CN102199551B - 一种酵母及其多阶段发酵生产赤藓糖醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酵母，其分类命名为酿酒酵母，菌种的拉丁学名是Saccharomyces cerevisiae，参据的微生物：NJWGYH30566，保藏日期是2010年11月15日，保藏中心登记入册编号是CGMCC No.4349。本发明还提供了利用此酵母多阶段发酵生产赤藓糖醇的方法。该方法包括：种子的培养、接种前准备及接种、多阶段溶氧控制、分批补料发酵阶段，以多阶段发酵生产初级代谢产物赤藓糖醇，使其产量有明显的提高。本发明成本低，操作简便，发酵液中赤藓糖醇产量较高，有利于工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种高产赤藓糖醇的产生菌酵母Saccharomyces cerevisiae NJWGYH30566多阶段发酵生产方法。
背景技术
赤藓糖醇(Erythritol)为1，2，3，4-丁四醇，分子式为C4H10O4，在自然界中的分布非常广泛，地衣类植物、海藻、蘑菇类及各种植物果实中均含有。赤藓糖醇是一种新型营养型甜味剂，其特点是热稳定性好、吸湿性小、冰点较低，广泛应用于食品、医药、化妆品、化工等领域。其生产方法主要有化学法和微生物发酵法，化学法是将淀粉用高碘酸法生成双全淀粉，再经氢化裂解成赤藓糖醇和其他衍生物，流程长，成本较高；微生物发酵法生产过程温和，容易控制，更具有生产优势。
赤藓糖醇产生菌株多属于酵母，少部分为霉菌和细菌。能生产赤藓糖醇的菌种主要有假丝酵母属(Candida)、球拟酵母属(Torulopsis)、毛孢子菌属(Trichosporum)、三角酵母属(Trigonopsis)、毕赤酵母属(Pichia)，小丛梗孢属(Moniliella)和短梗霉属(Aureobasidium)等属。赤藓糖醇的开发利用在日本、韩国、比利时研究较多。日本研究者从土壤、发酵食品、果实和花粉中采样进行分离、筛选、诱变育种，得到了产赤藓糖醇的耐高渗透酵母菌株Aureoasidium sp.SN-115；韩国筛选得到Candida magnoliae。我国发酵法生产赤藓糖醇的研究开发工作起步较晚。江南大学的范光先等人筛选出一株单产赤藓糖醇的球状酵母OS-194，江苏省微生物研究所吴燕等人筛选得到一株圆酵母(Torula sp.)等。
由于发酵液中成分复杂，这对发酵后期的分离提取提出了很高要求。针对当前国内外发酵法生产赤藓糖醇存在发酵周期长、提取分离步骤多、高浓度产物底物抑制等问题，如能建立起一套系统的发酵法生产赤藓糖醇的多阶段反应与分离耦合基础理论，特别对产物的分离提取进行深入研究，将具有重大意义。
发明内容
本发明目的在于提供一种酵母在多阶段发酵生产赤藓糖醇方法中的应用；本发明的另一目的还提供了利用该酵母Saccharomyces cerevisiae NJWGYH30566多阶段发酵生产赤藓糖醇的方法。
本发明的技术方案为：一种酵母，其分类命名为酿酒酵母，菌种的拉丁学名是Saccharomyces cerevisiae，参据的微生物：NJWGYH30566，保藏日期是2010年11月15日，保藏中心登记入册编号是CGMCC No.4349。
本发明提供了酵母在多阶段发酵生产赤藓糖醇方法中的应用。
一种利用上述的酵母多阶段发酵生产赤藓糖醇的方法，其具体步骤如下：利用酵母培养发酵种子液；将发酵培养基进行接种前准备灭菌；然后将发酵种子液按发酵培养基体积的2-6％比例接种于发酵培养基，通过控制葡萄糖浓度进行有氧多阶段发酵，制得赤藓糖醇。
所述的培养发酵种子液为从PDA培养基上挑1-2个酵母Saccharomycescerevisiae(参据的微生物：NJWGYH30566，保藏中心登记入册编号是CGMCCNo.4349)菌落到装种子培养基的三角瓶中，其中装液量为三角瓶体积的5-10％，在温度为25～35℃，pH为5.5-7.5，转速为150-200rpm的摇床中培养30-40h，得到发酵种子液；
上述的种子培养基组成为(g/L)：葡萄糖150-250，酵母膏10-20，玉米浆3-5。
所述的发酵培养基接种前准备为将发酵培养基溶于水中，搅拌均匀，倒入发酵罐中，通入冷却水，灭菌，灭菌前校正溶解氧DO为0％；其中所述的发酵培养基的组分(g/L)：葡萄糖200-300，酵母膏20-30，玉米浆10-20，MgSO4·7H2O 0.3-0.5，MnCl2·4H2O 0.005-0.015，CuSO4·5H2O 0.005-0.015，ZnSO4·7H2O 0.005-0.01，泡敌0.3-0.5。
