CN109182171B - 高产γ-氨基丁酸的诱变菌株及其生物制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种诱变的植物乳杆菌及其生物制剂，其中该诱变菌是(KJY‑HN001‑01‑02)，CGMCCNO.15422，保藏日期为2018年03月07日。本发明还提供该诱变菌所制备的生物制剂，用于高产γ‑氨基丁酸的用途。本发明还提供该诱变菌单独或联合其他乳酸菌进行复配，以生产富含γ‑氨基丁酸的酸豆奶、酸奶豆腐、豆清液饮料、豆清液酸汤的用途。
Description
技术领域
本发明属于生物制剂领域，具体是涉及一种诱变的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，并通过该诱变菌来高产γ‐氨基丁酸的用途。
背景技术
γ‐氨基丁酸(gamma‐aminobutyric acid，GABA)，又称氨酪酸、4‐氨基丁酸，分子式为C4H9O2N，相对分子质量为103.12。结构式及三维结构如下：
γ‐氨基丁酸是2017被国家卫计委批准新资源食品，γ‐氨基丁酸是广泛存在于动植物体内的一种天然存在的非蛋白质类氨基酸。在植物中，γ‐氨基丁酸参与胁迫反应和调节植物生长方向；在动物中，γ‐氨基丁酸是中枢神经系统中很重要的抑制性神经递质，具有极其重要的生理功能，它能促进脑的活化性、健脑益智，抗癫痫，促进睡眠，美容润肤，延缓脑衰老机能，能补充人体抑制性神经递质，具有良好的降血压功效。促进肾机能改善和保护作用。抑制脂肪肝及肥胖症、活化肝功能。每日补充微量的γ‐氨基丁酸有利于心脑血压的缓解，又能促进人体内氨基酸代谢的平衡，调节免疫功能。
获得GABA的方法有化学合成法和植物富集和发酵合成法三大类。化学合成反应剧烈、得率低，存在安全隐患，而生物合成法中的植物富集法存在产量低的缺点。发酵合成法因具有产量高的优点而成为目前主要的生产方法。GABA的生产菌种主要有大肠杆菌,霉菌,酵母及乳酸菌等。而其中大肠杆菌，霉菌用于医药食品行业存在安全方面的隐患，酵母产量极低，所以大部分研究人员都致力于乳酸菌的筛选。然而，具有合成GABA能力的乳酸菌种类较多且合成能力因菌株的种属不同而差异较大。许多研究表明，来源多样的短乳杆菌(Lactbacillus brevis)合成GABA的能力比较突出。泡菜是高产GABA乳酸菌的重要来源之一，从泡菜中筛选得到高产GABA的短乳杆菌也比较多，例如在中国传统发酵食品酸菜中分离到高产GABA的短乳杆菌([J].Amino Acid,2010,38:1439‐1445)。此外，黄俊(利用短乳杆菌制备γ‐氨基丁酸的相关过程研究，浙江大学博士学位论文)报道了从自然界选育得到一株高产GABA的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，经过普通发酵72小时，发酵液中γ‐氨基丁酸含量可分别达到6.9g/L。
鉴于植物乳杆菌相比于短乳杆菌的优势，目前也成为利用微生物发酵生产GABA的研究热点。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)属于芽胞杆菌纲(Bacilli)乳杆菌属(Lactobacillus)，常存在于发酵的蔬菜、果汁中等植物蛋白乳酸菌发酵食品中，革兰氏阳性，不生芽孢，兼性厌氧，属化能异养菌。能发酵戊糖或葡萄糖酸盐，终产物中85％以上是乳酸。通常不还原硝酸盐，不液化明胶，接触酶和氧化酶皆阴性。菌种为直或弯的杆状，单个、有时成对或成链状，最适pH值为6.5左右，属于同型发酵乳酸菌。作为人和动物肠道重要的益生菌群，在代谢过程中，植物乳杆菌能通过竞争性抑制作用在胃肠道内占位、定植，抑制致病菌对胃肠道侵害，具有调节肠道菌群平衡，提高机体免疫力和促进营养物质吸收等多种作用。植物乳杆菌作为具有益生潜力的乳酸菌，在食品研发领域有着十分重要的用途。
渠岩等人(“发酵食品中产氨基丁酸植物乳杆菌S35的筛选鉴定”，中国农业大学学报2010，15(5):104‐109)报道了从传统发酵食品中分离筛选高产C‐氨基丁酸(GABA)的乳酸菌。采用薄层层析法和高效液相色谱法对分离出的82株乳酸菌的GABA生产能力进行定性和定量分析，筛选出1株高产GABA的乳酸菌S35，其在没有优化的普通培养基中(即含1％质量分数/质量浓度的谷氨酸的GYP或TYG培养基或MRS培养基)产量达到4.52g/L；
刘佳荣(微生物发酵合成γ‐氨基丁酸的研究，哈尔滨商业大学硕士学位论文，2015年)报道了从自然界选育得到一株高产GABA的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，经过在1％谷氨酸钠条件下的TYG培养基中发酵72小时，发酵液中γ‐氨基丁酸含量可分别达到5.833g/L。
中国专利申请2014107305157、发明名称“一种高产氨基丁酸乳酸菌及其筛选方法”公开了一种通过谷氨酸脱羧酶活性对氨基丁酸产生菌进行筛选的方法。在未使用诱变技术的情况下，得到一株植物乳杆菌，该乳杆菌经过在1％质量分数谷氨酸钠条件下发酵培养后，GYP培养基发酵液中γ‐氨基丁酸含量达到5.025g/L。
总体而言，对于所获得的植物乳杆菌进行发酵生产的GABA的现有研究中，仅仅以GABA产量为指标而不加入其它诱导因素，通过普通发酵培养(如1％谷氨酸钠条件下的GYP或TYG培养基或MRS培养基培养)而获得的γ‐氨基丁酸表达水平一般难以超过7.0g/L。
