CN101195801A

CN101195801A - 灵芝多糖制备设备和制备工艺

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Publication number: CN101195801A
Application number: CNA2007100272896A
Authority: CN
Inventors: 程京燕; 苏保荣; 胡永刚; 余飞; 王寿亮; 徐凤彩
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2007-03-26
Filing date: 2007-03-26
Publication date: 2008-06-11

Abstract

本发明涉及一种利用灵芝菌种发酵提取有效成分的设备和方法，尤其涉及一种从灵芝中提取多糖的设备和工艺。一种灵芝液体深层发酵反应器，其包括进气系统、排气口、取样口和反应罐，进气系统包括空气压缩机、油水分离器、棉碳过滤器和进气管，进气管从反应罐的进气口接入，其中，所述反应罐为高径比为1至4的瓶形容器，瓶形容器口端有瓶塞，所述进气口、排气口和取样口位于瓶塞上。本发明的灵芝液体深层发酵反应器结构极其简单，由于反应罐为一般广口玻璃瓶即可，其体积小。设备成本除供气系统外，只有普通生物反应器的10％，且操作弹性大，温度容易控制，溶氧效率好。

Description

灵芝多糖制备设备和制备工艺

技术领域

本发明涉及一种利用灵芝菌种发酵提取有效成分的设备和方法，尤其涉及一种从灵芝中提取多糖的设备和工艺。

背景技术

灵芝是我国古代劳动人民用之已久的一类珍贵的药用真菌，具有补中、固肾、补肺、止血的功用，对多种慢性病有一定疗效。灵芝多糖对肉瘤S180、肿瘤AH-B，埃利希氏腹水瘤及腺瘤具有明显的抑制活性，并能迅速恢复和提高机体免疫能力，治疗爱滋病的报道更引人瞩目，且几乎无毒副作用，是一种″扶正固体″的滋补强壮剂。同时灵芝还含有大量的微量元素，能促使血液循环畅通，防止色斑、皱纹、血栓的形成，促进细胞新陈代谢，延缓机体的衰老，是一种天然的美容健身佳品。目前在国际市场上，尤其在亚洲的日本、韩国、中国、台湾、香港、东南亚等国家和地区已掀起一股灵芝开发热。灵芝产品已不再局限于药物，而是更多地进入食品、饮料、化妆品、洗涤用品等行业，现在国际上已形成灵芝生产和加工的良性循环，为开拓灵芝产品的国内和国际市场创造了良好的条件并展现出广阔的发展前景。

