CN105462857A - 一种安络小皮伞菌株及其应用 - Google Patents

一种安络小皮伞菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种安络小皮伞菌株(Marasmiellus？androsaceus)，其保藏号为：CGMCC？No.11734。本发明还公开了应用该安络小皮伞菌株生产安络小皮伞多糖的方法。本发明采用热水提取、超滤分离和乙醇沉淀工艺，提取方法操作简单，分离产品中安络小皮伞多糖的含量不低于60％，多糖提取率不低于12.3％。

Description

一种安络小皮伞菌株及其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其涉及一种安络小皮伞菌株及其应用。
背景技术
安络小皮伞多糖是安络小皮伞菌的重要活性物质之一，具有提高免疫力，抗肿瘤，抗衰老等多种活性。目前国内外大多是从安络小皮伞菌的子实体中提取安络小皮伞多糖。关于安络小皮伞多糖提取方法主要有化学法、酶法和物理法。其中，酶法专一性很强，但对某种未知的多糖难以确定合适的降解酶，而且费用较高，条件苛刻。
李雪梅等研究了安络小皮伞菌液体发酵过程中还原糖与菌丝体干重、pH值及产量的关系，为安络小皮伞多糖的生产提供了重要的理论依据。目前关于利用液态发酵方法生产安络小皮伞多糖的工艺非常少。申请专利号为201410337924.0的中国发明专利提供了一种液态发酵的方法，但是该方法用普通的菌种发酵，产率低，而且在对安络小皮伞多糖的提取过程中采用酶法，分离过程复杂，且含量低。国内目前主要生产厂家为上海康舟多糖有限公司，安络小皮伞多糖的含量在20～40％，产量低，附加值小。
综上所述，提供一种能大规模生产高含量高品质的安络小皮伞多糖产品的技术是目前市场上非常必要的。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供了一种产率高的安络小皮伞多糖菌株及其在生产安络小皮伞多糖中的应用。
本发明提供的技术方案为：
一种安络小皮伞菌株(Marasmiellusandrosaceus)，其保藏号为：CGMCCNo.11734。
所述的安络小皮伞菌株在生产安络小皮伞多糖中的应用。
优选的是，所述的应用中，包括以下步骤：
步骤(1)将所述安络小皮伞菌株的菌丝体加入水中，菌丝体和水的质量比为1﹕20～1﹕50，然后将温度升到50～90℃，提取1～4h得到提取液；
步骤(2)对提取液进行第一次超滤分离，第一次超滤分离采用V8072-35-PMC中空纤维膜，流速为10～20L/h，压力为0.15～0.20MPa，得到透过液；
步骤(3)再对所述透过液进行第二次超滤分离，第二次超滤分离采用HF-66-43-PM10超滤膜，流速为10～20L/h，压力为0.3～0.4MPa，得到第一浓缩液；
步骤(4)采用乙醇沉淀法处理所述第一浓缩液，得到安络小皮伞多糖。
优选的是，所述的应用中，所述步骤(4)的具体过程为：先将所述第一浓缩液浓缩至原体积的1/6，得到第二浓缩液，再向第二浓缩液中加入乙醇使乙醇在第二浓缩液中的终体积浓度为75～80％，静置时间为5～8h。
优选的是，所述的应用中，所述步骤(1)中，培养所述安络小皮伞菌株以制备得到菌丝体，培养过程中，种子培养基的各组分按重量百分比计：葡萄糖2％～3％，酵母浸膏1～2％，牛肉膏1～2％，麦芽糖0.5～1％，氯化钠0.05～0.1％，磷酸二氢钾0.05％，PH值为5.0～6.0，发酵培养基的组成为：淀粉浓度40～50g/L，葡糖糖30～40g/L，牛肉膏2.0～3.0g/L，氯化钠0.5～1.5g/L，磷酸二氢钾0.1～0.3g/L，pH值为6.0～6.5。
优选的是，所述的应用中，所述步骤(1)中，培养所述安络小皮伞菌株的具体过程为：
步骤①对所述安络小皮伞菌株进行一级摇瓶培养，一级摇瓶培养基为所述种子培养基，在22～26℃，150rpm振荡培养48～60h，得到一级摇瓶菌种；
