CN109337833A - 诱变的肠膜明串珠菌的生物制剂及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种诱变的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides strain)及其生物制剂，其中该诱变菌是肠膜明串珠菌KJY15(KJY‑HN001‑01‑05)，CGMCC NO.15425，保藏日期为2018年03月07日。本发明还提供该诱变菌所制备的生物制剂，用于降低豆制品中的豆腥味成分的用途。本发明还提供该诱变菌单独或联合其他乳酸菌制备用于酸豆奶、酸奶豆腐、豆清液饮料、豆清液酸汤的凝固剂的用途。
Description
技术领域
本发明属于生物制剂领域，具体是涉及一种诱变的肠膜明串珠菌 (Leuconostocmesenteroides strain)，并通过该诱变菌所制备的生物制剂及其用 于降低豆制品豆腥味成分的用途。
背景技术
肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides strain)是乳酸菌中的明串珠菌属的重要菌种，一般存在于植物体表，常用于发酵乳制品、青贮、泡菜和果酒中。 肠膜明串珠菌的菌落形态呈圆形或豆形，菌落直径小于1.0mm，表面光滑，乳白 色，不产生任何色素；细胞形态呈球形、豆形或短秆形，有些成对或以短链排列、 不运动、无芽孢；革兰氏染色呈阳性；微好氧性，厌氧培养生长良好；生长温度 范围2℃～53℃，最适生长温度30℃～40℃；耐酸性强，生长最适pH为5.5～6.2， 在pH≤5的环境中也可以生长，而在中性或初始碱性条件下生长速率降低。
肠膜明串珠菌因缺乏EMP途径中的醛缩酶和异构酶，因此其葡萄糖的降解完 全依赖HMP途径。肠膜明串珠菌发酵蔗糖产生特征性的葡聚糖粘质物，存在于粘 质物中的菌可耐受80℃～85℃高温。肠膜明串珠菌的葡萄糖发酵产物为乳酸、乙 醇和CO2，核糖发酵产物为乳酸和乙酸，果糖发酵产物为乳酸、乙酸、CO2和甘露 醇。因此，肠膜明串珠菌属于高产酸菌。
范娟等(《食品科技》第42卷第1期，2017)报道了肠膜明串珠菌的高产葡 聚糖，其中在接种量4.0％，初始pH8.0、培养温度27.0℃的条件下葡聚糖产量高 达60.55g/L，其中产葡聚糖的能力明显高于已报道的水平，具有工业菌株生产葡 聚糖的潜力。由于肠膜明串珠菌的荚膜物质葡聚糖，是生产代血浆的主要成分右 旋糖酐的原料，在医疗上十分重要，具体维持血液渗透压和增加血溶量的作用， 是目前公认的优良血浆代用品之一。因此，通过肠膜明串珠菌来生产葡聚糖，对 于开发优良血浆代用品提供了新的研究方向。
研究还表明，肠膜明串珠菌及其发酵产物可明显提高动物机体GSH-px、SOD 活性，降低血清MDA水平，并维持较长时间。因此肠膜明串珠菌及其发酵产物具 有提高动物机体抗氧化能力。
此外，肠膜明串珠菌是抑菌剂和保健剂，能够作为对人和动物体有益的活菌 制剂，来恢复肠道正常菌群的生态平衡，从而抵御病原菌定植侵袭，因此肠膜明 串珠菌作为具有益生潜力的乳酸菌，在食品研发领域有着十分重要的用途。
另外，肠膜明串珠菌是一种优良的风味剂，可发酵柠檬酸产生特征风味物质， 如用肠膜明串珠菌、植物乳杆菌等进行混合共生发酵，更可以产生优良的风味， 因此可以用于去除豆制品的豆腥味和提高风味口味。其中，豆奶风味是豆奶中共 存的多种挥发性风味物质达到相对稳定的平衡状态后形成的。根据研究结果，豆 奶中已被鉴定的风味物质约有70种，其中多数为醛类、醇类、酮类，还有少量酯 类、酸类、酚类、呋喃类、酚类、吡啶类、硫化物等。近年来，研究者通过动态 顶空稀释分析法(DHDA)和气质-嗅探联用法(GC-O-MS)确定了豆乳中的主要 风味物质，主要包括己醛、己醇、反-2-辛烯醛、3-甲基丁醛、冰乙酸、反-2-壬 烯醛、壬醛、1-辛烯-3-醇、苯甲醛、反-2，4-癸二烯醛等。由于大部分醇类物 质的阀值都较高，所以对豆制品的腥味或腐败气味的贡献较小，但醛类物质一般 阈值较低，即使含量很少也会对产品产生较大的影响。当其含量较少时，具有柔 和的清新、香甜的气味，而当含量高时，可能会产生异味。例如，己醛、丁醛、 壬醛、1-辛烯-3-醇、苯甲醛含量过高，是引起豆制品豆腥味的主要物质(Min D B等[J].Journal of Food Science，2006，68(4))。肠膜明串珠菌去除豆腥味的原理， 推测可能是该菌在发酵过程中还能降低豆制品(如豆乳)中的植酸含量，分解脂 肪氧化酶、胰蛋白酶抑制剂等抗营养因子，并且所含的β-葡萄糖苷酶还能将大 豆异黄酮糖苷水解成异黄酮苷元，从而降低豆制品的豆腥味。
目前，关于肠膜明串珠菌的应用专利很多，例如，中国发明专利申请201510967496.4、“一种肠膜明串珠菌及其制备方法和应用”公开了一种已被生 物保藏的、并能够用于多糖生产的肠膜明串珠菌，该菌可以用于大量制备不可溶 性多糖，从而能够更好地控制乳清析出，能被用于乳制品发酵中，在牛奶制品贮 藏中亦能避免因乳清析出造成产品质量下降。但是，该发明并未公开如何其降低 豆制品的豆腥味及其效果。