李理(产γ‐氨基丁酸乳酸菌及其应用，《中国乳品工业》，第42卷第2期，2014)报道了影响乳杆菌合成GABA的多种因素，认为不同发酵条件会影响GABA的产量和产率，主要因素有底物L‐谷氨酸及其盐类L‐谷氨酸钠的添加量、辅酶磷酸吡哆醛(PLP)的添加量、pH值、发酵时间和发酵基质等。其中底物浓度会直接影响GABA产生的数量和速率；另外PLP是转氨酶和脱羧酶类的辅酶，它能够促进谷氨酸的脱羧，促进GABA的产生，因此辅酶的添加量也是影响GABA产量的重要因素之一。例如，在MRS培养基中添加一定量的Glu和PLP使得副干酪乳杆菌合成GABA的能力明显提高，当底物添加量为500mmol/L(相当于7.35％质量分数)时GABA产量最高可达到161mmol/L。植物乳杆菌DSM1946在添加了18.4mmol/L L‐谷氨酸钠(相当于0.31％质量分数)的葡萄汁和乳清中GABA的产量为4.83mmol/L，较不添加底物和辅酶时有所提高。因此，现有研究中，集中于在将发酵培养基中的底物(谷氨酸或谷氨酸钠)的质量分数提高至合适的比例，能够获得GABA高产率和成本最优的效果。例如，黄桂东(《食品科学》第34卷第17期，2013年)通过单因素试验考察了葡萄糖、谷氨酸钠、氮源等对植物乳杆菌产氨基丁酸的影响，其中比较了0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％质量浓度的L‐谷氨酸钠对于GABA产量的影响，结果表明随着谷氨酸钠质量浓度的增大，GABA的产量也随之增加，例如4％质量浓度的L‐谷氨酸钠，相比于1％质量浓度的L‐谷氨酸钠，GABA的产量提高3倍以上。然而，当谷氨酸钠质量浓度超过20g/L后，菌体浓度基本保持不变，虽然GABA产量依然增加，但是L‐谷氨酸钠的转化率上是不断降低的。这意味着在实际生产过程中，过高的底物浓度是不利于生产成本的节约和转换率的提高。
除了优化碳源、底物、氮源和培养基成分之外，为了进一步提高GABA的产量，黄俊(利用短乳杆菌制备γ‐氨基丁酸的相关过程研究，浙江大学博士学位论文)进一步分析对高产菌株的诱变因素，其中在已有6.9g/L高产GABA短乳杆菌的基础上，通过UV和γ射线反复诱变处理，获得一种高产突变株，发酵72小时的产量达到17g/L，这预示着诱变因素相比于碳源、底物、氮源和培养基成分，更能提高GABA产量。在此基础上，黄俊进一步分析影响突变株表达产量的效应评价，筛选出具有显著正效应的3个因素，即葡萄糖、四水硫酸镁、L‐谷氨酸钠(MSG)或L‐谷氨酸。经过对该3个因素进行优化，最终GABA的发酵产量达到33.42g/L，较突变株的发酵产量提高97％。
受到诱变技术获得高产GABA的短乳杆菌的研究启示，刘佳荣(微生物发酵合成γ‐氨基丁酸的研究，哈尔滨商业大学硕士学位论文)通过紫外照射诱导获得的突变株，其GABA评价产量为6.899g/L，比选育的野生菌株提高18.28％，以葡萄糖为单因素对2％底物浓度的培养基进行优化后，GABA的产量增加到12.863g/L，比优化前提高了86.45％。尹然(微生物发酵合成γ‐氨基丁酸的研究，哈尔滨商业大学硕士学位论文，2016年)在所获得高产诱变菌株的基础上，以葡萄糖、MSG两个诱导因素为主，联合流加补料发酵技术，优化发酵技术后，最终GABA的产量高达20.84g/L。
由此可见，在现有的碳源、底物、氮源和培养基成分的优化因素的研究基础上，通过微生物诱变法是获得GABA高产量的可行途径
虽然普遍认识到通过选育高产菌株、诱变高产菌株、优化发酵因素/条件的三个方面，是实现高效生产GABA的三条途径，但也有报道认为不需要诱变高产菌株和过多优化上述3个诱导因素的情况下，直接在发酵液中添加额外的辅助发酵因子也能获得高产GABA的方案。例如，中国专利申请2013100451393、发明名称“高产γ‐氨基丁酸的植物乳杆菌及其应用”公开了在选育高产菌株的基础上，不需经历诱变途径，而直接通过优化发酵条件，并在4‐5％含量的谷氨酸钠的基础上，进一步添加富含孢外多糖的灵芝发酵液成分，经发酵培养后可以获得氨基丁酸含量为20‐25g/L的发酵液。然而，这种生产方法，需要选择特殊的灵芝发酵液成分，同时需要加入高浓度的底物，以及需要反复摸索新的发酵优化因素，导致生产成本过高和工艺过于复杂性，制约了工业化的应用前景。
另外，已报道的能够产GABA的乳酸菌大部分需要以高浓度的谷氨酸或其盐类作为底物以保证GABA的产量，这种高浓度的底物不仅影响相关食品本身的风味和口感，也增加了产品生产成本，同时谷氨酸摄入量较多也不利于机体健康。因此，使用不需要额外加入底物就能高效转化和生产氨基丁酸的方法，成为节约成本、提高效费比和提供安全营养的富含氨基丁酸的食品的研究趋势。
因此，目前需要一种针对廉价发酵原料而开发的无需额外补充底物的高产氨基丁酸的制备方法及其相应高产菌株。
发明内容
本发明原理之一在于：基于选育高产菌株‐诱变高产菌株‐优化发酵条件的传统途径，主要停留在传统的自然筛选或通过选择压能进行筛选。前者难以获得高产效率的菌株，而后者所获得的诱变菌，又由于选择压的消失而遗传性能不稳定，导致菌株退化。有鉴于此，本发明首次提供了通过复合诱变技术来筛选高产乳酸的植物乳杆菌，同时通过多次重复的复筛，使得诱变菌株的性能稳定，从而获得高产氨基丁酸的植物乳杆菌诱变菌株。
本发明原理之二在于：为了降低底物(如MSG)的使用和减少底物对于食品口感的影响，利用所述诱变菌株来针对廉价的蛋白酶解发酵原料(如发酵的豆浆、豆清液、土豆粉、酸奶、食用酸汤等)来优化发酵条件，从而获得高产GABA的方法。
因此，本发明第一目的提供一种通过复合诱变技术而获得的高产氨基丁酸的植物乳杆菌诱变菌株KJY12，保藏号为CGMCCNo.15422，保藏日期为2018年03月07日。保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