步骤②对一级摇瓶菌种进行二级摇瓶培养，二级摇瓶培养基为所述种子培养基，22～26℃，150rpm振荡培养36～60h，得到二级摇瓶菌种；
步骤③对二级摇瓶菌种进行一级种子培养，一级种子培养基为所述种子培养基，培养温度为22～26℃，氧气通气量与一级种子培养基的体积比为1:0.5～1.0，通气压力为0.3～0.8kPa，培养过程中用氨水进行补料，控制pH在6.0，初始转速为120r/min，通过调整转速控制溶氧值在60％，培养36～48h，得到一级种子；
步骤④对一级种子进行二级种子培养，二级种子培养基为所述种子培养基，培养温度为22～26℃，氧气通气量与二级种子培养基的体积比为1:0.5～1.0，通气压力为0.3～0.8kPa，培养过程中用氨水进行补料，控制pH在6.0，初始转速为120r/min，通过调整转速控制溶氧值在60％，培养36～48h，得到二级种子；
步骤⑤对二级种子进行发酵培养，发酵所采用的培养基为所述发酵培养基，培养温度为22～26℃，氧气通气量与发酵所采用的培养基的体积比为1:0.5～1.0，通气压力为0.3～0.8kPa，培养过程中用氨水进行补料，控制pH在6.0，初始转速为120r/min，通过调整转速控制溶氧值在60％，培养76～100h。
本发明所述的安络小皮伞菌株具有以下有益效果：
本发明所述的安络小皮伞菌株具有更高的安络小皮伞多糖产率，发酵水平可以达到9.0g/L发酵液以上，本发明所述的安络小皮伞菌株的产糖量提高了17％。在应用安络小皮伞菌株生产安络小皮伞菌多糖的过程中，本发明采用热水提取、超滤分离和乙醇沉淀工艺，提取方法操作简单，分离产品中安络小皮伞多糖的含量不低于60％，多糖提取率不低于12.0％。
附图说明
图1为本发明所述的一个实施例中生产安络小皮伞多糖的工艺流程图。
生物保藏说明
高产菌株H125：分类命名：安络小皮伞，(Marasmiellusandrosaceus)，保藏号为：CGMCCNo.11734，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2015年11月25日；
出发菌株：分类命名：安络小皮伞，(Marasmiellusandrosaceus)，保藏号为：CGMCCNo.11734，该菌株购自于北京安泰达山基因技术有限公司。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例一利用出发菌株诱变得到突变菌株H123
用组织分离法得到安络小皮伞出发菌株，接种在麦芽汁固定斜面培养基上，在26℃恒温培养48h，然后冰箱中4℃保存备用。取8mL孢子悬液于6cm平皿中，磁力搅拌，紫外灯30cm处照射20s，进行第一轮照射，经摇瓶复筛后，获得高产安络小皮伞多糖的第一次突变菌株，然后该第一突变菌株再进行第2轮紫外线照射诱变30s，经初、复筛，获得生长良好的产安络小皮伞多糖水平高的高产菌株H125。
斜面培养基中各组分按重量百分比计：葡萄糖3％，酵母浸膏1％，牛肉膏1％，氯化钠0.1％，磷酸二氢钾0.05％，琼脂粉1.0％，pH值为5.0～6.0。
高产菌株H125的产糖量为6.3g/L，出发菌株的产糖量为5.4g/L，高产菌株的产糖量提高了17％。
实施例二
改变斜面培养基的组成，分别对高产菌株和出发菌株进行培养。斜面培养基的中各组分按重量百分比计设计为：葡萄糖2％，酵母浸膏2％，牛肉膏1％，氯化钠0.0％，磷酸二氢钾0.05％，琼脂粉1.0％，pH值为5.0～6.0。高产菌株的产糖量相比于出发菌株提高了18％。
实施例三
图1提供了在一个实施例中生产安络小皮伞多糖的工艺流程。
步骤一、培养高产菌株H125
步骤①从母种试管中挑取，将新鲜的高产菌种H125进行一级摇瓶培养。在一级摇瓶培养过程中，50mL种子培养基装于500mL三角摇瓶中，23℃，150rpm振荡培养48h，得到一级摇瓶菌种。