中国发明专利申请20131077194.0、“一种肠膜明串珠菌菌株”和201310077193.6、“一种肠膜明串珠菌菌株的应用”公开了一种已被生物保藏的、 并能用于抑制荔枝霉菌和炭疽病菌的肠膜明串珠菌，该菌还能降低荔枝和龙眼的 氧化酶的活性，保持果皮新鲜活性，在水果保鲜方面具有重要价值。但是，该发 明也未公开如何其降低豆制品的豆腥味及其效果。
中国发明专利申请201010281506.6、“一种肠膜明串珠菌株的应用”公开了 一种已被生物保藏的、并能用于抑制多种病原菌和腐败菌的的肠膜明串珠菌，通 过该菌制备的细菌数具有抑菌谱广的优点，可广泛用作天然食品防腐剂和饲料添 加剂。但是，该发明也未公开如何其降低豆制品的豆腥味及其效果。
中国发明专利申请201710051539.3、“一株产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌 株及其应用方法”和中国发明专利申请201711169481.9、“一株产甘露醇的肠膜 明串珠菌突变菌株及其应用方法”公开了一种已被生物保藏的、并能高效生产甘 露糖的肠膜明串珠菌基因工程菌，该菌在优化的培养条件下发酵生产的甘露醇浓 度可以达到9.35克/升或9.73克/升，蔗糖中果糖部分的转化率93.5％或97.3％。但 是，该发明也未公开如何其降低豆制品的豆腥味及其效果。
综上，目前需要一种能够高效去除豆制品的豆腥味并改善豆制品风味的肠膜 明串珠菌及其应用。
发明内容
本发明原理在于，目前的高性能的肠膜明串珠菌的筛选，主要停留在传统的 自然筛选或通过选择压能进行筛选。前者难以获得高产效率的菌株，而后者所获 得的诱变菌，又由于选择压的消失而遗传性能不稳定，导致菌株退化。有鉴于此， 本发明首次提供了通过复合诱变技术来筛选高效去除豆腥味的肠膜明串珠菌，同 时通过多次重复的复筛，使得诱变菌株的性能稳定。
因此，本发明第一目的提供一种能有效去除去除豆腥味成分的肠膜明串珠菌KJY15，保藏号为CGMCC No.15425,保藏日期为2018年03月07日。保藏单位是中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号 院3号。
在一个实施方案中，该诱变菌株KJY15能在相比于出发菌株，其发酵后去除 豆腥味成分近93％。
本发明第二目的是提供诱变上述菌株KJY15的制备方法，步骤包括：
(1)将冻存的肠膜明串珠菌株分别在改良的MRS液体培养基中经过二次活 化后，然后进行MRS固体培养基的平板计数法，选择具有明显溶钙圈的单个菌落 进行划线纯化，纯化3～4代；
(2)将纯化后的菌株稀释成107/ml的菌悬液，置于功率500W的微波炉，辐 照时间为40s，每隔10s取出用冰浴10s消除微波的热效应，然后涂布筛选梯度培 养平板上，避光培养24h；
(3)选取平板相对较厚处生长的单菌落，置于MRS液体培养基中进行培养；
(4)收集培养的菌体，并稀释成108/ml的菌悬液，加入pH7.4的醋酸钠缓 冲液和体积分数为2％的DES溶液后，于37℃培养箱中分别避光孵育35min后，向 各样品中加入生理盐水终止反应，然后对诱变处理后的菌液冰浴2～3h后以诱导 正突变；
(5)取上述菌悬液以107/ml稀释梯度，取100ul涂布到筛选梯度培养平板37℃ 下培养48h，肉眼观察，挑出在梯度平板上层培养基的相对较厚处生长的单菌落；
(6)复筛：选择生化性状稳定的菌株于MRS液体培养基摇瓶培养，然后再 于含2％碳酸钙的MRS固体培养基筛选一次之后，进行至少10代复筛，然后将生化 性状稳定的菌株进行保藏；
(7)重复复合诱变：按照以上步骤(2)-(6)，再进行微波连续诱变2代- 复筛-DES诱变1代-复筛，其中每次诱变后至少进行3代复筛，其中微波诱变的菌 株浓度需调整至108/ml的菌悬液；
(8)选择生长形状最良好的多个单菌落进行豆奶培养基发酵后，分离发酵 液并获得无细菌的上清液，通过气味扫描仪测量上清液的己醛、3-甲基丁醛、壬 醛的含量，其中一个突变株发酵后去除豆腥味成分近93％；
(10)经生理生化试验鉴定，该突变株命名为肠膜明串珠菌KJY15，并于2018 年03月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.15425。
本发明第三个发明目的是提供所述肠膜明串珠菌KJY15用于制备已经降低豆 腥味成分的食用溶液的方法，包括：
(1)将保藏的肠膜明串珠菌KJY15于MRS液体培养基中活化培养；
(2)将活化的培养液，以108CFU//ml的浓度加入预先制备好的培养液中(豆 浆、豆奶，豆清液或米浆中)，于37℃下静置培养24-96h，获得终发酵液；
