CN101928679A - 一株高效转化L-谷氨酸为γ-氨基丁酸乳酸菌的选育 - Google Patents
一株高效转化L-谷氨酸为γ-氨基丁酸乳酸菌的选育 Download PDFInfo
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Abstract
一株高效转化L-谷氨酸为γ-氨基丁酸乳酸菌株的选育，属于生物工程中发酵技术领域。本发明筛选的菌株，分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GB 01-21，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCM 209102。从自制酸菜中筛选出一株能利用L-谷氨酸生产γ-氨基丁酸的乳酸菌，命名为LP-GB 01，以此菌株作为出发菌株；经紫外诱变后筛选得到一株正突变株，命名为LP-GB 01-21。在100mL三角瓶中进行初步转化实验，停止转化后，利用氨基酸测定仪测定转化液中的γ-氨基丁酸，其浓度为51.9g/L，摩尔转化率达到了92.7％。在5L发酵罐放大转化实验，最终获得γ-氨基丁酸浓度为132g/L，摩尔转化率为94.3％。这为微生物法生产γ-氨基丁酸的工业化提供了基础。
Description
技术领域
一株高效转化L-谷氨酸为γ-氨基丁酸乳酸菌的选育，属于生物工程中发酵技术领域。
背景技术
γ-氨基丁酸又名4-氨基丁酸(4-Aminobutanoicacid，4-AB，简称GABA)和γ-氨酪酸，是在丁酸的γ位上有一个氨基，以非结合态的形式存在。它极易溶于水，不溶于醇、醚和苯，可以通过化学法或生物合成，也可从食品中直接摄取得到补充。广泛存在于自然界，是一种非蛋白质组成的天然氨基酸，由谷氨酸(Glutamic acid，Glu)经谷氨酸脱羧酶(Glutamatedecarboxylase，EC4.1.1.15，简称GAD或GDC)催化而来，以自由态形式广泛存在于原核生物和真核生物中。是哺乳动物中枢神经系统中的重要的抑制性神经递质，具有重要的生理功能，已报道的生理活性有调节血压、促使精神安定、促进脑部血流、增进脑活力、增加生长激素分泌、健肝利肾、预防肥胖、镇痛、解毒、促进乙醇代谢(醒酒)、改善更年期综合症等多种功效。
作为一种化学物质来说，早在1883年GABA就被人工合成。1950年有人发现哺乳动物正常脑内的GABA的浓度很高，但生理意义不明。随后，有人从牛脑中提取出一种能抑制螯虾牵张感受器神经元产生冲动提取液，发现其具有抗乙酰胆碱及对脉鼠和家兔的回肠有收缩作用，并证明此提取液中起抑制作用的组分就是GABA。Segal SA等又证实GABA对哺乳动物的中枢神经具有普遍抑制作用，将用离子电泳分离得到的GABA注射于猫皮层十字沟周围的神经元，可引起神经元的超极化，其电位与刺激皮层表面突触所产生的抑制性电位相同，并发现用电刺激猫的小脑浦氏细胞时第四脑室灌流液中的GABA含量增加3倍，因而推测浦氏神经元释放的化学递质是GABA。但是，GABA的意义和作用被真正确认是在1975年的第二届国际GABA专题讨论会上。在那次会议上，GABA被正式确认为哺乳动物中枢的一种抑制性递质。
由于GABA有很高的生理功能和广阔的应用前景，已受到世界学术和企业界越来越多的注意和研究。欧美和日本等少数发达国家有很多研究人员从事GABA的研制开发工作，并在其生理功效方面的研究处于领先水平。
本发明筛选到高效转化L-谷氨酸为γ-氨基丁酸的菌株，对该菌进行了鉴定，对其转化条件进行了初步研究，为微生物转化L-谷氨酸为γ-氨基丁酸工业化提供了基础。
发明内容
本发明的目的在于提供：从自制酸菜中筛选到转化L-谷氨酸为γ-氨基丁酸的菌株，经紫外诱变后筛选得到高产γ-氨基丁酸的菌株，并对其进行了形态学与遗传学方面的鉴定，将该菌命名为LP-GB 01-21。对转化产物γ-氨基丁酸进行了鉴定，为微生物转化L-谷氨酸为γ-氨基丁酸的工业化提供了有益的指导。
本发明的技术方案：一株转化L-谷氨酸为γ-氨基丁酸的菌株，其分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)GB 01-21，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM 209102。
目的菌株的鉴定：采用16S rDNA测序，与数据库对照后鉴定该菌为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum。