步骤②再对一级摇瓶菌种进行二级摇瓶培养。将200mL种子培养基装于1000mL三角摇瓶中，接入一级摇瓶菌种50mL，24℃，150rpm振荡培养36h，得到二级摇瓶菌种。
步骤③对二级摇瓶菌种进行一级种子培养。将二级摇瓶菌种接入装有一级种子培养基的100L全自动发酵罐中。一级种子培养基用量为60L，培养温度为23℃，氧气通气量与一级种子培养基的体积比为1:1.0(v/v)，通气压力为0.8kPa，培养过程中用氨水进行补料，控制pH在6.0，初始转速为120r/min，通过调整转速控制溶氧值在60％，培养36h。
步骤④对一级种子进行二级种子培养。将一级种子接入装有二级种子培养基的500L全自动发酵罐中。二级种子培养基的用量为200L，培养温度为23℃，氧气通气量与一级种子培养基的体积比为1:0.5(v/v)，通气压力为0.8kPa，培养过程中用氨水进行补料，控制pH在6.0，初始转速为120r/min，通过调整转速控制溶氧值在60％，培养36h。
步骤⑤对二级种子进行发酵培养。将二级种子接入装有发酵培养基的5000L全自动发酵罐中。培养温度为23℃，氧气通气量与一级种子培养基的体积比为1:0.5(v/v)，压力为0.3kPa，培养过程中用氨水进行补料，控制pH在6.0，初始转速为120r/min，通过调整转速控制溶氧值在60％，发酵76h，发酵产率为9.5g/L发酵液。
种子培养基的各组分按重量百分比计：葡萄糖2％，酵母浸膏1％，牛肉膏1％，麦芽糖0.5％，氯化钠0.1％，磷酸二氢钾0.05％，PH值为6.0。发酵培养基的组成为：淀粉浓度50g/L，葡糖糖30g/L，牛肉膏3.0g/L，氯化钠0.5g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，pH值为6.0～6.5。
步骤二、从培养后的高产菌株H125的菌丝体中提取安络小皮伞多糖
步骤(1)将高产菌株H125的菌丝体按照质量比1：20加入蒸馏水中，然后将温度升到60℃，在搅拌下提取2h得到提取液。
步骤(2)对提取液进行第一次超滤分离。确定超滤设备的管道及容器干净后，在原料槽装入提取液，用型号为V8072-35-PMC中空纤维膜为组件，以15L/h，压力为0.15MPa的流速进行超滤分离，截留分子量10万以上的透过液。
步骤(3)再对所述透过液进行第二次超滤分离。将透过液装入原料槽中，超滤设备采用截留分子量1.0万以上的型号为HF-66-43-PM10超滤膜为组件，压力为0.3MPa，以15L/h的流速进行超滤分离。第一浓缩液用于下一步纯化。
步骤(4)将第一浓缩液再浓缩至原体积的1/6，得到第二浓缩液，再向第二浓缩液中加入体积浓度为95％的乙醇使乙醇在第二浓缩液中的终体积浓度为75％，离心，烘干得到成品。
最终安络小皮伞多糖的含量为61.3％，提取率为12.5％。
实施例四
步骤一、培养高产菌株H125
步骤①从母种试管中挑取，将新鲜的高产菌种H125进行一级摇瓶培养。在一级摇瓶培养过程中，50mL种子培养基装于500mL三角摇瓶中，24℃，150rpm振荡培养48h，得到一级摇瓶菌种。
步骤②再对一级摇瓶菌种进行二级摇瓶培养。将200mL种子培养基装于1000mL三角摇瓶中，接入一级摇瓶菌种50mL，26℃，150rpm振荡培养60h，得到二级摇瓶菌种。
步骤③对二级摇瓶菌种进行一级种子培养。将二级摇瓶菌种接入装有一级种子培养基的100L全自动发酵罐中。一级种子培养基用量为60L，培养温度为26℃，氧气通气量与一级种子培养基的体积比为1:0.8(v/v)，通气压力为0.6kPa，培养过程中用氨水进行补料，控制pH在6.0，初始转速为120r/min，通过调整转速控制溶氧值在60％，培养36h。
步骤④对一级种子进行二级种子培养。将一级种子接入装有二级种子培养基的500L全自动发酵罐中。二级种子培养基的用量为200L，培养温度为23℃，氧气通气量与一级种子培养基的体积比为1:0.8(v/v)，通气压力为0.5kPa，培养过程中用氨水进行补料，控制pH在6.0，初始转速为120r/min，通过调整转速控制溶氧值在60％，培养36h。