(3)取部分发酵液离心过滤菌液后，获得无乳杆菌的上清液；
(4)经过检测上清液，主要豆腥味成分含量下降近93％时，所述终发酵液 即为明显改善豆腥味的食用溶液。
在一个实施方案中，所述食用溶液是用于制作酸豆奶、酸奶豆腐、豆清液饮 料、豆清液酸汤的溶液。
在一个实施方案中，还包括步骤(5)将所有终发酵液进行离心，获得无菌 的食用溶液。在一个具体实施方案中，所述无菌的食用溶液是用于制作酸豆奶、 酸奶豆腐、豆清液饮料、豆清液酸汤的溶液。
本发明第四个发明目的是提供所述诱变菌株与下列任意一种或多种诱变乳 酸菌株进行复配，以生产降低了豆腥味成分的食用溶液的方法，步骤包括：
(1)将保藏的诱变菌株分别进行活化培养，其中，活化培养基选自MRS液 体培养基，其他诱变株选自鼠李糖乳杆菌KJY11、植物乳杆菌诱变菌株KJY12、玉 米乳杆菌KJY13、干酪乳杆菌KJY14；
(2)将活化的诱变菌株培养液，加入预先制备的培养液(豆清液、豆浆、 豆奶)中，于37℃下静置培养24-96h，获得终发酵液，其中肠膜明串珠菌的加入 量为108CFU的浓度，另外4种菌种的加入量为107CFU的浓度。
(3)离心过滤菌液，获得无细菌的上清液；
(4)经过检测上清液，当豆腥味成分含量下降近93％以上时，所述终发酵 液即为明显改善豆腥味的食用溶液。
在一个具体实施方案中，所述鼠李糖乳杆菌选自鼠李糖乳杆菌KJY11，保藏 号为CGMCC No.15421，保藏日期为2018年03月07日。
在另一具体实施方案中，所述植物乳杆菌诱变菌株KJY12，保藏号为CGMCCNo.15422，保藏日期为2018年03月07日。
在一个具体实施方案中，所述玉米乳杆菌选自玉米乳杆菌KJY13，保藏号为 CGMCCNo.15423，保藏日期为2018年03月07日。
在另一具体实施方案中，所述干酪乳杆菌选自干酪乳杆菌(Lactobacillus caseistrain)KJY14，保藏号为CGMCC No.15424，保藏日期为2018年03月07日。
在其他具体实施方案中，所述肠膜明串珠菌选自肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides strain)KJY15，保藏号为CGMCC No.15425，保藏日期为2018年03 月07日。
本发明第五个目的是提供诱变的玉米乳杆菌和/或多种诱变乳酸菌株用于制 备食品凝固剂的方法，步骤包括：
(1)将诱变的肠膜明串珠菌和/或多种诱变乳酸菌株在MRS液体培养基扩大 培养后，获得为活菌密度为108-109CFU/mL的种子培养液；
(2)将种子培养液按3％(v/v)接种量接入预灭菌的豆清液中，于36～38℃下 发酵24-96h h，获得液体凝固剂。
在一个实施方案中，步骤还包括：(3)将所述液体凝固剂进行冷冻干燥处理， 获得粉状的固体凝固剂。
在另一个实施方案中，所述食品是酸豆奶、酸奶豆腐、豆清液饮料、豆清液 酸汤。
在另一实施方案中，所述在诱变株选自鼠李糖乳杆菌KJY11、植物乳杆菌诱 变菌株KJY12、玉米乳杆菌KJY13、干酪乳杆菌KJY14、肠膜明串珠菌KJY15。在一 个具体实施方案中，肠膜明串珠菌KJY15、玉米乳杆菌KJY13、鼠李糖乳杆菌KJY11、 植物乳杆菌诱变菌株KJY12、干酪乳杆菌KJY14的接种比例分别为(1-10):1:1:1:1。 在优选的实施方案中，当所述接种比例为(5-10):1:1:1:1时，所制备的凝固剂可用 于生产降低豆制品豆腥味成分的凝固食品的凝固剂。在上述的任一方案中，其中 除肠膜明串珠菌之外，可任选一种或多种其他诱变乳酸菌进行复配，且接种比例 保持不变。
本发明第六个目的是提供上述方法所制备的生物制剂，其中所述生物制剂是 食品凝固剂。
本发明第七个目的是提供上述食品凝固剂用于凝固液体食品的方法，步骤包 括：
(1)将豆浆、豆清液或牛奶于65-72℃下进行加热，然后冷却至36-40℃；
(2)加入1-5％(v/v)液体凝固剂或0.01-0.05％(m/m)的固体凝固剂，以 80-100r/min的速度搅拌，直至产生絮状物或碎花状物或胶凝状物，从而制备酸 豆奶、酸奶豆腐或酸豆腐、豆清液饮料、豆清液酸汤。
在一个实施方案中，还包括步骤(3)根据所制备的凝固食品类型，选择凝 固深化的持续时间，如豆腐的持续时间为20-30min，酸汤的持续时间为72小时。
在另一实施方案中，所述在诱变株选自鼠李糖乳杆菌KJY11、植物乳杆菌诱 变菌株KJY12、玉米乳杆菌KJY13、干酪乳杆菌KJY14、肠膜明串珠菌KJY15。在一 个具体实施方案中，肠膜明串珠菌KJY15、玉米乳杆菌KJY13、鼠李糖乳杆菌KJY11、 植物乳杆菌诱变菌株KJY12、干酪乳杆菌KJY14的接种比例分别为(1-10):1:1:1:1。 在优选的实施方案中，当所述接种比例为(5-10):1:1:1:1时，所制备的凝固剂可用 于生产降低豆制品豆腥味成分的凝固食品的凝固剂。在上述的任一方案中，其中 除肠膜明串珠菌之外，可任选一种或多种其他诱变乳酸菌进行复配，且接种比例 保持不变。