转化菌株的筛选：从自制酸菜取样，分离进行初步筛选，斜面保藏。把培养好的斜面种子活化后接种于种子培养基中，在30℃，静置培养1d，离心收集菌体，用灭菌水洗涤菌体。在100mL三角瓶中加入湿菌体0.5g，L-谷氨酸2.4g，0.2mol/L醋酸缓冲液(pH＝5.0)30mL，吐温-80 0.01g。于30℃、160r/min振荡反应24h，氨基酸测定仪测定转化液中的γ-氨基丁酸含量。将转化率高的留下进一步实验，复筛得到一株转化效果较好的菌株，命名为LP-GB01，并对其进行鉴定。通过进行形态观察、生理生化实验及分子生物学鉴定，确定了该菌的分子水平的生物学地位。以该菌作为出发菌株进一步经紫外诱变筛选得到一株高产γ-氨基丁酸的菌株，命名为LP-GB 01-21。
所述菌株LP-GB 01-21的诱变选育方法，步骤为：
(1)转化菌株的筛选：从自制酸菜取样，稀释至不同的浓度，分别吸取0.2mL不同浓度的菌悬液涂布于选择性平板培养基上，肉眼挑出生长并有透明圈的单菌落，转接于斜面培养基保藏，以此野生菌株LP-GB 01作为出发菌株；
(2)出发菌株生长曲线与紫外致死率曲线的制定：诱变培养菌悬液置于15W的紫外灯下，距离照射菌悬液30cm，照射0、15s、30s、45s、60s、75s、90s，制定致死率曲线，选择致死率在70％-90％的时间诱变；
(3)初筛：出发菌株经15W紫外灯下30cm处照射45s，菌悬液经过诱变处理后，稀释涂布于含代谢产物GABA的梯度平板上，30℃下培养1d。肉眼观察，挑出在梯度平板上层培养基的相对较厚处生长的菌落，于斜面保藏；
(4)从平板中挑取单菌落活化后分别接入100mL种子培养基(500mL三角瓶)，30℃培养1d后离心收集菌体，用灭菌水洗涤菌体。在100mL三角瓶中加入湿菌体0.5g，L-谷氨酸 2.4g，0.2mol/L醋酸缓冲液(pH＝5.0)30mL，吐温-800.01g。于30℃、160r/min振荡反应24h，停止转化，氨基酸测定仪测定转化液中的γ-氨基丁酸含量。
所述培养基组成：
(1)乳酸菌分离培养基：牛肉膏10g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖5g/L，吐温0.5g/L，番茄汁200g/L，溴甲酚绿0.1g/L，碳酸钙20g/L，琼脂20g/L，pH 6.5。
(2)菌种保藏活化培养基(MRS培养基)：酪蛋白胨10g/L，牛肉提取物10g/L，酵母提取物5g/L，葡萄糖5g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸二胺0.2g/L，吐温0.1g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，碳酸钙20g/L，琼脂20g/L，pH 6.5。
(3)种子培养基(TYG液体培养基)：蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖10g/L，丁二酸钠5g/L，pH 6.5。
3、用权利要求1所述LP-GB 01-21菌株产γ-氨基丁酸的方法，其特征是GA 01-21在固体培养基以g/L计：酪蛋白胨10g/L，牛肉提取物10g/L，酵母提取物5g/L，葡萄糖5g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸二胺0.2g/L，吐温0.1g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，碳酸钙20g/L，琼脂20g/L，pH 6.5，培养18h，挑取单菌落接种于液体活化培养基以g/L计：酪蛋白胨10g/L，牛肉提取物10g/L，酵母提取物5g/L，葡萄糖5g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸二胺0.2g/L，吐温0.1g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，碳酸钙20g/L，pH 6.5，然后转入种子培养基以g/L计：蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖10g/L，丁二酸钠5g/L，pH 6.5，30℃培养1d后离心收集菌体，用灭菌水洗涤菌体。在100mL三角瓶中加入湿菌体0.5g，L-谷氨酸2.4g，0.2mol/L醋酸缓冲液(pH＝5.0)30mL，吐温-80 0.01g。于30℃、160r/min振荡反应24h，停止转化，氨基酸测定仪测定转化液中的γ-氨基丁酸含量。