在一个实施方案中，在不优化其他显著正效应的因素的情况下，该诱变菌株KJY12能在2‐5％(质量分数)的底物谷氨酸的普通发酵培养基中，GABA的产量约12.75‐31.88g/L，底物摩尔转换率约91‐93％。在另一具体实施方案中，该诱变菌株KJY12在预酶解的豆清液或豆浆、豆清液或米浆的培养基发酵后氨基丁酸产量为29.43g/L以上。
本发明第二目的是提供诱变上述菌株KJY13的制备方法，步骤包括：
(1)将冻存的植物乳杆菌分别在MRS液体培养基中经过二次活化后，然后进行MRS固体培养基的平板计数法，选择具有明显溶钙圈的单个菌落进行划线纯化，纯化3～4代；
(2)将纯化后的菌株稀释成107/ml的菌悬液，置于功率500W的微波炉，辐照时间为60s，每隔10s取出用冰浴10s消除微波的热效应，然后涂布筛选梯度培养平板上，避光培养24h；
(3)选取平板相对较厚处生长的单菌落，置于MRS液体培养基中进行培养；
(4)收集培养的菌体，并稀释成108/ml的菌悬液，加入pH7.4的醋酸钠缓冲液和终浓度为200μg/mL的亚硝基胍溶液后，于37℃培养箱中分别避光孵育45min后，向各样品中加入生理盐水终止反应，然后对诱变处理后的菌液冰浴2～3h后以诱导正突变；
(5)取上述菌悬液以107/ml稀释梯度，取100ul涂布到筛选梯度培养平板37℃下培养48h，肉眼观察，挑出在梯度平板上层培养基的相对较厚处生长的单菌落；
(6)复筛：选择生化性状稳定的菌株于MRS液体培养基摇瓶培养，然后再于含2％碳酸钙的MRS固体培养基筛选一次之后，进行至少10代复筛，然后将生化性状稳定的菌株进行保藏；
(7)重复复合诱变：按照以上步骤(2)‐(6)，再进行微波连续诱变2代‐复筛‐亚硝基胍连续诱变2代‐复筛，其中每次诱变后至少进行3代复筛，其中微波诱变的菌株浓度需调整至108/ml的菌悬液；
(8)检测氨基丁酸产量：选择生长形状最良好的多个单菌落分别单一接种于MRS液体培养基中，37℃下活化培养24h，以2％(体积分数)接种量转接与GYP种子培养基中，37℃下继续培养24h；然后将培养液按2％(体积分数)接种量接种于100mL GYP发酵培养中，37℃下培养24‐48h，取发酵液5mL于沸水浴中煮沸5min，冷却后离心并保留上清；清液经薄层层析和高效液相色谱分析后，确定高产GABA的菌株；
(9)选择生长形状最良好的多个个菌落，按照步骤(6)进行复筛，最终获得1株优良突变株，通过步骤8的方法检测，其在含2‐5％的谷氨酸的GYP普通发酵培养基中，GABA的含量约12.75‐31.88g/L，底物摩尔转换率约91‐93％；在5％‐8％底物浓度及其其他优化条件下下，GABA的产率为33.95‐53.70g/L；
(10)经生理生化试验鉴定，该突变株命名为植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌KJY12，并于2018年03月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.15422。
本发明第三个发明目的是提供所述诱变植物乳杆菌KJY12生产富含GABA的食用溶液的方法，包括：
(1)将保藏的植物乳杆菌KJY12于MRS液体培养基中活化培养；
(2)在豆浆、豆清液或米浆、豆酸奶或食用酸汤中加入0.1‐0.2％重量的碱性蛋白酶或酸性蛋白酶，调整pH6.0‐8.0，50℃水浴中孵育1‐3h，进行酶解；
(3)将活化的培养液，以108CFU/ml的浓度加入预先酶解的培养液中，于37℃下培养30‐50h，获得终发酵液；
(4)离心过滤菌液，获得无细菌的上清液；
(5)上清液经薄层层析和高效液相色谱分析后，当上清液GABA的含量在29.43g/L及以上时，所述终发酵液即为富含GABA的食用溶液。
在一个实施方案中，还包括步骤(6)将所有终发酵液进行离心，获得无乳杆菌的食用溶液。在一个具体实施方案中，所述无乳杆菌的食用溶液是用于制作酸豆奶、酸奶豆腐、豆清液饮料、豆清液酸汤的溶液。
本发明第四个发明目的是提供所述诱变菌株与下列任意一种或多种诱变乳酸菌株进行复配，以生产富含GABA的保健食用溶液的方法，步骤包括：
(1)将保藏的诱变菌株分别进行活化培养，其中，活化培养基选自MRS液体培养基，其他诱变株选自干酪乳杆菌(Lactobacillus casei strain)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus strain)、肠膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroidesstrain)和玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae strain)；
(2)在豆浆、豆清液或米浆、豆酸奶或食用酸汤中加入0.1‐0.2％重量的碱性蛋白酶或酸性蛋白酶，于pH6.0‐8.0，50℃水浴中孵育1‐3h，进行酶解；
(3)将活化的诱变菌株培养液，加入预先酶解的培养液中，于37℃下培养30‐50h，获得终发酵液，其中植物乳杆菌的加入量为108CFU/ml的浓度，另外4种菌种的加入量为107CFU/ml的浓度；
(4)离心过滤菌液，获得无细菌的上清液；
(5)经薄层层析和高效液相色谱检测上清液，当酸度达到35.89g/L及以上时，所述终发酵液即为富含GABA的食用溶液。
在一个实施方案中，上述步骤(1)中同时加入植物乳杆菌KJY12、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei strain)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus strain)、玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae strain)、肠膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroidesstrain)。