灵芝及其多糖的广泛应用，市场需求量与日俱增，但目前灵芝多糖的生产几乎都是从子实体中提取，灵芝野生资源缺乏，人工栽培的周期长(2～3个月以上)，占地面积大，又受季节限制，从而影响了灵芝的充分利用，而利用深层培养技术生产灵芝多糖，周期短(7～10d)、成本低、产量大，具有工业化的生产前景。这种技术主要是先对灵芝液体进行深层发酵，然后再从发酵液中提取灵芝多糖。液体深层发酵最初是由美国弗吉尼亚大学生物工程专家Eimerl.Gaden Jr.在20世纪40年代提出的，并设计出培养微生物系统的生物反应器，成为该项技术的权威。1972年日本Shino，Kunihilo等人，利用灵芝发酵菌丝体制成营养饮品。日本Numata Kenji等人将大豆蛋白预先用纤维素酶和蛋白酶处理，再经灵芝发酵后，处理做成新型保健食品，来治疗糖尿病、血压过低等疾病。日本小议等人，利用灵芝发酵菌丝体，再将印第安绣球花茶提取液中加入灵芝进行发酵，经处理，得到灵芝保健饮料。国内于60年代开始进行食用菌液体深层发酵技术的研究。最早是上海植物生理研究所的陈美京等进行了香菇的深层发酵研究。九十年代，国内杨云鹏等研究了薄盖灵芝菌种的深层培养。潘继红等对灵芝液体培养需求作了探讨。2000年，孙东平等人对灵芝发酵的培养基进行了优化，每升发酵液得到干菌丝体15.6g，粗多糖0.72g，并对灵芝胞外多糖进行了分离纯化，并分析了灵芝胞外多糖的组成。在摇瓶发酵条件的基础上，冯小黎等进行了100L气升环流式生物反应器的扩大试验，5d菌体干重可达7～8g/L。随着灵芝液体深层发酵技术研究的深入，人们也注重对深层发酵产物特性及成分的研究。张李阳等对灵芝子实体及其液体深层发酵产物进行的比较研究，发现发酵菌丝体中含有子实体中所具备的组份，但各组份在含量上不同，其中菌丝体中的粗多糖及多糖含量均高于子实体，分别为子实体的2.26倍、3.5倍。两者氨基酸组成不一致，子实体中必需氨基酸为总氨基酸量的58.4％，而菌丝体中必需氨基酸为总氨基酸的45.2％。通过对深层发酵菌丝体内含成分的探讨，为其营养评价及药理研究提供科学的依据。目前用于微生物及细胞发酵的反应器主要有以下几种：1、鼓泡塔生物反应器(Bubble tower bioreactor)，又称鼓泡柱生物反应器(Bubble column bioreactor)，是最简单的气流搅拌生物反应器，气体由反应器底部进入，以气流的动力实现反应体系的混合。鼓泡塔生物反应器通常需要采用高于通气搅拌罐的通气量，且其罐体高径比也较大，多数鼓泡塔反应器的高径比在8∶1到20∶1之间，以利于提高氧传递效率，但在气液混合的均匀性上存在不足。目前，鼓泡塔反应器被主要应用于乙醇发酵、单细胞蛋白发酵、废水处理、废气处理等方面。2、气升式生物反应器(Airlift loop bioreactor)是在鼓泡塔的基础上发展起来的，它利用气体的喷射功能和流体密度差造成反应液循环流动，并通过安装导流筒(Draft tube)来增强反应器内的传递效果和强化流体的循环流动。气升式生物反应器的气体分布装置也可采用喷嘴，称为气升式喷射环流生物反应器。气升式生物反应器虽然提高了反应溶液的分布均匀性、溶氧速率和溶氧效率，但它要求的通气量和通气压力较高，使空气净化工序的负荷增加，对于粘度较大的培养液，溶解氧系数较低，并且在生产上的操作弹性小，低气速在高密度培养时，其混合效果较差，而提高通气量又会导致泡沫产生。3、通气搅拌式生物反应器，其结构比较复杂，主要组成部分有壳体、控温部分、搅拌部分、通气部分、进出料口、测量系统和附属系统等。搅拌轴与罐体的连接要进行无菌密封。罐体底部设有空气分布器或喷嘴。搅拌器由置于罐顶的搅拌电机驱动旋转。系统通常还设有消泡装置、参数测试元件、蛇管或夹套冷却装置等。通气搅拌罐适用于大多数的好氧生物发酵培养，但不足之处是：搅拌消耗的功率较大；结构比较复杂，难以彻底拆卸清洗，易染菌；剪切力稍大，特别是培养丝状菌体时，对细胞有较大损伤，等等。

发明内容

本发明提供一种新型的用于灵芝液体深层发酵的反应器和提取灵芝多糖的工艺。

为了解决上述技术问题，通过以下技术方案实现：

一种灵芝液体深层发酵反应器，其包括进气系统、排气口、取样口和反应罐，进气系统包括空气压缩机、油水分离器、棉碳过滤器和进气管，进气管从反应罐的进气口接入，其中，所述反应罐为高径比为1至4的瓶形容器，瓶形容器口端有瓶塞，所述进气口、排气口和取样口位于瓶塞上。

一种使用上述述反应器制备灵脂多糖的方法，其包括灵脂液体深层发酵过程和灵芝多糖提取过程，其中，灵脂液体深层发酵过程包括：I.进行斜面培养；II.一、二级种子摇瓶培养；III.在上述反应器中进行发酵培养，得到发酵混合液；灵芝多糖提取过程包括：A.对发酵混合液进行离心/过滤后使之固液分离，得到上清液和菌丝体；B.对A步骤所得的菌丝体一次进行自溶、酶解、失活和离心/过滤弃除固形物，得到上部液体；C.将A步骤和B步骤得到的上清液一同浓缩；D.将浓缩液进行离子交换；E.收集洗脱液，进行膜过滤，将所得固体冷冻干燥，所得干物质进行称重，即得灵芝多糖。

本发明的灵芝液体深层发酵反应器结构极其简单，由于反应罐为一般广口玻璃瓶即可，其体积小。设备成本除供气系统外，只有普通生物反应器的10％，且操作弹性大，温度容易控制，溶氧效率好，灵芝菌丝生长良好，多糖含量达到国内同类先进水平，灭菌简单，污染率小，单罐污染造成的损失小，批量可大可小，可根据场地来调节，非常适合科研和中小型企业使用。使用本发明方法进行发酵和灵芝多糖提取，每升发酵液产干菌丝体量可达18.4-23.5g/L左右，多糖含量达0.76g/L左右。