原理和定义
微生物诱变指通过人为措施诱导微生物的基因产生变异或突变，从而筛选符 合需要性状的微生物。对于微生物进行诱变的方法主要包括物理诱变(辐射或照 射法)、化学诱变(化学诱变剂)、生物诱变(基因工程突变)。
物理诱变以紫外照射为主，即将微生物悬浮液在搅拌的情况下，置于紫外 灯下短时间照射，并迅速置于低温中水浴。通过低温抑制微生物的自身修复，以 增加突变几率。而后，多次照射后，与野生菌落对照同时进行培养，观察不同照 射时间和照射强度的平板的菌落数，计算诱变后的菌株致死率。
除了放射性辐射诱变外，物理诱变还包括微波辐射法，即通过微波辐射进 行诱变该方法能引起细胞壁分子间的强烈震动，通过摩擦改变其通透性，使细 胞内含物迅速向胞外渗透。利用微波辐照改变细胞壁通透性，让微波作用于微 生物DNA、RNA从而引起变异，以达到研究目的。相比于放射性辐射诱变，虽 然诱变时间较长、处理样本量小，但其具有安全可靠、易于精细化控制和成本低 廉、操作便利的优点，因此成为微生物诱变的研究热点。
常用的化学诱变剂包括亚硝基胍(NTG)、硫酸二乙酯等。均是直接将诱变 剂以不同浓度梯度加入微生物悬浮液中，进行不同时间的培养。培养结束后，用 生理盐水或其他终止剂终止诱变反应，并迅速置于低温中水浴。多次诱变后，与 野生菌落对照同时进行培养，观察不同时间和诱变浓度的平板的菌落数，计算诱 变后的菌株致死率。
技术效果
1、本发明通过复合诱变方法，获得高效分解豆腥味成分的肠膜明串珠菌诱变菌株，该诱变菌还能发挥乳酸菌自身有益于人体的代谢产物的协同作用，从而可将 发酵初产物直接用于食品等领域。
2、由于肠膜明串珠菌不同于来自人体内分离的多种乳杆菌，因此其发酵特性不同于乳杆菌，因此优化了培养和发酵MRS培养基，主要调整如下：
(1)该菌缺乏良好的蛋白水解活力，不能降解蛋白质来提供自身生长所需 的氮源，因此酶解蛋白胨、胰蛋白胨或酶解酪蛋白3种氮源来取代蛋白胨(HENNE D等，[J].International Dairy Journal,2004,14)；
(2)发明人通过比较发现添加一定的(0.1-0.15％)柠檬酸能明显刺激诱变 菌株的细胞增长；
(3)选用蔗糖(25g/L)取代葡萄糖作为碳源，能取得更好的细菌生长效果， 并能降低发酵成本；
(4)与对照相比，添加Mn2+或Mg2+与Mn2+均能不同程度的促进细菌增长和 代谢活性，而单独添加Mg2+并无明显效果。
3、本发明针对工业生产中常见的廉价发酵原料(如豆浆、豆清液等)，在上述高 效分解豆腥味成分的诱变菌株的基础，通过实验摸索优化发酵工艺条件，从而获 得适宜的发酵方法，
4、由于本发明所用的菌株及其复配菌株，均是食品中益生菌。因此本发明可以 将终发酵液、上清液作为生物制剂添加剂，直接加入食品原料中进行生产相关食 品。
5、本发明首次发现，由于肠膜明串珠菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳 杆菌和玉米乳杆菌均属于乳酸菌类别的菌株，在理化特性和耐受机制存在相似之 处。由此，摸索出以上5种菌株都类似的复合诱变方法，并首次尝试将5种诱变菌 株混合发酵以高效减低豆腥味成分，取得良好的技术效果，并能发挥5种益生菌 对人体有益的协同效应。
6、本发明的诱变菌种，还能用于作为(复合)凝固剂来生产酸奶、酸豆浆、豆 花、酸奶豆腐等。该食用级凝固剂能够避免传统凝固剂中的氯化镁、氯化钙、硫 酸钙的食品残留，提高口感，并能发挥(复合)凝固剂中益生菌的有益作用，以 及乳酸的预防和治疗疾病的作用，符合绿色天然、安全健康的食品发展趋势。
附图说明
图1：微波辐照诱变时间与致死率变化曲线图；
图2：微波辐照诱变时间与突变率变化关系图；
图3：硫酸二乙酯诱变时间与致死率变化曲线图；
图4：酸性条件下，肠膜明串珠菌诱变株在豆清液中发酵的生长曲线图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步的详细说明。对于所属技术领域的技 术人员而言，从对本发明的详细说明中，本发明的特征和优点将显而易见。
实施例1、实验材料
出发菌株：
1、肠膜明串珠菌为本公司冻藏菌株LM20160401。
2、鼠李糖乳杆菌诱变菌株KJY11，保藏号为CGMCC No.15421，保藏日期为 2018年03月07日。
3、植物乳杆菌诱变菌株KJY12，保藏号为CGMCC No.15422，保藏日期为2018 年03月07日。
4、玉米乳杆菌诱变菌株KJY13，保藏号为CGMCC No.15423，保藏日期为2018 年03月07日。
5、干酪乳杆菌诱变菌株KJY14，保藏号为CGMCC No.15424，保藏日期为2018 年03月07日。
实施例2、微波诱变肠膜明串珠菌