在一个具体实施方案中，所述鼠李糖乳杆菌选自鼠李糖乳杆菌KJY11，保藏号为CGMCC No.15421，保藏日期为2018年03月07日。
在另一具体实施方案中，所述植物乳杆菌诱变菌株KJY12，保藏号为CGMCCNo.15422，保藏日期为2018年03月07日。
在一个具体实施方案中，所述玉米乳杆菌选自玉米乳杆菌KJY13，保藏号为CGMCCNo.15423，保藏日期为2018年03月07日。
在另一具体实施方案中，所述干酪乳杆菌选自干酪乳杆菌(Lactobacillus caseistrain)KJY14，保藏号为CGMCC No.15424，保藏日期为2018年03月07日。
在其他具体实施方案中，所述肠膜状明串珠菌选自肠膜状明串珠菌(Leuconostocmesenteroides strain)KJY15，保藏号为CGMCC No.15425，保藏日期为2018年03月07日。
本发明第五个目的是提供诱变的植物乳杆菌和/或多种诱变乳酸菌株用于制备食品凝固剂的方法，步骤包括：
(1)将诱变的植物乳杆菌和/或多种诱变乳酸菌株在MRS液体培养基扩大培养后，获得为活菌密度为108‐109CFU/mL的种子培养液；
(2)将种子培养液按3％(v/v)接种量接入预灭菌的豆清液中，于36～38℃下发酵48‐96hh，而后加入无菌的醋酸，将pH调至2.5‐5.0获得液体凝固剂。
在一个实施方案中，步骤还包括：(3)将所述液体凝固剂进行冷冻干燥处理，获得粉状的固体凝固剂。
在另一个实施方案中，所述食品是豆腐、豆花、酸奶或酸汤或酸豆奶。
在另一实施方案中，所述在诱变株选自鼠李糖乳杆菌KJY11、植物乳杆菌诱变菌株KJY12、玉米乳杆菌KJY13、干酪乳杆菌KJY14、肠膜状明串珠菌KJY15。在一个具体实施方案中，植物乳杆菌诱变菌株KJY12、玉米乳杆菌KJY13、鼠李糖乳杆菌KJY11、干酪乳杆菌KJY14、肠膜状明串珠菌KJY15的接种比例分别为(1‐10):1:1:1:1。在优选的实施方案中，当所述接种比例为(5‐10):1:1:1:1时，所制备的凝固剂可用于制备富含GABA的保健食品。
本发明第六个目的是提供上述方法所制备的食品凝固剂。
本发明第七个目的是提供上述食品凝固剂用于凝固液体食品的方法，步骤包括：
(1)将豆浆、豆清液或牛奶于65‐72℃下进行加热，然后冷却至36‐40℃；
(2)加入1‐5％(v/v)液体凝固剂或0.01‐0.05％(m/m)的固体凝固剂，以80‐100r/min的速度搅拌，直至产生絮状物或碎花状物或胶凝状物，从而制备酸豆奶、酸奶豆腐或酸豆腐、豆清液饮料、豆清液酸汤。
在一个实施方案中，还包括步骤(3)根据所制备的凝固食品类型，选择凝固深化的持续时间，如豆腐的持续时间为20‐30min，酸汤的持续时间为72小时。
在另一实施方案中，所述在诱变株选自玉米乳杆菌KJY13、鼠李糖乳杆菌KJY11、植物乳杆菌诱变菌株KJY12、干酪乳杆菌KJY14、肠膜状明串珠菌KJY15。在一个具体实施方案中，植物乳杆菌诱变菌株KJY12、玉米乳杆菌KJY13、鼠李糖乳杆菌KJY11、干酪乳杆菌KJY14、肠膜状明串珠菌KJY15的接种比例分别为(1‐10):1:1:1:1。在优选的实施方案中，当所述接种比例为(5‐10):1:1:1:1时，所制备的凝固剂可用于制备富含GABA的保健食品。
原理和定义
微生物诱变指通过人为措施诱导微生物的基因产生变异或突变，从而筛选符合需要性状的微生物。对于微生物进行诱变的方法主要包括物理诱变(辐射或照射法)、化学诱变(化学诱变剂)、生物诱变(基因工程突变)。
物理诱变以紫外照射为主，即将微生物悬浮液在搅拌的情况下，置于紫外灯下短时间照射，并迅速置于低温中水浴。通过低温抑制微生物的自身修复，以增加突变几率。而后，多次照射后，与野生菌落对照同时进行培养，观察不同照射时间和照射强度的平板的菌落数，计算诱变后的菌株致死率。
除了放射性辐射诱变外，物理诱变还包括微波辐射法，即通过微波辐射进行诱变该方法能引起细胞壁分子间的强烈震动，通过摩擦改变其通透性，使细胞内含物迅速向胞外渗透。利用微波辐照改变细胞壁通透性，让微波作用于微生物DNA、RNA从而引起变异，以达到研究目的。相比于放射性辐射诱变，虽然诱变时间较长、处理样本量小，但其具有安全可靠、易于精细化控制和成本低廉、操作便利的优点，因此成为微生物诱变的研究热点。
常用的化学诱变剂包括亚硝基胍(NTG)、硫酸二乙酯等。均是直接将诱变剂以不同浓度梯度加入微生物悬浮液中，进行不同时间的培养。培养结束后，用生理盐水或其他终止剂终止诱变反应，并迅速置于低温中水浴。多次诱变后，与野生菌落对照同时进行培养，观察不同时间和诱变浓度的平板的菌落数，计算诱变后的菌株致死率。
技术效果
GABA主要是通过谷氨酸脱羧酶(GAD)催化谷氨酸转化而成的。研究发现，乳酸菌、霉菌、酵母菌以及其他微生物中含有这种酶，可通过提取出GAD催化谷氨酸转化或微生物发酵来生产GABA。近年来，从食品安全级微生物来生产GABA成为研究热点。其中，乳酸菌是一种食品安全级的微生物具有巨大的市场开发潜力。
乳杆菌合成GABA的机制在于：乳杆菌在发酵过程中产生乳酸，造成较低的pH环境，这种环境不利于乳杆菌的生长，而GAD活性恰在低pH下得到激发，催化脱羧反应。在此过程中，L‐谷氨酸由细胞外运输至膜内，在胞内GAD的催化下消耗1个H+生成GABA并释放出CO2。细胞内的谷氨酸脱羧消耗H+，造成细胞膜两侧pH压差和质子势差，而这种质子作用力可促使L‐谷氨酸向胞内运输，CO2向外自由扩散则使循环不可逆的进行下去。