(6)氨基酸测定仪对产物进行定性与定量分析：利用氨基酸测定仪分别测定标准样品γ-氨基丁酸和转化液中各物质的出峰时间与峰面积，比较标准样品与转化液各自的出峰时间和峰面积，即可以对转化液中γ-氨基丁酸进行定性定量检测。
本发明的有益效果：从自制酸菜中取样，分离进行初步筛选，斜面保藏，以野生菌株LP-GB 01作为出发菌株；经紫外诱变后筛选得到高产γ-氨基丁酸的菌株LP-GB 01-21，并对其进行了形态学与遗传学方面的鉴定，对该菌的生长条件进行了摸索，结果显示在温度30℃、pH 6.5、静置培养20h达到对数生长期。将生长期的菌体以12％(V/V)的接种量接入种子培养基，在30℃、pH 6.5、静置培养1d后，离心收集菌体，用无菌水洗涤菌体，在100mL三角瓶中加入湿菌体0.5g，L-谷氨酸2.4g，0.2mol/L醋酸缓冲液(pH＝5.0)30mL，吐温-80 0.01g。于30℃，160r/min振荡反应24h，氨基酸测定仪测定转化液中的γ-氨基丁酸含量，为微生物转化L-谷氨酸为γ-氨基丁酸工业化提供了基础。
产品纯度高，转化率高，转化周期短，一般只需24h左右即可转化完全。技术可移植性强，只要一般的发酵车间(如抗生素、维生素、氨基酸生产车间)即可进行生产，不需购置特殊设备和仪器，易于推广应用。
附图说明
图1菌株(Lactobacillus plantarum)GB 01-21电镜图片；
图2氨基酸测定仪测定LP-GB 01摇瓶转化液中底物与产物的含量图谱；
图3氨基酸测定仪测定LP-GB 01-21摇瓶转化液中底物与产物的含量图谱；
图4氨基酸测定仪测定LP-GB 015L发酵罐转化液中底物与产物的含量图谱；
生物材料样品保藏
一株转化L-谷氨酸为γ-氨基丁酸的菌株，其分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)GB 01-21，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2009年5月7日，保藏编号为CCTCC M 209102。
具体实施方式
实施例1：有效转化L-谷氨酸为γ-氨基丁酸的菌株筛选
菌种筛选培养：选用土壤、酸奶、自制酸菜等样品为材料，分别取稀释成不同浓度的汁液0.1mL，无菌涂布到乳酸菌选择培养基平板上，30℃培养1-2d，挑取能产生透明圈，菌落周围培养基变为黄色的单菌落，初步确定为乳酸菌。采用平板划线法在MRS平板上反复多次划线培养，获得纯菌株。将分离纯化后的单菌落接入MRS固体斜面培养基于4℃冰箱保存，每2周转接1次。
乳酸菌分离培养基组成：牛肉膏10g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖5g/L，吐温0.5g/L，番茄汁200g/L，溴甲酚绿0.1g/L，碳酸钙20g/L，琼脂20g/L，pH 6.5。
MRS培养基：酪蛋白胨10g/L，牛肉提取物10g/L，酵母提取物5g/L，葡萄糖5g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸二胺0.2g/L，吐温0.1g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，碳酸钙20g/L，琼脂20g/L，pH 6.5。
微生物转化产GABA能力筛选：筛选得到菌株以12％(V/V)的接种量分别接种于装有100mL种子培养基(MRS培养基)的500mL三角瓶中，30℃、pH 6.5静置培养1d。用100mL离心管离心收集菌体，用生理盐水洗涤菌体后，用30mL醋酸缓冲液(0.2mol/L，pH 5.0)悬浮菌体，加入装有2％的L-谷氨酸(0.6g)及吐温-80 0.01g的100mL的三角瓶中，然后 将三角瓶置于30℃、160r/min条件下震荡培养24h。收集转化液，离心，比色法检测上清液中γ-氨基丁酸的含量。
选取其中4株转化率明显较高的菌株，添加5％底物来进行进一步产GABA能力筛选，利用氨基酸测定仪检测转化液中产物γ-氨基丁酸的含量，选择了一株高产γ-氨基丁酸的菌株，并进行传代稳定性验证确定目的菌株。
实施例2：高产γ-氨基丁酸菌株的紫外诱变筛选