步骤⑤对二级种子进行发酵培养。将二级种子接入装有发酵培养基的5000L全自动发酵罐中。培养温度为23℃，氧气通气量与一级种子培养基的体积比为1:0.8(v/v)，压力为0.3kPa，培养过程中用氨水进行补料，控制pH在6.0，初始转速为120r/min，通过调整转速控制溶氧值在60％，发酵85h，发酵水平为9.8g/L发酵液。
种子培养基的各组分按重量百分比计：葡萄糖3％，酵母浸膏2％，牛肉膏2％，麦芽糖1％，氯化钠0.05％，磷酸二氢钾0.05％，PH值为5.5。发酵培养基的组成为：淀粉浓度40g/L，葡糖糖30g/L，牛肉膏2.0g/L，氯化钠1.0g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，PH值为6.0。
步骤二、从培养后的高产菌株H125的菌丝体中提取安络小皮伞多糖
步骤(1)将高产菌株H125的菌丝体按照质量比1：20加入蒸馏水中，然后将温度升到60℃，在搅拌下提取3h得到提取液。
步骤(2)对提取液进行第一次超滤分离。确定超滤设备的管道及容器干净后，在原料槽装入提取液，用型号为V8072-35-PMC中空纤维膜为组件，以20L/h，压力为0.15MPa的流速进行超滤分离，截留分子量10万以上的透过液。
步骤(3)再对所述透过液进行第二次超滤分离。将透过液装入原料槽中，超滤设备采用截留分子量1.0万以上的型号为HF-66-43-PM10超滤膜为组件，压力为0.3MPa，以20L/h的流速进行超滤分离。第一浓缩液用于下一步纯化。
步骤(4)将第一浓缩液再浓缩至原体积的1/6，得到第二浓缩液，再向第二浓缩液中加入体积浓度为95％的乙醇使乙醇在第二浓缩液中的终体积浓度为75％，离心，烘干得到成品。
最终安络小皮伞多糖的含量为60.6％，提取率为13.1％。
实施例五
步骤一、培养高产菌株H125
步骤①从母种试管中挑取，将新鲜的高产菌种H125进行一级摇瓶培养。在一级摇瓶培养过程中，50mL种子培养基装于500mL三角摇瓶中，22℃，150rpm振荡培养48h，得到一级摇瓶菌种。
步骤②再对一级摇瓶菌种进行二级摇瓶培养。将200mL种子培养基装于1000mL三角摇瓶中，接入一级摇瓶菌种50mL，22℃，150rpm振荡培养36h，得到二级摇瓶菌种。
步骤③对二级摇瓶菌种进行一级种子培养。将二级摇瓶菌种接入装有一级种子培养基的100L全自动发酵罐中。一级种子培养基用量为60L，培养温度为22℃，氧气通气量与一级种子培养基的体积比为1:0.5(v/v)，通气压力为0.3kPa，培养过程中用氨水进行补料，控制pH在6.0，初始转速为120r/min，通过调整转速控制溶氧值在60％，培养36h。
步骤④对一级种子进行二级种子培养。将一级种子接入装有二级种子培养基的500L全自动发酵罐中。二级种子培养基的用量为200L，培养温度为22℃，氧气通气量与一级种子培养基的体积比为1:0.5(v/v)，通气压力为0.3kPa，培养过程中用氨水进行补料，控制pH在6.0，初始转速为120r/min，通过调整转速控制溶氧值在60％，培养36h。
步骤⑤对二级种子进行发酵培养。将二级种子接入装有发酵培养基的5000L全自动发酵罐中。培养温度为22℃，氧气通气量与一级种子培养基的体积比为1:0.5(v/v)，压力为0.3kPa，培养过程中用氨水进行补料，控制pH在6.0，初始转速为120r/min，通过调整转速控制溶氧值在60％，发酵76h。
种子培养基的各组分按重量百分比计：葡萄糖2％，酵母浸膏1％，牛肉膏1％，麦芽糖0.5％，氯化钠0.05％，磷酸二氢钾0.05％，PH值为5.0。发酵培养基的组成为：淀粉浓度40g/L，葡糖糖30g/L，牛肉膏2.0g/L，氯化钠0.5g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，pH值为6.0。