将冻存的肠膜明串珠菌分别在改良的MRS液体培养基中经过二次活化后，然 后用浓度梯度法在MRS固体培养基上进行涂布。37℃下厌氧培养20-30h，在进行 平板计数法，选择具有明显溶钙圈的单个菌落进行划线纯化。最后得到的单个菌 落纯化3代。
MRS液体培养基改良调整如下：酶解酪蛋白15g/L，胰蛋白胨15g/L，蔗糖 25g/L，乙酸钠5g/L，吐温-80 1g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸锰0.2g/L(或硫 酸锰0.1g/L+硫酸镁0.1g/L)，0.15％柠檬酸，pH值为6.0；121℃，15min灭菌 备用，
MRS固体培养基：即MRS液体培养基中加入2％琼脂粉。
收集菌种并稀释成107/ml的菌悬液，置于功率500W的微波炉，辐照时间分 别为10、20、30、40、50、60、70、80、90s，每隔10s取出用冰浴10s消除微波 的热效应，避光4℃冷藏12h后，涂布MRS固体培养基平板上，37℃培养24h，进 行菌落计数，计算致死率。
采用500功率照射乳杆菌的菌悬液，致死率与照射时间的关系如图1所示。
致死率(％)＝(未诱变处理的总菌数－诱变处理后的存活菌数)/未诱变处理的总菌数×100
可以看出，随着微波时间的增加，致死率逐渐增大，当微波处理40s时，致 死率为86.2％而当微波辐照处理50s时，致死率接近100％。
统计出发菌株(表面质地粘稠，中心突起，灰白色，平均直径1mm的圆形菌 落)和诱变菌株的菌落平均直径和形状不规则性，确定比出发菌株的菌落直径增 加且出现不规则圆形但颜色不变的诱变菌株为正突变株，从而确定菌落直径比例 变大且形状出现不规则的诱变株为正向突变株。由此计算对于不同微波诱变时间 下植物乳杆菌的正突变的研究。
由图2可知，当微波辐照40s时，正突变率较大，有利于诱变的菌株的筛选。
因此，根据诱变机制，强烈的诱变剂和较高的剂量处理诱变菌株，菌株突变 可能性大，因此选用40s为下一步试验诱变辐射时间。
按照上述步骤，对已活化的菌悬液进行微波辐照处理40s，然后取辐照菌液 1ml稀释后，涂布到筛选用梯度培养平板上，于37℃培养1天。选取生长迅速、边 缘圆滑、相对较厚处生长的灰白色且表面呈粘稠状的单菌落置于MRS液体培养基 进行培养。
实施例3、硫酸二乙酯诱变
硫酸二乙酯溶液(DES)：在灭菌试管中加入0.4mL的DES原液，同时放入少 量的乙醇进行溶解，再加入19.6mL的磷酸缓冲液(pH6.0)，调配成溶液，其体 积分数为2％。
收集培养的驯化菌种，并稀释成108/ml的菌悬液。然后取5mL菌悬液，加入 5mLDES溶液，并将其混合后处理浓度为1％。
将上述菌液置三角瓶中，摇床振荡37℃培养分别避光孵育20、25、30、 35、40、45、50、60min后，分别加入生理盐水终止反应；诱变处理后的菌液冰 浴2～3h以诱导正突变后，于4000r/min室温离心15min。取菌体沉淀，用pH 6.0 磷酸缓冲液离心洗涤2次后，用冷生理盐水十倍梯度稀释菌体沉淀至7倍梯度， 分别取0.1mL涂布于含2％(质量分数)碳酸钙的MRS固体培养基上，37℃恒 温避光静置培养48h。观察各梯度培养皿菌落数，计算DES诱变的致死率。
结果图3所示：当菌悬液用体积分数为2％的DES溶液诱变处理不同时间，随 诱变处理时间的延长，致死率不断增加，在处理35min时，致死率达到85.4％。
按照实施例2的方法，统计出发菌株和诱变菌株的菌落平均直径和明显溶钙 圈的平均直径，确定比出发菌株的菌落直径和明显溶钙圈有增加但颜色不变的诱 变菌株为正突变株。
综合致死率和正突变率的实验结果，选择体积分数为2％的DES溶液诱导35 min作为最佳诱导参数。
按照上述步骤，对已活化的菌悬液进行体积分数为2％的DES溶液的诱导35 min，然后取辐照菌液1ml稀释后，涂布到筛选用梯度培养平板上，于37℃培养2-3 天。
选取生长迅速、表面粘稠，呈灰白色、凸起单菌落置于MRS液体培养基进行 培养。然后取对数生长期的菌液，离心收集后，再置于含2％碳酸钙的MRS固体培 养基筛选，挑选生长迅速、明显溶钙圈有增加但颜色不变的单菌落，以完成复筛。 以此方法，进行至少10代复筛，然后将生化性状稳定的菌株进行保藏。
不同于多分离自人体肠道的乳杆菌，来自植物表面的肠膜明串珠菌在抗诱变 能力具有明显差别，表现为相同诱变压下致死率更高，因此需要调整后续的复合 诱变次数，即只进行微波连续诱变2代-复筛-DES诱变1代-复筛，其中每次诱变后 至少进行3代复筛，虽然微波诱变率较高，但二次诱变对菌株致死率大，因此微 波重复诱变的菌株浓度需调整至108/ml的菌悬液。
实施例4、选用气味扫描仪检测诱变菌发酵液的豆腥味成分的变化
前后共进行3组诱变实验，从中选择生长形状最良好的多个单菌落进行豆奶 培养基发酵后，分离发酵液并获得无细菌的上清液，称取3ml至于保鲜膜封口的 离心管中于25℃下平衡25min。