所述的接种过程中发酵培养基的培养温度25～35℃，控制pH 5.5-7.5；调节好转速、空气流量及罐压以校正溶氧DO达100％；所述的有氧多阶段为发酵过程的前40～60h的发酵菌体生长阶段，控制空气流量为10-20L/min，搅拌速度为300-400rpm，溶氧水平DO控制在30-50％；位于发酵过程的60h之后为赤藓糖醇产生阶段，当细胞光密度(OD660)水平达到25-30时，调节空气流量为20-30L/min，搅拌速度为100-200rpm，溶解氧水平控制在10-30％。
在菌体生长阶段，当葡萄糖浓度低于150g/L时，开始流加底物A，并以发酵液中葡萄糖的浓度来指导底物流加速度，使发酵罐内葡萄糖浓度控制在130-150g/L范围内发酵；在赤藓糖醇生长阶段，当葡萄糖浓度低于50g/L时，开始流加底物B，并以发酵液中葡萄糖的浓度来指导底物流加速度，使发酵罐内葡萄糖浓度控制在30-50g/L范围内发酵60-80h。其中流加底物A组成为(g/L)：葡萄糖800-1000，酵母膏100-200；底物B组成为(g/L)：葡萄糖800-1000，酵母膏100-200，玉米浆10-20，肌醇六磷酸MgSO4·7H2O 5-15。
上述酵母Saccharomyces cerevisiae参据的微生物：NJWGYH30566是由本实验室从南京郊区养蜂场生产的蜂蜜、糖厂的废液中分离得到，薄层色谱法(TLC)初筛得到11株产赤藓糖醇的菌株；经摇瓶复筛，用HPLC(高效液相色谱)检测获得一株赤藓糖醇产生菌株，通过生理生化特性实验和26S rDNA序列相似性分析，分类鉴定命名为酿酒酵母，并保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其简称为CGMCC，登记入册的编号是CGMCC No.4349，保藏日期是：2010年11月15日。以此菌种作为生产菌株。
CGMCC No.4349菌株具有下述性质：
1、形态特征：
菌落在PDA培养基上，菌落呈圆形，表面光滑，边缘整齐，有光泽；在光学显微镜下，细胞圆形和椭圆形。
2、生理生化性质：
表2 CGMCC No.4349菌株的生理生化性质
+：为可利用；-：为不可利用
3、26S rDNA序列分析
参考周小玲等的方法从新鲜菌体提取基因组DNA(周小玲，沈微，饶志群等.一种快速提取真菌染色体的方法.微生物学通报，2004，31(4)：89-92)，采用酵母通用引物(NL-1：5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′，NL-4：5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)进行26S rDNA扩增，PCR产物经检测、纯化后交由TAKARA公司进行测序。所测的26S rDNA序列经校对、拼接后与GenBank数据库中相关种属的序列进行BLAST比较，菌株NJWGYH30566(CGMCC No.4349)的16S rDNA序列与酿酒酵母同源性较高。菌株CGMCC No.4349的26S rDNA序列已经提交GenBank，接受号为HQ677628(Accession number：HQ677628)。
测得26S rDNA大部分序列558bp，具体如下：
5`-TGCCTTAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGT
ACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTG
TCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAG
GAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCA
GCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGAT
AGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGA
AAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTT
TGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCAT
CAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTA
TAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGG
ATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGC-3`
有益效果：
采用本发明的酵母Saccharomyces cerevisiae多阶段发酵生产赤藓糖醇的方法，经过种子的培养、接种前准备及接种、多阶段溶氧控制、分批补料发酵，实现了赤藓糖醇生产菌酵母Saccharomyces cerevisiae的多阶段培养，使Saccharomycescerevisiae的初级代谢产物赤藓糖醇产量有大幅度提高。本发明成本低，操作简易，发酵液中目标产物赤藓糖醇产量较高，有利于工业化规模生产。
保藏信息
上述酵母Saccharomyces cerevisiae参据的微生物：NJWGYH30566是由本实验室选育并保藏于中国普通微生物菌种保藏管理保藏中心(北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物所)，其简称为CGMCC，登记入册的编号是CGMCC No.4349，保藏日期是：2010年11月15日。
具体实施方式
本发明提供一种酵母Saccharomyces cerevisiae多阶段发酵生产赤藓糖醇的方法，下面列举实施例予以进一步说明。
实例一：
①种子的培养
从PDA平板上挑1个酵母Saccharomyces cerevisiae NJWGYH30566(CGMCCNo.4349)菌落到装液25mL种子培养基的500mL三角瓶中，在温度为25℃，pH为5.5，转速为150rpm的摇床中培养40h，得到种子培养液；
上述的种子培养基组成为(g/L)：葡萄糖150，酵母膏10，玉米浆3。
②接种前准备
洗净发酵罐，组装好温度计，pH计(已校正)和泡沫传感器，将发酵培养基溶于水中，搅拌均匀，倒入发酵罐中，通入冷却水，灭菌，灭菌前校正溶解氧DO为0％，接好空气过滤器，冷却后接好其他附属设备。
其发酵培养基的组成为(g/L)：葡萄糖200，酵母膏20，玉米浆10，MgSO4·7H2O0.3，MnCl2·4H2O 0.005，CuSO4·5H2O 0.005，ZnSO4·7H2O 0.005，泡敌0.3。
③接种
在火焰圈保护下，以2％接种量将酵母Saccharomyces cerevisiae NJWGYH30566接种于3L自动控制发酵罐中，装液量1.5L，空气流量10L/min，搅拌转速为300r/min，培养温度25℃，校正溶氧100％，自动流加盐酸控制pH5.5±0.5，调节好转速、空气流量及罐压。
④多阶段溶氧控制
赤藓糖醇发酵过程分为菌体生长阶段和赤藓糖醇产生两个阶段。菌体生长阶段为发酵过程的前60h，空气流量为10L/min，搅拌速度为300rpm，溶氧水平DO控制在30-50％；位于发酵过程的60h之后为赤藓糖醇产生阶段，当细胞光密度(OD660)水平达到25时，此时发酵液粘度较高，高强度的搅拌增加溶氧量会对菌体造成机械损伤，通过加大空气流量和降低搅拌速度相结合的方式解决此问题。此阶段调节空气流量为20L/min，搅拌速度为100rpm，溶解氧水平控制在10-30％。
⑤分批补料发酵
菌体经过一段时间的适应期后，进入对数生长期，此菌体生长阶段营养物质消耗量较大，当葡萄糖浓度低于150g/L时，开始流加底物A，并以发酵液中葡萄糖的浓度来指导底物流加速度，使发酵罐内葡萄糖浓度控制在130-150g/L范围内发酵；在赤藓糖醇生长阶段，当葡萄糖浓度低于50g/L时，开始流加底物B，并以发酵液中葡萄糖的浓度来指导底物流加速度，使发酵罐内葡萄糖浓度控制在30-50g/L范围内发酵60-80h。其中流加底物A组成为(g/L)：葡萄糖800，酵母膏100；底物B组成为(g/L)：葡萄糖800，酵母膏100，玉米浆10，肌醇六磷酸MgSO4·7H2O 5。
最终测得赤藓糖醇含量为88g/L。
实例二：
①种子的培养
从PDA平板上挑1个酵母Saccharomyces cerevisiae NJWGYH30566(CGMCCNo.4349)菌落到装液40mL种子培养基的500mL三角瓶中，在温度为30℃，pH为6.5，转速为180rpm的摇床中培养36h，得到种子培养液；
上述的种子培养基组成为(g/L)：葡萄糖200，酵母膏16，玉米浆4。
②接种前准备
洗净发酵罐，组装好温度计，pH计(已校正)和泡沫传感器，将发酵培养基溶于水中，搅拌均匀，倒入发酵罐中，通入冷却水，灭菌，灭菌前校正溶解氧DO为0％，接好空气过滤器，冷却后接好其他附属设备。
其发酵培养基的组成为(g/L)：葡萄糖250，酵母膏25，玉米浆15，MgSO4·7H2O0.4，MnCl2·4H2O 0.015，CuSO4·5H2O 0.015，ZnSO4·7H2O 0.008，泡敌0.4。