步骤二、从培养后的高产菌株H125的菌丝体中提取安络小皮伞多糖
步骤(1)将高产菌株H125的菌丝体按照质量比1：20加入蒸馏水中，然后将温度升到50℃，在搅拌下提取1h得到提取液。
步骤(2)对提取液进行第一次超滤分离。确定超滤设备的管道及容器干净后，在原料槽装入提取液，用型号为V8072-35-PMC中空纤维膜为组件，以10L/h，压力为0.15MPa的流速进行超滤分离，截留分子量10万以上的透过液。
步骤(3)再对所述透过液进行第二次超滤分离。将透过液装入原料槽中，超滤设备采用截留分子量1.0万以上的型号为HF-66-43-PM10超滤膜为组件，压力为0.3MPa，以10L/h的流速进行超滤分离。第一浓缩液用于下一步纯化。
步骤(4)将第一浓缩液再浓缩至原体积的1/6，得到第二浓缩液，再向第二浓缩液中加入体积浓度为95％的乙醇使乙醇在第二浓缩液中的终体积浓度为75％，离心，烘干得到成品。
最终安络小皮伞多糖的含量为61.2％，提取率为13.1`％。
实施例六
步骤一、培养高产菌株H125
步骤①从母种试管中挑取，将新鲜的高产菌种H125进行一级摇瓶培养。在一级摇瓶培养过程中，50mL种子培养基装于500mL三角摇瓶中，26℃，150rpm振荡培养60h，得到一级摇瓶菌种。
步骤②再对一级摇瓶菌种进行二级摇瓶培养。将200mL种子培养基装于1000mL三角摇瓶中，接入一级摇瓶菌种50mL，26℃，150rpm振荡培养60h，得到二级摇瓶菌种。
步骤③对二级摇瓶菌种进行一级种子培养。将二级摇瓶菌种接入装有一级种子培养基的100L全自动发酵罐中。一级种子培养基用量为60L，培养温度为26℃，氧气通气量与一级种子培养基的体积比为1:1(v/v)，通气压力为0.8kPa，培养过程中用氨水进行补料，控制pH在6.0，初始转速为120r/min，通过调整转速控制溶氧值在60％，培养48h。
步骤④对一级种子进行二级种子培养。将一级种子接入装有二级种子培养基的500L全自动发酵罐中。二级种子培养基的用量为200L，培养温度为26℃，氧气通气量与一级种子培养基的体积比为1:1(v/v)，通气压力为0.8kPa，培养过程中用氨水进行补料，控制pH在6.0，初始转速为120r/min，通过调整转速控制溶氧值在60％，培养48h。
步骤⑤对二级种子进行发酵培养。将二级种子接入装有发酵培养基的5000L全自动发酵罐中。培养温度为26℃，氧气通气量与一级种子培养基的体积比为1:1(v/v)，压力为0.8kPa，培养过程中用氨水进行补料，控制pH在6.0，初始转速为120r/min，通过调整转速控制溶氧值在60％，发酵100h。
种子培养基的各组分按重量百分比计：葡萄糖3％，酵母浸膏2％，牛肉膏2％，麦芽糖1％，氯化钠0.1％，磷酸二氢钾0.05％，PH值为6.0。发酵培养基的组成为：淀粉浓度50g/L，葡糖糖40g/L，牛肉膏3.0g/L，氯化钠1.5g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，PH值为6.5。
步骤二、从培养后的高产菌株H125的菌丝体中提取安络小皮伞多糖
步骤(1)将高产菌株H125的菌丝体按照质量比1：50加入蒸馏水中，然后将温度升到90℃，在搅拌下提取4h得到提取液。
步骤(2)对提取液进行第一次超滤分离。确定超滤设备的管道及容器干净后，在原料槽装入提取液，用型号为V8072-35-PMC中空纤维膜为组件，以20L/h，压力为0.20MPa的流速进行超滤分离，截留分子量10万以上的透过液。
步骤(3)再对所述透过液进行第二次超滤分离。将透过液装入原料槽中，超滤设备采用截留分子量1.0万以上的型号为HF-66-43-PM10超滤膜为组件，压力为0.4MPa，以20L/h的流速进行超滤分离。第一浓缩液用于下一步纯化。