通过便携式气味扫描仪(北京盈盛恒泰科技有限责任公司)测量上清液的气 味成分并计算各自含量产量，同时设置未发酵的豆奶上清液作为豆奶对照，出发 菌株作为菌株对照。
其中，气味扫描仪的测定时间为120s，清洗时间:120s，样品间隔：1s，传感 器室流量：0.5L/min，测量样品流量：0.5L/min。
以己醛、3-甲基丁醛、壬醛的主要豆腥味挥发性物质作为检测指标，分析诱 变菌株对发酵豆奶的作用，结果见表1(单位：mg/L)。
表1
如上表1可知，诱变株IR-DES-2-67，其降解豆腥味成分的能力明显高于其他 诱变株，其相比于未诱变的出发菌株，效力提高近93％。
实施例5、诱变株的生理生化特性测试和分子鉴定
(一)生理生化特性测试
挑取单个诱变株IR-DES-2-67菌落进行划线纯化，纯化3～4代，并通过表观判 断与镜检确定其菌落形态和菌体形态，并进行4℃菌种斜面保存。
生理生化特性测试结果如下表2：
(二)分子鉴定
提取菌株细胞总DNA，以通用引物扩增菌株的16S rRNA的部分基因片段，插 入测序载体后进行测序，并于NCBI数据库进行比对。
比对结果如下表3：
另外，基于16S rRNA基因序列构建的菌株系统发育树如下表4：
根据上述测定结果，表明其与上述多个肠膜明串珠菌的部分序列均保持一 致，且与生理生化特征结果相一致，故将该诱变菌株定名为肠膜明串珠菌 (Leuconostocmesenteroides strain)KJY15，简写为KJY15。将该KJY15进行保藏， 保藏号为CGMCCNo.15425，保藏日期为2018年03月07日，保藏单位：中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
(三)菌种在豆清液中的生长
在酸性条件(pH6.0)下，将诱变菌种在豆清液中进行发酵培养，每2h检测OD 值，以确定菌种活菌数。
如图4所示，随着时间的增长，诱变菌种的活菌数逐渐增加，在14h达到峰值， 随后进入平稳的生长期。这表明，诱变的肠膜明串珠菌在豆清液中能够良好生长， 并且长时间持续保持高速平稳的生长状态。
实施例6、多种诱变菌株工业化协同去除豆制品的豆腥味和改善口感
一、复配菌株：
鼠李糖乳杆菌选自鼠李糖乳杆菌KJY11，保藏号为CGMCC No.15421，保藏 日期为2018年03月07日。
植物乳杆菌选自植物乳杆菌KJY12，保藏号为CGMCCNo.15422，保藏日期为 2018年03月07日。
玉米乳杆菌选自玉米乳杆菌KJY13，保藏号为CGMCC No.15423，保藏日期 为2018年03月07日。
干酪乳杆菌选自干酪乳杆菌KJY14，保藏号为CGMCC No.15424，保藏日期 为2018年03月07日。
肠膜明串珠菌选自肠膜明串珠菌KJY15，保藏号为CGMCC No.15425，保藏 日期为2018年03月07日。
二、气味扫描仪检测复配菌株去豆腥味成分的能力
将活化的诱变菌株培养液，分别单独加入预先制备的豆奶、豆清液、豆清液 饮料或酸汤培养液中，于37℃下静置培养48h，获得终发酵液，其中豆奶培养液 中肠膜明串珠菌的加入量为108CFU/ml的浓度，另外4种菌种的加入量为 107CFU/ml的浓度。并分别测定复配菌株的去豆腥味成分能力。结果如下表5-6所 示。
表5
| 豆腥味主要成分 | 豆清液发酵前 | 豆清液饮料 | 豆清液酸汤 |
| 己醛(mg/L) | 0.231 | 0.061 | 0.057 |
| 己醇(mg/L) | 0.09 | 0.003 | 0.002 |
| 反-2-辛烯醛(mg/L) | 0.009 | 0.003 | 0.002 |
| 3-甲基丁醛(mg/L) | 0.015 | 0.006 | 0.005 |
| 壬醛(mg/L) | 0.175 | 0.021 | 0.016 |
| 1-辛烯-3醇(mg/L) | 0.012 | 0.003 | 0.002 |
| 甲苯醛(mg/L) | 0.008 | 0.001 | 0.001 |
| 反，反-2,4-癸二烯醛(mg/L) | 0.013 | 0.006 | 0.004 |
表6
注：豆清液饮料是豆清液轻度发酵后制备的豆清液饮料，豆清液酸汤是由豆清液深度发 酵后经过加工所制备的苗侗族食用酸汤。
三、口味测试评价复配菌株去豆腥味的效果
评分标准：采用感官口味测试法
试验组：表5-6所示发酵后的豆奶、豆清液饮料和豆清液酸汤；
对照组：表5-6所示未发酵的豆奶、豆清液。
口味测试参与人员：10人相关行业研发人员，并综合10人的平均得分。
| 测试样品 | 口感平均分 | 气味平均分 | 色泽平均分 | 平均总分 |
| 未发酵豆奶 | 5.7 | 5.5 | 7.9 | 15.9 |
| 发酵后豆奶 | 9.2 | 9.8 | 9.3 | 28.3 |
| 未发酵豆清液 | 6.4 | 7.1 | 7.3 | 20.8 |
| 发酵后豆清液饮料 | 9.5 | 9.9 | 9.9 | 29.3 |