附图说明

图1是本发明灵芝液体深层发酵反应器结构简图；

图2是本发明灵芝多糖制备工艺流程图；

图3是本发明灵芝多糖提取过程流程图。

具体实施方式

参见图1，一种灵芝液体深层发酵反应器，其包括进气系统、排气口4、取样口5和反应罐7，进气系统包括空气压缩机1、油水分离器2、棉碳过滤器3和进气管6，进气管6从进气口接入，其中，所述反应罐7为高径比为1至4的瓶形容器，瓶形容器口端有瓶塞，所述进气口4、排气口和取样口5位于瓶塞8上。

参见图2，一种制备灵脂多糖的方法，其包括灵脂液体深层发酵过程和灵芝多糖提取过程，其中，灵脂液体深层发酵过程包括：I.进行斜面培养；II.一、二级种子摇瓶培养；III.在上述反应器中进行发酵培养，得到发酵混合液；灵芝多糖提取过程参见图3，其包括：A.对发酵混合液进行离心/过滤后使之固液分离，得到上清液和菌丝体；B.对A步骤所得的菌丝体一次进行自溶、酶解、失活和离心/过滤弃除固形物，得到上部液体；C.将A步骤和B步骤得到的上清液一同浓缩；D.将浓缩液进行离子交换；E.收集洗脱液，进行膜过滤，将所得固体冷冻干燥，所得干物质进行称重，即得灵芝多糖。

菌种：目前在研究中一般以菌丝产量或者以多糖的产量为发酵条件确定的依据，或者以两者为指标综合考虑，作为菌种筛选的依据。

培养基组成

①.斜面培养基

马铃薯20％，葡萄糖2％，蛋白胨0.3％，KH2PO4 0.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，维生素B1 0.005％，

②.种子培养基

玉米粉3％，葡萄糖2％，蛋白胨0.3％，酵母膏0.2％，KH2PO4 0.1％，K2HPO4 0.04％，MgSO4·7H2O 0.05％，维生素B1 0.005％。

③.发酵培养基

玉米粉2-4％，葡萄糖1.1-2.2％，蛋白胨0.3-0.6％，酵母膏0.2-0.4％，KH₂PO₄ 0.1％，K₂HPO₄ 0.04％，MgSO₄·7H₂O 0.04-0.06％，维生素B₁ 0.005％。

培养基特点

(1)碳源

主要是单糖、双糖、低聚糖和多糖等碳水化合物。由于食用菌发酵属于低糖发酵，故培养基中糖分浓度一般控制在2-6％之间，液体发酵一般用蔗糖、葡萄糖、玉米浆等。

(2)氮源

在灵芝液体深层发酵中一般采用有机氮源如黄豆饼粉、蛋白胨、酵母粉、酵母膏、麦麸等，培养基总氮浓度通常保持在0.04～0.1％。

(3)无机盐

灵芝生长需要的无机盐中磷、镁、钾最为重要，通常以磷酸氢二钾和磷酸二氢钾来提供磷，同时也提供了钾源，并且提供了溶液的缓冲系统，用量在0.1％～0.2％，同时应提供一定的硫酸镁来提供镁源来满足菌体生长代谢的需要。

(4)生长因子

对灵芝来说，对维生素B1的需求量较大，用量一般为50-100mg/L培养液，其它生长因子由玉米粉、蛋白胨及酵母膏等天然原料提供。

培养条件及其特点

1、培养温度

微生物在最适生长温度下生长速度最快，在不同的温度下发酵，测定菌丝体的产量，灵芝最适的培养温度为25-28℃。

2、培养的原始pH

微生物的生长受培养液pH的影响。灵芝适合于偏酸性的培养条件，发酵的最适初始pH为6.0。

3、转速或振动频率

斜面种在培养箱中静置培养，一级二级菌种在旋转式摇床上进行摇瓶培养，合适的转速是100-120r/min。

4、通气量

通气量过大，料液容易产生大量泡沫甚至喷出，过小则供氧量不足，影响菌体生长。10L鼓泡式生物反应器最适通气量为1.2m3/h。20L鼓泡式生物反应器最适通气量为2.5m3/h

5、装料量

一级菌种培养用总容量为500ml的三角瓶装液300ml，二级菌种培养用总容量为1L的三角瓶装液500ml，10L/20L灵芝鼓泡式生物反应器生产培养装料量为容量的80-90％。