以实施例1中得到的菌株为出发菌株，菌株活化后，菌体用无菌生理盐水(0.85％的NaCl溶液)稀释，紫外线前稀释制成细胞密度为108个/mL的菌悬液；在15W的紫外灯下进行，距离照射菌悬液30cm，通过改变照射时间来获得不同的诱变剂量；制定其生长曲线、紫外致死率曲线，菌悬液经过诱变处理后，稀释涂布于含代谢产物GABA的梯度平板上，30℃下培养1d。肉眼观察，挑出在梯度平板上层培养基的相对较厚处生长的菌落，于斜面保藏。
实施例3：突变菌株的转化能力的研究
将实施例2中筛选得到的菌株在固体培养基(酪蛋白胨10g/L，牛肉提取物10g/L，酵母提取物5g/L，葡萄糖5g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸二胺0.2g/L，吐温0.1g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，碳酸钙20g/L，琼脂20g/L，pH 6.5)上培养18h，挑取单菌落接种于液体活化培养基(酪蛋白胨10g/L，牛肉提取物10g/L，酵母提取物5g/L，葡萄糖5g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸二胺0.2g/L，吐温0.1g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，碳酸钙20g/L，pH 6.5)，然后转接于种子培养基(蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖10g/L，丁二酸钠5g/L，pH 6.5)，培养1d；离心收集菌体，用灭菌水洗涤菌体，在100mL三角瓶中加入湿菌体0.5g，L-谷氨酸2.4g，0.2mol/L醋酸缓冲液(pH＝5.0)30mL，吐温-80 0.01g。于30℃，160r/min振荡反应24h，停止转化，氨基酸测定仪测定转化液中的γ-氨基丁酸含量。选择得到一株高产γ-氨基丁酸的菌株，菌落经鉴定为植物乳杆菌LP-GB 01-21。
如图2和图3所示，转化液中对应的出峰时间为2.525min的物质为L-谷氨酸，对应的出峰时间9.389min的物质为γ-氨基丁酸，原始菌和诱变后的菌株分别以8％L-谷氨酸为底物转化24h后，检测得到诱变菌株的转化液中γ-氨基丁酸含量较原始菌明显提高，γ-氨基丁酸的合成由摩尔生成率来表示。
由表中可以看出菌株诱变后转化能力提高了33.1％。
实施例4：5L发酵罐的转化
用实施例3相同的方法制备在100mL/500mL的MRS培养液中培养的种子按12％的接种量接种于装有3L的无菌TYG液体培养基的5L发酵罐中，于0.2vvm，30℃，静置培养36h，离心收集菌体，用灭菌水洗涤菌体，在5L发酵罐中加入湿菌体，L-谷氨酸500g，0.2mol/L醋酸缓冲液(pH＝5.0)2.5L，吐温-80 1g，于30℃，200r/min振荡反应，氨基酸测定仪测定转化液中的γ-氨基丁酸含量，，结果如图4所示，γ-氨基丁酸浓度为132g/L，摩尔转化率为94.3％。
Claims (4)
1.一株高效转化L-谷氨酸为γ-氨基丁酸乳酸菌的选育，其分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GB 01-21，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 209102。
2.权利要求1所述菌株LP-GB 01-21的诱变选育方法，其特征是：
(1)转化菌株的筛选：从自制酸菜采样，稀释至不同的浓度，分别吸取0.2mL不同浓度的菌悬液涂布于选择性平板培养基上，肉眼挑出生长并有透明圈的单菌落，转接于斜面培养基保藏，以此野生菌株LP-GB 01作为出发菌株；
(2)出发菌株生长曲线与紫外致死率曲线的制定：诱变培养菌悬液置于15W的紫外灯下，距离照射菌悬液30cm，照射0、15s、30s、45s、60s、75s、90s，制定致死率曲线，选择致死率在70％-90％的时间诱变；
(3)初筛：出发菌株经15W紫外灯下30cm处照射45s，菌悬液经过诱变处理后，稀释涂布于含代谢产物GABA的梯度平板上，30℃下培养2d。肉眼观察，挑出在梯度平板上层培养基的相对较厚处生长的菌落，于斜面保藏；
(4)GABA鉴定方法：精确定量分析采用氨基酸自动分析仪法，氨基酸自动分析仪日立835-50型，2619#树脂(阳离子交换柱Φ2.6×150mm)，53℃分析。γ-氨基丁酸标样(Sigma，纯度99.9％以上)，配制10mg/100mL溶液。转化液离心取上清液，加入15％的三氯乙酸终止反应，离心取上清液1mL，送样至江南大学测试中心，采用氨基酸自动分析仪来精确测定转化液中GABA的含量。