| 发酵后豆清液酸汤 | 8.6 | 9.1 | 8.0 | 25.7 |
由上表可知，采用复配菌株对豆奶、豆清液进行发酵处理后，所制备的食品 能显著降低豆腥味成分，明显改善气味，并且在所制备的饮料和色泽上也有突出 的改进。
实施例7、诱变菌种生产用于食品的生物凝固剂
分别取鼠李糖乳杆菌KJY11、植物乳杆菌诱变菌株KJY12、玉米乳杆菌KJY13、 干酪乳杆菌KJY14、肠膜明串珠菌KJY15，接种于20mL MRS液体培养基中，37℃活 化培养24h。
然后，按接种量3％(v/v)接种至500ml的MRS液体培养基中，37℃扩大培养至 获得为活菌密度为108-109CFU/mL的种子培养液；
将种子培养液按1％(v/v)接种量接入预灭菌的豆清液中，于36～38℃下发酵 48-96h，而后加入无菌的醋酸，将pH调至4.5-6.5、优选5.0-6.0，即获得液体凝 固剂。
考虑到种子培养液中活菌密度为108-109CFU/mL为菌种最佳生长时期，在相 同培养条件下，各种诱变菌种的生长的活菌密度并不完全一致，因此调整肠膜明 串珠菌KJY15、鼠李糖乳杆菌KJY11、植物乳杆菌诱变菌株KJY12、干酪乳杆菌KJY14、 玉米乳杆菌KJY13的接种比例分别为10:1:1:1:1，或1:1:1:1:1，以确保分别获得用于 生产降低豆制品豆腥味成分的凝固食品的凝固剂，和生产主要富含多种益生菌的 食品的凝固剂。在上述的任一方案中，其中除肠膜明串珠菌之外，可任选一种或 多种其他诱变乳酸菌进行复配，且接种比例保持不变。
将获得的液体凝固剂中，通过离心分离菌体，然后用适量的无菌生理盐水重 悬浮后，重新分离纯化菌体后，在重悬液中加入终浓度为7.5％(m/v)的葡萄糖或 麦芽糊精作为保护剂，先放入4℃平衡30min，然后放置-40℃中进行预冷冻20h。 冷冻完成后放入真空冷冻干燥机中，设置温度-50℃，抽真空(20～40Pa)，干燥 24h，制得粉状固体凝固剂。使用时，重新复水溶解即可。
实施例8、诱变菌种用于凝固液体食品的生产方法
1、制作豆花或酸豆浆
将优质黄豆清洗后，充分泡涨。通过使用浆渣分离器磨浆，并加热，获得熟 豆浆。
熟豆浆冷却至36-40℃，然后匀速流加加入3％(v/v)液体凝固剂，以80r/min的 速度搅拌，直至产生絮状物或碎花状物。然后降低搅拌速度，直至出现大面积的 絮状物或碎花状物。低温保存，即得豆花。或持续发酵1-4小时，以制备酸豆浆。
2、制作(酸)豆腐
在方法1的基础上，继续搅拌豆浆25min以便凝固深化，直至块状增大至不变 且水固分离时，保温养浆20min，再大火加热至微沸1min，用重物压制蹲脑 20-30min。
然后将蹲脑后豆腐倒入铺好豆腐布的型框中，包严网布、覆平、自沥后重物 压力下加压3h，确保豆腐良好的外形和质构，压制成形后即为酸奶味豆腐成品。
3、制作酸奶
将新鲜牛奶于70度左右加热杀菌后，冷却至40度，并加入5％蔗糖。
匀速流加入0.02％(m/m)的固体凝固剂，以90r/min的速度搅拌，直至产生凝 胶状物。然后降低搅拌速度，直至出现大量凝胶。低温保存，即得酸奶。
4、制作苗侗族酸汤
在方法1的基础上，将含有絮状物或碎花状物的豆清液或豆浆液，于38℃下 深化发酵72小时，即可得到酸汤原液。
预先制备西红柿浆、辣椒粉、食盐、白酒的混合溶液，加入适量1-5％(v/v) 酸汤原液，厌氧发酵5-10天。即可制得食用的苗侗族酸汤。
相对于普通豆花、酸奶、酸豆腐等，本发明的凝固剂制备出的食品，具有保 水性好、质地细腻(如酸奶豆腐)、口味清淡略带酸甜(如酸豆浆、酸奶)，香味 浓厚(如酸汤)，营养丰富。
另外，由于含有多种益生菌，能够提高胃肠道的免疫力。所富含的乳酸，能 调节肠道菌群、预防和治疗腹泻以及降低胆固醇等功能。
应当理解，本发明虽然已通过以上实施例进行了清楚说明，然而在不背离本 发明精神及其实质的情况下，所属技术领域的技术人员当可根据本发明作出各种 相应的变化和修正，但这些相应的变化和修正都应属于本发明的权利要求的保护 范围。
Claims (10)
1.一种有效去除去除豆腥味成分的肠膜明串珠菌诱变菌KJY15，保藏号为CGMCCNo.15425,保藏日期为2018年03月07日，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.用于制备上权利要求1的肠膜明串珠菌的诱变方法，步骤包括：
(1)将冻存的肠膜明串珠菌株分别在改良的MRS液体培养基中经过二次活化后，然后进行MRS固体培养基的平板计数法，选择具有明显溶钙圈的单个菌落进行划线纯化，纯化3～4代；
(2)将纯化后的菌株稀释成107/ml的菌悬液，置于功率500W的微波炉，辐照时间为40s，每隔10s取出用冰浴10s消除微波的热效应，然后涂布筛选梯度培养平板上，避光培养24h；
(3)选取平板相对较厚处生长的单菌落，置于MRS液体培养基中进行培养；