6、培养时间

在实验中进行菌丝体的培养，随着培养时间的延长，菌丝体的产量逐渐增加，随着培养时间的延长，其产量不再增加，菌丝体开始老化，灵芝GL10的斜面种培养时间为7-10天，一级二级菌种培养时间为120小时，10L/20L生物反应器系统最适培养时间为66-72小时。

7、接种量

1支斜面种分接4瓶一级培养瓶，1瓶一级种分接2瓶二级培养瓶，10L生产发酵罐需接2瓶二级种，20L生产发酵罐需接4瓶二级种。

按上述最适培养条件培养，每升发酵液产干菌丝体量可达到18.4-23.5g/L左右，多糖含量达到0.76g/L左右。

灵芝多糖的提取过程：

灵芝多糖的提取工艺过程参见图3，①.将鼓泡式生物反应器发酵混合液进行离心/过滤后使之固液分离，得到上清液和菌丝体；②.将①步所得上清液进行超滤膜分离浓缩至原体积的1/10左右(也可以将①步所得上清液与⑤所得上清液先混合后一同浓缩，如图3所示步骤)；③.将①步中所得菌丝体，按1∶1(重量比)的比例加入纯净水，调节pH为6～7，在40～55℃下，保温60～90min，进行菌丝体自溶，同时不停搅拌，转速为50～90r/min；反应结束后向混合液中加入混合酶，用量0.03～0.05％，混合酶各成分按重量所占比例为：纤维素酶40％、β-葡聚糖酶20％、果胶酶20％、中性蛋白酶20％。在自然pH、40～55℃下酶解2～3小时，然后再加入中性蛋白酶，用量0.05～0.1％，在自然pH、40～55℃下酶解2～3小时；酶解过程中开启搅拌，转速30～90r/min；④.失活酶：将上述③步所得反应液升温至95～100℃，保温10～20min，进行失活酶；⑤.将④步反应液离心/过滤(条件同②)弃除固形物，得到上清夜；⑥.将⑤所得上清液进行超滤膜分离浓缩至原体积的1/10；⑦.将②和⑥步所得浓缩液合并过离子交换柱，进行离子交换；⑧.收集洗脱液，进行膜过滤，将所得固体冷冻干燥，所得干物质进行称重，即得灵芝多糖。

下面以一个实例介绍本发明：

菌种：灵芝(Ganoderma Sinensis)GL10菌株由中科院广东分院微生物研究所提供。

(1).斜面培养菌种

培养基成分：马铃薯20％，葡萄糖2％，蛋白胨0.3％，KH2PO4 0.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，维生素B10.005％，pH5.6。25℃下在培养箱中静置培养7-10d，转入4℃冰箱中保存备用，可保存1个月。

(2).一级二级菌种

培养基成分：玉米粉3％，葡萄糖2％，蛋白胨0.3％，酵母膏0.2％，KH2PO4 0.1％，K2HPO4 0.04％，MgSO4·7H2O 0.05％，维生素B10.005％；pH6.0；24-26℃下培养120h，在旋转式摇床上进行培养，转速100-120r/min。一级菌种培养用500ml三角瓶装液300ml，二级菌种培养用容量1L的三角瓶装液500ml。接种量：1支斜面种分接4瓶一级培养瓶，1瓶一级种分接2瓶二级培养瓶。

(3).生产发酵培养

培养基成分：玉米粉3％，葡萄糖1.6％，蛋白胨0.4％，酵母膏0.2％，KH2PO4 0.1％，K2HPO4 0.04％，MgSO4·7H2O 0.05％，维生素B1 0.005％。pH6.0；10L/20L灵芝鼓泡式生物反应器生产培养装料量为容量的80-90％。接种量：10L生产发酵罐需接2瓶二级种，20L生产发酵罐需接4瓶二级种。24-26℃下在10L/20L灵芝鼓泡式生物反应器中培养66-72h。通气量：10L鼓泡式生物反应器通气量为1.2m³/h。20L鼓泡式生物反应器通气量为2.5m³/h。放罐pH4.5-5.0。