鉴于植物乳杆菌KJY12、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei strain)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus strain)、玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae strain)、肠膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides strain)的食品安全级以及突变耐受能力的相似性，在使用类似方法获得突变菌株的情况下，可用于制备相同的目的产物，能最大程度发挥各种诱变菌株益生菌的复合功能。
因此，本发明的技术效果在于：
1、本发明首次提出利用复合诱变法联合重复诱变技术来获得高产GABA的植物乳杆菌的技术构思，并通过一系列的实验摸索，确定了最合适的的诱变参数，并成功获得一株高产菌株，为今后对于其他高产乳杆菌的可行性方法提供了技术启示。
2、本发明针对工业生产中常见的廉价发酵原料(如豆浆、豆清液等)，在上述高产GABA的诱变菌株的基础，通过实验摸索优化发酵工艺条件，从而获得适宜的发酵方法，
3、由于本发明所用的菌株及其复配菌株，均是食品中益生菌。因此本发明可以将终发酵液、上清液作为添加剂，直接加入食品原料中进行生产相关食品。
4、发明首次发现，由于植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、玉米乳杆菌和肠膜状明串珠菌均属于乳酸菌类别的菌株，在理化特性和耐受机制存在相似之处。由此，摸索出以上5种菌株都类似的复合诱变方法，并首次尝试将5种诱变菌株混合发酵以生产GABA，在保证植物乳杆菌合成GABA适宜产量的基础上，能够发挥多种食品安全级的微生物产GABA的协同效应，并能发挥5种益生菌对人体有益的协同效应，从而获得预料不到的技术效果。
5、本发明在不优化其他显著正效应的因素的情况下，该诱变菌株KJY12能在2‐5％(质量分数)的谷氨酸的MRS培养基中，GABA的产量约12.75‐31.88g/L，底物摩尔转换率约91‐93％，且发酵过程为普通发酵过程。并且本发明的该诱变菌株KJY12在预酶解的豆清液或豆浆、豆清液或米浆的培养基发酵后氨基丁酸产量为29.43g/L以上。
6、本发明的诱变菌种，还能用于作为(复合)凝固剂来生产酸奶、酸豆浆、豆花、酸奶豆腐等。该食用级凝固剂能够避免传统凝固剂中的氯化镁、氯化钙、硫酸钙的食品残留，提高口感，并能发挥(复合)凝固剂中益生菌的有益作用，以及乳酸的预防和治疗疾病的作用，符合绿色天然、安全健康的食品发展趋势。
附图说明
图1：微波辐照诱变时间与致死率变化曲线图；
图2：微波辐照诱变时间与突变率变化关系图；
图3：亚硝基胍诱变时间与致死率变化曲线图；
图4：酸性条件下，植物乳杆菌诱变株在豆清液中发酵的生长曲线图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步的详细说明。对于所属技术领域的技术人员而言，从对本发明的详细说明中，本发明的特征和优点将显而易见。
实施例1、实验材料
出发菌株：
1、植物乳杆菌为本公司冻藏菌株Lp20160820。
2、鼠李糖乳杆菌：选自诱变菌株鼠李糖乳杆菌KJY11，保藏号为CGMCC No.15421，保藏日期为2018年03月07日。
3、玉米乳杆菌：选自诱变菌株玉米乳杆菌KJY13，保藏号为CGMCC No.15423，保藏日期为2018年03月07日。
4、干酪乳杆菌：选自诱变菌株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei strain)KJY14，保藏号为CGMCC No.15424，保藏日期为2018年03月07日。
5、肠膜状明串珠菌：选自诱变菌株肠膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroidesstrain)KJY15，保藏号为CGMCC No.15425，保藏日期为2018年03月07日。
6、MRS液体培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖20g/L，乙酸钠5g/L，吐温‐80 1g/L，柠檬酸三钠2g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁0.1g/L，硫酸锰0.1g/L，pH值为6.5～6.8；121℃，15min灭菌备用。
7、MRS固体培养基：即MRS液体培养基中加入2％琼脂粉；
8、GYP种子培养基：葡萄糖10g、酵母膏10g、蛋白胨5g、无水乙酸钠2g、硫酸镁0.02g、硫酸锰1Lg、硫酸亚铁1Lg、氯化钠1Lg、蒸馏水1L，pH6.8。
9、GYP发酵培养基:向GYP种子培养基中加入2％、5％、8％(质量分数)的谷氨酸。
10、筛选用梯度平板：将MRS固体培养基倒入平板培养皿，倾斜15℃左右放置，待凝固后倒入含产物GABA的固体培养基放平冷凝后形成梯度平板。
实施例2、微波诱变植物乳杆菌
将冻存的植物乳杆菌株分别在MRS液体培养基中经过二次活化后，然后用浓度梯度法在MRS固体培养基上进行涂布。37℃下厌氧培养20‐30h，在进行平板计数法，选择具有明显溶钙圈的单个菌落进行划线纯化。最后得到的单个菌落纯化3代。