(4)收集培养的菌体，并稀释成108/ml的菌悬液，加入pH7.4的醋酸钠缓冲液和体积分数为2％的DES溶液后，于37℃培养箱中分别避光孵育35min后，向各样品中加入生理盐水终止反应，然后对诱变处理后的菌液冰浴2～3h后以诱导正突变；
(5)取上述菌悬液以107/ml稀释梯度，取100ul涂布到筛选梯度培养平板37℃下培养48h，肉眼观察，挑出在梯度平板上层培养基的相对较厚处生长的单菌落；
(6)复筛：选择生化性状稳定的菌株于MRS液体培养基摇瓶培养，然后再于含2％碳酸钙的MRS固体培养基筛选一次之后，进行至少10代复筛，然后将生化性状稳定的菌株进行保藏；
(7)重复复合诱变：按照以上步骤(2)‐(6)，再进行微波连续诱变2代‐复筛‐DES诱变1代‐复筛，其中每次诱变后至少进行3代复筛，其中微波诱变的菌株浓度需调整至108/ml的菌悬液；
(8)选择生长形状最良好的多个单菌落进行豆奶培养基发酵后，分离发酵液并获得无细菌的上清液，通过气味扫描仪测量上清液的己醛、3‐甲基丁醛、壬醛的含量，其中得到发酵后能去除近93％的豆腥味成分的突变株；
(10)经生理生化试验鉴定，该突变株命名为肠膜明串珠菌KJY15，并于2018年03月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.15425。
3.通过权利要求1的诱变菌，或权利要求2所制备的诱变菌，用于制备已经降低豆腥味成分的食用溶液的方法，包括：
(1)将保藏的肠膜明串珠菌KJY15于MRS液体培养基中活化培养；
(2)将活化的培养液，以108CFU//ml的浓度加入预先制备好的培养液中(豆浆、豆奶，豆清液或米浆中)，于37℃下静置培养24‐96h，获得终发酵液；
(3)取部分发酵液离心过滤菌液后，获得无乳杆菌的上清液；
(4)经过气味扫描仪检测上清液，当主要豆腥味成分(己醛、3‐甲基丁醛、壬醛)含量下降近93％时，所述终发酵液即为明显改善豆腥味的食用溶液，其中所述食用溶液是用于制作酸豆奶、酸奶豆腐、豆清液饮料、豆清液酸汤的溶液。
4.权利要求3的方法，其中还包括步骤(5)将所有终发酵液进行离心，获得无菌的食用溶液，可用于制作酸豆奶、酸奶豆腐、豆清液饮料、豆清液酸汤的溶液。
5.通过权利要求1的诱变菌，或权利要求2所制备的诱变菌与下列任意一种或多种诱变乳酸菌株进行复配，以生产降低豆腥味成分的食用溶液的方法，步骤包括：
(1)将保藏的诱变菌株分别进行活化培养，其中，活化培养基选自MRS液体培养基，其他诱变株选自鼠李糖乳杆菌KJY11、植物乳杆菌诱变菌株KJY12、玉米乳杆菌KJY13、干酪乳杆菌KJY14；
(2)将活化的诱变菌株培养液，加入预先制备的培养液(豆清液、豆浆、豆奶)中，于37℃下静置培养24‐96h，获得终发酵液，其中肠膜明串珠菌的加入量为108CFU的浓度，另外4种菌种的加入量为107CFU的浓度。
(3)离心过滤菌液，获得无细菌的上清液；
(4)经过检测上清液，当豆腥味成分含量下降近93％以上时，所述终发酵液即为明显改善豆腥味的食用溶液。
6.通过权利要求1的诱变菌，或权利要求2所制备的诱变菌和/或多种诱变乳酸菌株用于制备生物制剂的方法，步骤包括：
(1)将诱变的肠膜明串珠菌和/或多种诱变乳酸菌株在MRS液体培养基扩大培养后，获得为活菌密度为108‐109CFU/mL的种子培养液，其中其他诱变株选自鼠李糖乳杆菌KJY11、植物乳杆菌诱变菌株KJY12、玉米乳杆菌KJY13、干酪乳杆菌KJY14；
(2)将种子培养液按3％(v/v)接种量接入预灭菌的豆清液中，于36～38℃下发酵24‐96h h，获得液体凝固剂；
其中所述肠膜明串珠菌KJY15、玉米乳杆菌KJY13、鼠李糖乳杆菌KJY11、植物乳杆菌诱变菌株KJY12、干酪乳杆菌KJY14的接种比例分别为(1‐10):1:1:1:1，以及
所述食品是酸豆奶、酸奶豆腐、豆清液饮料、豆清液酸汤。
7.权利要求6的方法，其中步骤还包括：(3)将所述液体凝固剂进行冷冻干燥处理，获得粉状的固体凝固剂。
8.权利要求7的方法，其中当所述接种比例为(5‐10):1:1:1:1时，所制备的凝固剂可用于生产降低豆制品豆腥味成分的凝固食品的生物制剂。
9.通过权利要求6‐8的方法所制备的生物制剂，其中所述生物制剂是食品凝固剂。
10.通过权利要求9的生物制剂用于凝固液体食品的方法，步骤包括：
(1)将豆浆、豆清液或牛奶于65‐72℃下进行加热，然后冷却至36‐40℃；
(2)加入1‐5％(v/v)液体凝固剂或0.01‐0.05％(m/m)的固体凝固剂，以80‐100r/min的速度搅拌，直至产生絮状物或碎花状物或胶凝状物，从而制备酸豆奶、酸奶豆腐或酸豆腐、豆清液饮料、豆清液酸汤；和/或
(3)根据所制备的凝固食品类型，选择凝固深化的持续时间，如豆腐的持续时间为20‐30min，酸汤的持续时间为72小时。
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