③接种
在火焰圈保护下，以5％接种量将酵母Saccharomyces cerevisiae NJWGYH30566接种于3L自动控制发酵罐中，装液量1.5L，空气流量20L/min，搅拌转速为350r/min，培养温度30℃，校正溶氧100％，自动流加盐酸控制pH6.5±0.5，调节好转速、空气流量及罐压。
④多阶段溶氧控制
赤藓糖醇发酵过程分为菌体生长阶段和赤藓糖醇产生两个阶段。菌体生长阶段为发酵过程的前50h，空气流量为20L/min，搅拌速度为350rpm，溶氧水平DO控制在30-50％；位于发酵过程的50h之后为赤藓糖醇产生阶段，当细胞光密度(OD660)水平达到28时，此时发酵液粘度较高，高强度的搅拌增加溶氧量会对菌体造成机械损伤，通过加大空气流量和降低搅拌速度相结合的方式解决此问题。此阶段调节空气流量为30L/min，搅拌速度为130rpm，溶解氧水平控制在10-30％。
⑤分批补料发酵
菌体经过一段时间的适应期后，进入对数生长期，此菌体生长阶段营养物质消耗量较大，当葡萄糖浓度低于150g/L时，开始流加底物A，并以发酵液中葡萄糖的浓度来指导底物流加速度，使发酵罐内葡萄糖浓度控制在130-150g/L范围内发酵；在赤藓糖醇生长阶段，当葡萄糖浓度低于50g/L时，开始流加底物B，并以发酵液中葡萄糖的浓度来指导底物流加速度，使发酵罐内葡萄糖浓度控制在30-50g/L范围内发酵60-80h。其中流加底物A组成为(g/L)：葡萄糖900，酵母膏160；底物B组成为(g/L)：葡萄糖900，酵母膏160，玉米浆18，肌醇六磷酸MgSO4·7H2O 15。
最终测得赤藓糖醇含量为216g/L。
实例三：
①种子的培养
从PDA平板上挑2个酵母Saccharomyces cerevisiae NJWGYH30566(CGMCCNo.4349)菌落到装液50mL种子培养基的500mL三角瓶中，在温度为35℃，pH为7.5，转速为200rpm的摇床中培养30h，得到种子培养液；
上述的种子培养基组成为(g/L)：葡萄糖250，酵母膏20，玉米浆5。
②接种前准备
洗净发酵罐，组装好温度计，pH计(已校正)和泡沫传感器，将发酵培养基溶于水中，搅拌均匀，倒入发酵罐中，通入冷却水，灭菌，灭菌前校正溶解氧DO为0％，接好空气过滤器，冷却后接好其他附属设备。
其发酵培养基的组成为(g/L)：葡萄糖300，酵母膏30，玉米浆20，MgSO4·7H2O0.5，MnCl2·4H2O 0.01，CuSO4·5H2O 0.01，ZnSO4·7H2O 0.01，泡敌0.5。
③接种
在火焰圈保护下，以6％接种量将酵母Saccharomyces cerevisiae NJWGYH30566接种于3L自动控制发酵罐中，装液量1.5L，空气流量15L/min，搅拌转速为400r/min，培养温度35℃，校正溶氧100％，自动流加盐酸控制pH7.5±0.5，调节好转速、空气流量及罐压。
④多阶段溶氧控制
赤藓糖醇发酵过程分为菌体生长阶段和赤藓糖醇产生两个阶段。菌体生长阶段为发酵过程的前40h，空气流量为15L/min，搅拌速度为400rpm，溶氧水平DO控制在30-50％；位于发酵过程的40h之后为赤藓糖醇产生阶段，当细胞光密度(OD660)水平达到30时，此时发酵液粘度较高，高强度的搅拌增加溶氧量会对菌体造成机械损伤，通过加大空气流量和降低搅拌速度相结合的方式解决此问题。此阶段调节空气流量为28L/min，搅拌速度为200rpm，溶解氧水平控制在10-30％。
⑤分批补料发酵
菌体经过一段时间的适应期后，进入对数生长期，此菌体生长阶段营养物质消耗量较大，当葡萄糖浓度低于150g/L时，开始流加底物A，并以发酵液中葡萄糖的浓度来指导底物流加速度，使发酵罐内葡萄糖浓度控制在130-150g/L范围内发酵；在赤藓糖醇生长阶段，当葡萄糖浓度低于50g/L时，开始流加底物B，并以发酵液中葡萄糖的浓度来指导底物流加速度，使发酵罐内葡萄糖浓度控制在30-50g/L范围内发酵60-80h。其中流加底物A组成为(g/L)：葡萄糖1000，酵母膏200；底物B组成为(g/L)：葡萄糖1000，酵母膏200，玉米浆20，肌醇六磷酸MgSO4·7H2O 8。
最终测得赤藓糖醇含量为131g/L。
本发明用于甜味剂赤藓糖醇的生产，具有广阔的应用前景。通过开发酵母Saccharomyces cerevisiae NJWGYH30566多阶段发酵生产工艺，降低生产成本、提高了赤藓糖醇的产量，有利于工业化规模生产。
Claims (8)
1.一种酵母，其分类命名为酿酒酵母，菌种的拉丁学名是Saccharomyces cerevisiae，参据的微生物：NJWGYH30566，保藏日期是2010年11月15日，保藏中心登记入册编号是CGMCC No.4349。