收集菌种并稀释成107/ml的菌悬液，置于功率500W的微波炉，辐照时间分别为10、20、30、40、50、60、70、80、90s，每隔10s取出用冰浴10s消除微波的热效应，避光4℃冷藏12h后，涂布MRS固体培养基平板上，37℃培养24h，进行菌落计数，计算致死率。
采用500功率照射乳杆菌的菌悬液，致死率与照射时间的关系如图1所示。
致死率(％)＝(未诱变处理的总菌数－诱变处理后的存活菌数)/未诱变处理的总菌数×100
可以看出，随着微波时间的增加，致死率逐渐增大，当微波处理50s时，致死率为75.2％，微波处理60s时，致死率为94.6％而当微波辐照处理70s时，致死率为100％。
统计出发菌株菌落(边缘整齐，表面光滑，中心突起，乳白色，质地均匀，平均直径3mm)和诱变菌株菌落平均直径和形状不规则性，确定比出发菌株的菌落直径增加且出现不规则圆形但颜色不变的诱变菌株为正突变株，从而确定菌落直径比例变大且形状出现不规则的诱变株为正向突变株。由此计算对于不同微波诱变时间下植物乳杆菌的正突变的研究。
由图2可知，当微波辐照60s时，正突变率较大，有利于诱变的菌株的筛选。
因此，根据诱变机制，强烈的诱变剂和较高的剂量处理诱变菌株，菌株突变可能性大，因此选用60s为下一步试验诱变辐射时间。
按照上述步骤，对已活化的菌悬液进行微波辐照处理60s，然后取辐照菌液1ml稀释后，涂布到筛选用梯度培养平板上，于37℃培养1天。选取生长迅速、边缘圆滑、相对较厚处生长的乳白色单菌落置于MRS液体培养基进行培养。
实施例3、亚硝基胍诱变
亚硝基胍(NTG)：取0.1g亚硝基胍加入10mL丙酮作为助溶剂，完全溶解后取1mL亚硝基胍丙酮溶液加入9mL磷酸钠缓冲液(pH7.4，0.02mol/L)配制成NTG浓度为1mg/mL的亚硝基胍母液。
收集培养的植物乳杆菌，并稀释成108/ml的菌悬液。然后取8mL菌悬液，加入亚硝基胍母液2mL，NTG终浓度为200μg/mL，同时设置未诱变原液作为对照。
将上述菌液置三角瓶中，摇床振荡37℃培养分别避光孵育10、15、20、25、30、35、40、45、50min后，分别加入生理盐水终止反应；诱变处理后的菌液冰浴2～3h以诱导正突变后，于4000r/min室温离心15min。取菌体沉淀，用pH 6.0磷酸缓冲液离心洗涤2次后，用冷生理盐水十倍梯度稀释菌体沉淀至7倍梯度，分别取0.1mL涂布于含2％(质量分数)碳酸钙的MRS固体培养基上，37℃恒温避光静置培养48h。观察各梯度培养皿菌落数，计算NTG诱变的致死率。结果如下图3所示
由图3可知，当菌悬液用NTG 100μg/mL的NTG诱变处理不同时间，致死率结果如图3所示，随诱变处理时间的延长，致死率不断增加，在处理45min时，致死率达到89.2％。
按照实施例2的方法，统计出发菌株和诱变菌株的菌落平均直径和明显溶钙圈的平均直径，确定比出发菌株的菌落直径和明显溶钙圈有增加但颜色不变的诱变菌株为正突变株。
综合致死率和正突变率的实验结果，选择200μg/mL和诱导45min作为亚硝基胍的最佳诱导参数。
按照上述步骤，对已活化的菌悬液进行200μg/mL亚硝基胍的诱导45min，然后取辐照菌液1ml稀释后，涂布到筛选用梯度培养平板上，于30℃培养2‐3天。
选取生长迅速、边缘圆滑、相对较厚处生长的乳白色单菌落置于MRS液体培养基进行培养。然后取对数生长期的菌液，离心收集后，再置于含2％碳酸钙的MRS固体培养基筛选，挑选生长迅速、明显溶钙圈有增加但颜色不变的单菌落，以完成复筛。以此方法，进行至少10代复筛，然后将生化性状稳定的菌株进行保藏。
按照以上方法，再进行微波连续诱变2代‐复筛‐亚硝基胍连续诱变2代‐复筛，其中每次诱变后至少进行3代复筛，虽然微波诱变率较高，但二次诱变对菌株致死率大，因此微波重复诱变的菌株浓度需调整至108/ml的菌悬液。
实施例4、重复复合诱变和筛选GABA高产乳杆菌
前后共进行3组实验，从中选择生长形状最良好的13个菌落，将上述保藏的多个菌株分别单一接种于MRS液体培养基中，37℃下活化培养24h，以2％(体积分数)接种量转接与GYP种子培养基中，37℃下继续培养24h；然后将培养液按2％(体积分数)接种量接种于100mL GYP发酵培养中，37℃下培养24‐48h，取发酵液5mL于沸水浴中煮沸5min，冷却后离心并保留上清；清液经薄层层析定性分析，确定目的产物。
GABA定量分析(高效液相色谱分析)：
(1)衍生试剂：将10mg OPA、20μlβ巯基乙醇溶于2.5mL乙腈中；
硼酸缓冲液：将2.47g硼酸溶于100mL双蒸水，用40％(质量分数)氢氧化钠溶液调pH10.4；
乙酸钠缓冲液：将1.64g无水乙酸钠溶于1L双蒸水，加入200μL三乙胺，用冰醋酸调至pH7.3。
(2)吸取OPA 80μL、硼酸缓冲液400μL、发酵上清液80μL，混合均匀并在室温下反应5min，待样品衍生后，取样20μL进样。
(3)色谱条件为以20％乙腈的醋酸钠缓冲液作为流动相，检测波长238nm，流速0.8mL/min，C18色谱柱(250mm*4.6mm，3μm)，柱温40℃。
(4)将GABA标品配制成不同浓度，以GABA浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
17株诱变菌株的GABA产率如下：另设未诱变出发菌株为对照
如上表可知，诱变株IR‐NTG‐3‐35，其在含2‐5％的底物谷氨酸的GYP发酵培养基中，GABA的产量约12.75‐31.88g/L，底物摩尔转换率约91‐93％。其相比于未诱变的出发菌株，GABA产量和底物摩尔转换率均提高了近3倍。
实施例5、诱变株的生理生化特性测试和分子鉴定
(一)生理生化特性测试
