施例6的区别仅在于：采用常规发酵剂(市售)替换实施例5中的发酵剂进行发酵培养。
测定产品中2-甲基己酸含量，发酵蔬菜汁饮料中2-甲基己酸的含量为0.21μg/kg发酵蔬菜汁饮料。
对比实施例6和对比例2，证明肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)B-MS-PC-13在发酵蔬菜中具有较高的2-甲基己酸产生能力，并且在发酵过程中能大幅提高发酵蔬菜的内源产香，在发酵蔬菜中具有广阔的应用前景。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 四川老坛子食品有限公司
四川省农业科学院农产品加工研究所
<120> 一种肠膜明串珠菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1070
<212> DNA
<213> 肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)
<400> 1
cgggcgttgc ggcgtgctat acatgcaagt cgacgcacag cgaaaggtgc ttgcaccttt 60
caagtgagtg gcgaacgggt gagtaacacg tggacaacct gcctcaaggc tggggataac 120
atttggaaac agatgctaat accgaataaa acttagtgtc gcatgacaaa aagttaaaag 180
gcgcttcggc gtcacctaga gatggatccg cggtgcatta gttagttggt ggggtaaagg 240
cctaccaaga caatgatgca tagccgagtt gagagactga tcggccacat tgggactgag 300
acacggccca aactcctacg ggaggctgca gtagggaatc ttccacaatg ggcgaaagcc 360
tgatggagca acgccgcgtg tgtgatgaag gctttcgggt cgtaaagcac tgttgtatgg 420
gaagaacagc tagaatagga aatgatttta gtttgacggt accataccag aaagggacgg 480
ctaaatacgt gccagcagcc gcggtaatac gtatgtcccg agcgttatcc ggatttattg 540
ggcgtaaagc gagcgcagac ggtttattaa gtctgatgtg aaagcccgga gctcaactcc 600
ggaatggcat tggaaactgg ttaacttgag tgcagtagag gtaagtggaa ctccatgtgt 660
agcggtggaa tgcgtagata tatggaagaa caccagtggc gaaggcggct tactggactg 720
caactgacgt tgaggctcga aagtgtgggt agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc 780
acaccgtaaa cgatgaacac taggtgttag gaggtttccg cctcttagtg ccgaagctaa 840
cgcattaagt gttccgcctg gggagtacga ccgcaaggtt gaaactcaaa ggaattgacg 900
gggacccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc 960
aggtcttgac atcctttgaa gcttttagag atagagtgtt ctcttcggag acaaagtgac 1020
aggtgtgcat ggtcgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc 1070
Claims (10)
1.一种肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)，其特征在于，所述肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNO.61344。
2.含权利要求1所述的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的菌剂。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂为发酵剂。
4.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂中所述肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)活菌浓度为107～109cfu/mL。
5.一种发酵剂的制备方法，其特征在于，包括：将权利要求1所述的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)活化培养后离心，缓冲液清洗，添加冻干保护剂，调整活菌浓度，冷冻干燥。
6.权利要求1所述的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)或权利要求2所述的菌剂在制备发酵食品中的应用，所述发酵食品为果蔬制品。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述果蔬制品为发酵蔬菜或发酵蔬菜汁饮料。
8.权利要求1所述的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)或权利要求2所述的菌剂在生产2-甲基己酸中的应用。
9.一种发酵食品的制备方法，其特征在于，包括：将含权利要求1所述的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的菌剂按2％～4％(m/v)的接种量接入待发酵食材进行发酵，所述发酵食品为果蔬制品，发酵食材为果蔬。
10.一种发酵食品，其特征在于，由权利要求9所述的制备方法制备得到，所述发酵食品为果蔬制品。
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