2.一种如权利要求1所述的酵母在多阶段发酵生产赤藓糖醇方法中的应用。
3.一种利用权利要求1所述的酵母多阶段发酵生产赤藓糖醇的方法，其具体步骤如下：利用酵母培养发酵种子液；将发酵培养基进行接种前准备灭菌；然后将发酵种子液按发酵培养基体积的2-6％比例接种于发酵培养基，通过控制葡萄糖浓度进行有氧多阶段发酵，制得赤藓糖醇。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的培养发酵种子液为从PDA培养基上挑1-2个酵母Saccharomyces cerevisiae菌落到装种子培养基的三角瓶中，其中装液量为三角瓶体积的5-10％，在温度为25～35℃，pH为5.5-7.5，转速为150-200rpm的摇床中培养30-40h，得到发酵种子液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的种子培养基组成为：葡萄糖150-250g/L，酵母膏10-20g/L，玉米浆3-5g/L。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的发酵培养基接种前准备为将发酵培养基溶于水中，搅拌均匀，倒入发酵罐中，通入冷却水，灭菌，灭菌前校正溶解氧DO为0％；其中所述的发酵培养基的组分：葡萄糖200-300g/L，酵母膏20-30g/L，玉米浆10-20g/L，MgSO4·7H2O 0.3-0.5g/L，MnCl2·4H2O 0.005-0.015g/L，CuSO4·5H2O 0.005-0.015g/L，ZnSO4·7H2O 0.005-0.01g/L，泡敌0.3-0.5g/L。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的接种过程中发酵培养基的培养温度25～35℃，控制pH 5.5-7.5；调节好转速、空气流量及罐压以校正溶氧DO达100％；所述的有氧多阶段发酵为发酵过程前40～60h的菌体生长阶段，控制空气流量为10-20L/min，搅拌速度为300-400rpm，溶氧水平DO控制在30-50％；位于发酵过程60h之后的赤藓糖醇产生阶段，当细胞光密度OD660水平达到25-30时，调节空气流量为20-30L/min，搅拌速度为100-200rpm，溶解氧水平控制在10-30％。
8.根据权利要求3所述的方法，在菌体生长阶段，当葡萄糖浓度低于150g/L时，开始流加底物A，并以发酵液中葡萄糖的浓度来指导底物流加速度，使发酵罐内葡萄糖浓度控制在130-150g/L范围内发酵；在赤藓糖醇产生阶段，当葡萄糖浓度低于50g/L时，开始流加底物B，并以发酵液中葡萄糖的浓度来指导底物流加速度，使发酵罐内葡萄糖浓度控制在30-50g/L范围内发酵60-80h；其中流加底物A组成为：葡萄糖800-1000g/L，酵母膏100-200g/L；底物B组成为：葡萄糖800-1000g/L，酵母膏100-200g/L，玉米浆10-20g/L，肌醇六磷酸MgSO4·7H2O 5-15g/L。
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Non-Patent Citations (3)
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| Ji-Hee Yu.Selective utilization of fructose to glucose by Candida magnoliae, an erythritol producer.《Applied Biochemistry and Biotechnology》.2006,第131卷(第1-3期),870-879. * |
| Ji-HeeYu.SelectiveutilizationoffructosetoglucosebyCandidamagnoliae an erythritol producer.《Applied Biochemistry and Biotechnology》.2006 |
| Jinbyung Park.Production of erythritol in fed-batch cultures of Trichosporon sp..《Journal of Fermentation and Bioengineering》.1998,第86卷(第6期),577–580. * |
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