挑取单个菌落进行划线纯化，纯化3～4代，并通过表观判断与镜检确定其菌落形态和菌体形态，并进行4℃菌种斜面保存。
生理生化特性测试结果如下
(二)分子鉴定
提取菌株细胞总DNA，以通用引物扩增菌株的16S rRNA的部分基因片段，插入测序载体后进行测序，并于NCBI数据库进行比对。
比对结果如下：
另外，基于16S rRNA基因序列构建的菌株系统发育树如下：
根据上述测定结果，表明其与上述多个植物乳杆菌的部分序列均保持一致，且与生理生化特征结果相一致，故将该诱变菌株定名为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)KJY12，简写为KJY12。2018年03月07日，将该KJY12进行保藏，保藏号为CGMCCNo.15422，保藏日期为，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
(三)菌种在豆清液中的生长
在酸性条件(pH2.5‐5.0)下，将诱变菌种在豆清液中进行发酵培养，每2h检测OD值，以确定菌种活菌数。
如图4所示，随着时间的增长，诱变菌种的活菌数逐渐增加，在14h达到峰值，随后进入平稳的生长期。这表明，诱变的植物乳杆菌在豆青液中能够良好快速的生长，并且长时间持续保持高速平稳的生长状态。
实施例6、诱变菌株对GABA的转化能力的分析
根据李理(产γ‐氨基丁酸乳酸菌及其应用)和黄桂东(产γ‐氨基丁酸植物乳杆菌MJ0301培养基的优化)的报道，选择葡萄糖、氮源和底物等三因素来确定发酵培养的优化条件。
通过实验，确定优化的发酵培养基成分为：葡萄糖12.0g/L、氮源30g/L(蛋白胨15g/L、酵母浸膏15g/L)、L‐谷氨酸50g/L或80g/L、柠檬酸三胺2g/L、磷酸氢二钾2g/L、丁二酸钠4g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸锰0.05g/L，用醋酸调整pH至4.8。
将菌株KJY12接种于MRS液体培养基中，37℃下活化培养24h，以2％(体积分数)接种量转接与GYP种子培养基中，37℃下继续培养24h；然后将培养液按2％(体积分数)接种量接种于100mL优化的发酵培养基中，37℃下培养72h，取发酵液5mL于沸水浴中煮沸5min，冷却后离心并保留上清。
上清液根据实施例4的方法，进行高效液相色谱分析GABA的转化率，或采用氨基酸自动分析仪直接分析，并平行设置出发菌株对照。
底物摩尔转化率公式＝(实际转化成GABA的摩尔数/理论转化成GABA的摩尔数)×100％。
转化结果如下表所示。
由此可见，在优化的发酵条件下，本发明的诱变菌种的转化能力提高近55％，预示着该菌株能够高效生产GABA及其相关产品中。
实施例7、多种诱变菌株生产富含GABA的食品
复配菌株：
鼠李糖乳杆菌选自鼠李糖乳杆菌KJY11，保藏号为CGMCC No.15421，保藏日期为2018年03月07日。
植物乳杆菌诱变菌株KJY12，保藏号为CGMCCNo.15422，保藏日期为2018年03月07日。
玉米乳杆菌选自玉米乳杆菌KJY13，保藏号为CGMCC No.15423，保藏日期为2018年03月07日。
干酪乳杆菌选自干酪乳杆菌(Lactobacillus casei strain)KJY14，保藏号为CGMCC No.15424，保藏日期为2018年03月07日。
肠膜状明串珠菌选自肠膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides strain)KJY15，保藏号为CGMCC No.15425，保藏日期为2018年03月07日。
在豆浆中加入0.2％重量的碱性蛋白酶，于pH6.0‐8.0，50℃水浴中孵育1‐3h，进行酶解。然后将活化的诱变菌株培养液，分别单独加入预酶解的豆浆培养液中，于37℃下静置培养40h，获得终发酵液，并分别测定各菌株的产BABA能力。结果如下表5所示。
注：肠膜明串珠菌属于风味改善菌，用于降低豆腥味成分，基本上无产GABA的能力。
按照以上方法，将复配混合菌株，分别一起接种到预先酶解的豆浆培养液、豆清液培养液、豆酸奶发酵液、酸汤(苗侗族)中，其中植物乳杆菌的加入量为108CFU/ml的浓度，另外4种菌种的加入量为107CFU的浓度，所测得发酵液中GABA产量分别为39.56g/L、35.89g/L、43.72g/L、40.83g/L。复配混合发酵的GABA产量并未呈现产量叠加的结果，可能原因是5种乳酸菌的产物之间存在竞争性，另外因豆酸奶、酸汤的营养成分强于豆清液培养液而产量优于后者产量。
实施例7、诱变菌种生产用于食品的凝固剂
分别取上述诱变的鼠李糖乳杆菌KJY11、植物乳杆菌诱变菌株KJY12、玉米乳杆菌KJY13、干酪乳杆菌KJY14、肠膜状明串珠菌KJY15，接种于20mL MRS液体培养基中，37℃活化培养24h。
然后，按接种量3％(v/v)接种至500ml的MRS液体培养基中，37℃扩大培养至获得为活菌密度为108‐109CFU/mL的种子培养液；
将种子培养液按1％(v/v)接种量接入预灭菌的豆清液中，于36～38℃下发酵48‐96h，而后加入无菌的醋酸，将pH调至2.5‐5.0、优选3.5‐4.0，即获得液体凝固剂。
考虑到种子培养液中活菌密度为108‐109CFU/mL为菌种最佳生长时期，在相同培养条件下，各种诱变菌种的生长的活菌密度并不完全一致，因此调整植物乳杆菌诱变菌株KJY12、玉米乳杆菌KJY13、鼠李糖乳杆菌KJY11、干酪乳杆菌KJY14、肠膜状明串珠菌KJY15的接种比例分别为10:1:1:1:1，或1:1:1:1:1，以确保分别获得用于生产主要富含GABA的凝固食品的凝固剂，和生产主要富含多种益生菌的食品的凝固剂。