(5)转化：从平板中挑取单菌落活化后分别接入100mL种子培养基(500mL三角瓶)，30℃培养1d后离心收集菌体，用无菌水洗涤菌体。在100mL三角瓶中加入湿菌体0.5g，L-谷氨酸2.4g，0.2mol/L醋酸缓冲液(pH＝5.0)30mL，吐温-800.01g。于30℃、160r/min振荡反应24h，停止转化，氨基酸测定仪测定转化液中的γ-氨基丁酸含量。
(6)菌株鉴定：提取出发菌株的基因组DNA，以出发菌株的基因组DNA为模板，使用细菌16S rDNA的通用引物进行扩增，
正向引物为F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
反向引物为R：5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’
PCR方法如下：50μL反应体系加入取DNA模板1μL，10×PCR缓冲液5μL，引物1μL，dNTPs 
Taq DNA聚合酶1μL，总反应体积为50μL。循环参数：94℃预变性5min，94℃1min，60℃2min，72℃2min，30个循环，72℃延伸10min。 取扩增产物10μL用0.8％琼脂糖凝胶电泳，Goldview染色，紫外灯下观测结果。
用胶回收试剂盒纯化PCR扩增产物，电泳验证；连接到pMD18-T载体，转化E.coliJM109。经氨苄抗性筛选，获得阳性克隆。16S rDNA测序由上海生工生物科技有限公司完成，将测序结果在NCBI中与数据库已有序列进行比较分析。
3.所述培养基组成：
(1)乳酸菌分离培养基：牛肉膏10g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖5g/L，吐温0.5g/L，番茄汁200g/L，溴甲酚绿0.1g/L，碳酸钙20g/L，琼脂20g/L，pH 6.5。
(2)菌种保藏活化培养基(MRS培养基)：酪蛋白胨10g/L，牛肉提取物10g/L，酵母提取物5g/L，葡萄糖5g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸二胺0.2g/L，吐温0.1g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，碳酸钙20g/L，琼脂20g/L，pH 6.5。
(3)种子培养基(TYG培养基)：蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖10g/L，丁二酸钠5g/L，pH 6.5。
4.用权利要求1所述LP-GB 01-21菌株生产γ-氨基丁酸的方法，其特征是GA 01-21在固体培养基以g/L计：酪蛋白胨10g/L，牛肉提取物10g/L，酵母提取物5g/L，葡萄糖5g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸二胺0.2g/L，吐温0.1g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，碳酸钙20g/L，琼脂20g/L，pH 6.5，培养18h，挑取单菌落接种于液体活化培养基以g/L计：酪蛋白胨10g/L，牛肉提取物10g/L，酵母提取物5g/L，葡萄糖5g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸二胺0.2g/L，吐温0.1g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，碳酸钙20g/L，pH 6.5然后转入种子培养基以g/L计：蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖10g/L，丁二酸钠5g/L，pH 6.5，30℃培养1d后离心收集菌体，用灭菌水洗涤菌体。在100mL三角瓶中加入湿菌体0.5g，L-谷氨酸2.4g，0.2mol/L醋酸缓冲液(pH＝5.0)30mL，吐温-80 0.01g。于30℃、160r/min振荡反应24h，停止转化，氨基酸测定仪测定转化液中的γ-氨基丁酸含量。
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