步骤(4)将第一浓缩液再浓缩至原体积的1/6，得到第二浓缩液，再向第二浓缩液中加入体积浓度为95％的乙醇使乙醇在第二浓缩液中的终体积浓度为75％，离心，烘干得到成品。
最终安络小皮伞多糖的含量为60.7％，提取率为12.5％。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (6)

1.一种安络小皮伞菌株(Marasmiellusandrosaceus)，其保藏号为：CGMCCNo.11734。
2.如权利要求1所述的安络小皮伞菌株在生产安络小皮伞多糖中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)将所述安络小皮伞菌株的菌丝体加入水中，菌丝体和水的质量比为1﹕20～1﹕50，然后将温度升到50～90℃，提取1～4h得到提取液；
步骤(2)对提取液进行第一次超滤分离，第一次超滤分离采用V8072-35-PMC中空纤维膜，流速为10～20L/h，压力为0.15～0.20MPa，得到透过液；
步骤(3)再对所述透过液进行第二次超滤分离，第二次超滤分离采用HF-66-43-PM10超滤膜，流速为10～20L/h，压力为0.3～0.4MPa，得到第一浓缩液；
步骤(4)采用乙醇沉淀法处理所述第一浓缩液，得到安络小皮伞多糖。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(4)的具体过程为：先将所述第一浓缩液浓缩至原体积的1/6，得到第二浓缩液，再向第二浓缩液中加入乙醇使乙醇在第二浓缩液中的终体积浓度为75～80％，静置时间为5～8h。
5.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中，培养所述安络小皮伞菌株以制备得到菌丝体，培养过程中，种子培养基的各组分按重量百分比计：葡萄糖2％～3％，酵母浸膏1～2％，牛肉膏1～2％，麦芽糖0.5～1％，氯化钠0.05～0.1％，磷酸二氢钾0.05％，PH值为5.0～6.0，发酵培养基的组成为：淀粉浓度40～50g/L，葡糖糖30～40g/L，牛肉膏2.0～3.0g/L，氯化钠0.5～1.5g/L，磷酸二氢钾0.1～0.3g/L，PH值为6.0～6.5。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中，培养所述安络小皮伞菌株的具体过程为：
步骤①对所述安络小皮伞菌株进行一级摇瓶培养，一级摇瓶培养基为所述种子培养基，在22～26℃，150rpm振荡培养48～60h，得到一级摇瓶菌种；
步骤②对一级摇瓶菌种进行二级摇瓶培养，二级摇瓶培养基为所述种子培养基，22～26℃，150rpm振荡培养36～60h，得到二级摇瓶菌种；
步骤③对二级摇瓶菌种进行一级种子培养，一级种子培养基为所述种子培养基，培养温度为22～26℃，氧气通气量与一级种子培养基的体积比为1:0.5～1.0，通气压力为0.3～0.8kPa，培养过程中用氨水进行补料，控制pH在6.0，初始转速为120r/min，通过调整转速控制溶氧值在60％，培养36～48h，得到一级种子；
步骤④对一级种子进行二级种子培养，二级种子培养基为所述种子培养基，培养温度为22～26℃，氧气通气量与二级种子培养基的体积比为1:0.5～1.0，通气压力为0.3～0.8kPa，培养过程中用氨水进行补料，控制pH在6.0，初始转速为120r/min，通过调整转速控制溶氧值在60％，培养36～48h，得到二级种子；
步骤⑤对二级种子进行发酵培养，发酵所采用的培养基为所述发酵培养基，培养温度为22～26℃，氧气通气量与发酵所采用的培养基的体积比为1:0.5～1.0，通气压力为0.3～0.8kPa，培养过程中用氨水进行补料，控制pH在6.0，初始转速为120r/min，通过调整转速控制溶氧值在60％，培养76～100h。
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