将获得的液体凝固剂中，通过离心分离菌体，然后用适量的无菌生理盐水重悬浮后，重新分离纯化菌体后，在重悬液中加入终浓度为7.5％(m/v)的葡萄糖或麦芽糊精作为保护剂，先放入4℃平衡30min，然后放置‐40℃中进行预冷冻20h。冷冻完成后放入真空冷冻干燥机中，设置温度‐50℃，抽真空(20～40Pa)，干燥24h，制得粉状固体凝固剂。使用时，重新复水溶解即可。
实施例8、诱变菌种用于凝固液体食品的生产方法
1、制作豆花或酸豆浆
将优质黄豆清洗后，充分泡涨。通过使用浆渣分离器磨浆，并加热，获得熟豆浆。
熟豆浆冷却至36‐40℃，然后匀速流加加入3％(v/v)液体凝固剂，以80r/min的速度搅拌，直至产生絮状物或碎花状物。然后降低搅拌速度，直至出现大面积的絮状物或碎花状物。低温保存，即得豆花。或持续发酵1‐4小时，以制备酸豆浆。
2、制作(酸)豆腐
在方法1的基础上，继续搅拌豆浆25min以便凝固深化，直至块状增大至不变且水固分离时，保温养浆20min，再大火加热至微沸1min，用重物压制蹲脑20‐30min。
然后将蹲脑后豆腐倒入铺好豆腐布的型框中，包严网布、覆平、自沥后重物压力下加压3h，确保豆腐良好的外形和质构，压制成形后即为酸奶味豆腐成品。
3、制作酸奶
将新鲜牛奶于70度左右加热杀菌后，冷却至40度。
匀速流加加入0.02％(m/m)的固体凝固剂，以90r/min的速度搅拌，直至产生凝胶状物。然后降低搅拌速度，直至出现大量凝胶。低温保存，即得酸奶。
4、制作苗侗族酸汤
在方法1的基础上，将含有絮状物或碎花状物的豆浆液，于38℃下深化发酵72小时，即可得到酸汤原液。
预先制备西红柿浆、辣椒粉、食盐、白酒的混合溶液，加入适量1‐5％(v/v)酸汤原液，厌氧发酵5‐10天。即可制得食用的苗侗族酸汤。
相对于普通豆花、酸奶、酸豆腐等，本发明的凝固剂制备出的食品，具有保水性好、质地细腻(如酸奶豆腐)、口味清淡略带酸甜(如酸豆浆、酸奶)，香味浓厚(如酸汤)，营养丰富。
另外，由于上述食品含有多种益生菌，能够提高胃肠道的免疫力，并且所富含的GABA，能缓解心脑血压、抑制脂肪肝及肥胖症、活化肝功能，又能促进人体内氨基酸代谢的平衡，调节免疫功能。
应当理解，本发明虽然已通过以上实施例进行了清楚说明，然而在不背离本发明精神及其实质的情况下，所属技术领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的变化和修正，但这些相应的变化和修正都应属于本发明的权利要求的保护范围。
Claims (4)
1.一种通过复合诱变技术而获得的高产氨基丁酸的植物乳杆菌诱变菌株（Lactobacillus plantarum）KJY12，保藏号为CGMCC No. 15422，保藏日期为2018年03月07日，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.通过如权利要求1所述的菌株，生产富含GABA的食用溶液的方法，包括：
（1）将保藏的植物乳杆菌KJY12于MRS液体培养基中活化培养；
（2）在豆浆、豆清液或米浆、豆酸奶或食用酸汤中加入0.1-0.2%重量的碱性蛋白酶或酸性蛋白酶，调整pH6.0-8.0，50℃水浴中孵育1-3h，进行酶解；
（3）将活化的培养液，以108CFU /ml的浓度加入预先酶解的培养液中，于37℃下培养30-50h，获得终发酵液；
（4）离心过滤菌液，获得无细菌的上清液；
（5）上清液经薄层层析和高效液相色谱分析后，当上清液GABA的含量在29.43g/L及以上时，所述终发酵液即为富含GABA的食用溶液，和/或
（6）将所有终发酵液进行离心，获得无乳杆菌的食用溶液；
3.权利要求2的方法，其中所述无乳杆菌的食用溶液是用于制作酸豆奶、酸奶豆腐、豆清液酸汤的溶液。
4.通过如权利要求1所述的菌株，与下列任意一种或多种诱变乳酸菌株进行复配，以生产富含GABA的保健食用溶液的方法，步骤包括：
（1）将保藏的诱变菌株分别进行活化培养，其中，活化培养基选自MRS液体培养基，其他诱变株选自鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus casei strain）KJY11、植物乳杆菌诱变菌株（Lactobacillus plantarum）KJY12、玉米乳杆菌（Lactobacillus zeae strain）KJY13、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei strain）KJY14、肠膜状明串珠菌（Leuconostocmesenteroidesstrain）KJY15；
（2）在豆浆、豆清液或米浆、豆酸奶或食用酸汤中加入0.1-0.2%重量的碱性蛋白酶或酸性蛋白酶，于pH6.0-8.0，50℃水浴中孵育1-3h，进行酶解；
（3）将活化的诱变菌株培养液，加入预先酶解的培养液中，于37℃下培养30-50h，获得终发酵液，其中植物乳杆菌的加入量为108CFU/ml的浓度，另外4种菌种的加入量为107CFU/ml的浓度；
（4）离心过滤菌液，获得无细菌的上清液；
（5）经薄层层析和高效液相色谱检测上清液，当酸度达到35.89g/L及以上时，所述终发酵液即为富含GABA的食用溶液。
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- 2018-09-04 CN CN201811027317.9A patent/CN109182171B/zh active Active
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