按上述最适培养条件培养，每升发酵液产干菌丝体可达19.2g左右，粗多糖含量达39.6g/Kg干菌丝体。

(4).取1L发酵混合液，按下述方法提取粗多糖：

①.将鼓泡式生物反应器发酵混合液进行膜过滤后使之固液分离；

②.将①步所得上清液进行超滤膜分离浓缩至95ml左右；

③.将①步中所得菌丝体，按1∶1(重量比)的比例加入纯净水，用1mol/L NaOH(或1mol/L HCl)调节pH为6～7，在40～55℃下，保温60～90min，进行菌丝体自溶，同时不停搅拌，转速为50～90r/min；反应结束后向混合液中加入混合酶，用量0.2-3％复合酶(其中纤维素酶40％、β-葡聚糖酶30％、果胶酶30％)，在自然pH、40～55℃下酶解2～3小时，酶解过程中开启搅拌，转速30～90r/min；然后再加入中性蛋白酶，用量0.05-0.1％，反应条件同上，反应时间1-2小时。

④.失活酶：将上述③步所得反应液升温至95～100℃，保温10～20min，进行失活酶；

⑤.将④步反应液离心/过滤(条件同②)弃除固形物，得到上清夜约400ml；

⑥.将⑤所得上清夜复经膜超滤浓缩至40ml左右；

⑦.将②和⑥步所得浓缩液合并过离子交换柱。

⑧.收集洗脱液，进行膜过滤，将所得固体冷冻干燥，所得干物质进行称重，即得灵芝多糖，约10-11g。灵芝多糖得率为1.1％，经高效液相色谱法测定，相对分子质量在5000-80000之间的活性灵芝多糖占75-85％。

本发明还有其它一些变形或者改进，如果本技术领域的技术人员受到本发明的启发做出的显而易见的非实质性的改变或者改进，均属于本发明权利要求书的保护范围。

Claims

1.一种灵芝液体深层发酵反应器，其包括进气系统、排气口、取样口和反应罐，进气系统包括空气压缩机、油水分离器、棉碳过滤器和进气管，进气管从进气口接入，其特征在于，所述反应罐为高径比为1至4的瓶形容器，瓶形容器口端有瓶塞，所述进气口、排气口和取样口位于瓶塞上。

2.根据权利要求1所述的灵芝液体深层发酵反应器，其特征在于，所述反应罐为瓶形容器。

3.一种使用权利要求1所述反应器制备灵芝多糖的方法，其包括灵芝液体深层发酵过程和灵芝多糖提取过程，其特征在于，灵芝液体深层发酵过程包括：I.进行斜面培养；II.一、二级种子摇瓶培养；III.在上述反应器中进行发酵培养，得到发酵混合液；灵芝多糖提取过程包括：A.对发酵混合液进行离心/过滤后使之固液分离，得到上清液和菌丝体；B.对A步骤所得的菌丝体一次进行自溶、酶解、失活和离心/过滤弃除固形物，得到上部液体；C.将A步骤和B步骤得到的上清液一同浓缩；D.将浓缩液进行离子交换；E.收集洗脱液，进行膜过滤，将所得固体冷冻干燥，所得干物质进行称重，即得灵芝多糖。

4.根据权利要求3所述的制备灵芝多糖的方法，其特征在于，上述深层发酵过程步骤III中所用发酵培养基各组分重量比为：玉米粉2-4％，葡萄糖1.1-2.2％，蛋白胨0.3-0.6％，酵母膏0.2-0.4％，KH2PO4 0.1％，K2HPO4 0.04％，MgSO4·7H2O 0.04-0.06％，维生素B1 0.005％。

5.根据权利要求3所述的制备灵芝多糖的方法，其特征在于，深层发酵过程培养温度为25-28℃。

6.根据权利要求3所述的制备灵芝多糖的方法，其特征在于，深层发酵过程中发酵初始PH值为6.0。

7.根据权利要求3所述的制备灵芝多糖的方法，其特征在于，灵芝多糖提取过程步骤B具体为：按1∶1的重量比例加入纯净水，调节pH为6～7，在40～55℃下，保温60～90min，进行菌丝体自溶，同时不停搅拌，转速为50～90r/min；反应结束后向混合液中加入混合酶，用量0.03～0.05％，在自然pH、40～55℃下酶解2～3小时；然后再加入中性蛋白酶，用量0.05～0.1％，在自然pH、40～55℃下酶解2～3小时；酶解过程中开启搅拌，转速30～90r/min；最后将所得反应液升温至95～100℃，保温10～20min，进行失活酶。

8.根据权利要求7所述的制备灵芝多糖的方法，其特征在于，所述混合酶各成分按重量所占比例为：纤维素酶40％、β-葡聚糖酶20％、果胶酶20％。