CN104830696A - 一种高产安络小皮伞诱变菌株及培育方法 - Google Patents

Abstract

一种高产安络小皮伞诱变菌株及培育方法。本发明公开了一种安络小皮伞诱变菌株及其培育方法，于2013年5月6日在中国典型培养物保藏中心保藏，分类名称：安络小皮伞T08 Marasmius androsaceus sp. T08，保藏登记号为CCTCC NO.M2013175。该诱变的安络小皮伞新菌株经10代以上传代培养不退化，具有遗传稳定性，并且发酵菌丝体胞内多糖含量比原始菌株高出许多倍。

Description

一种高产安络小皮伞诱变菌株及培育方法

技术领域

本发明公开一种安络小皮伞诱变菌株，为一种新的菌株品种，本发明还提供了该菌株的培育方法，属于微生物技术领域。

背景技术

安络小皮伞Marasmius androsaceus是伞菌目白蘑科小皮伞属野生真菌。其发酵培养得到的菌丝体产物可治疗多种神经痛、风湿痛、神经炎和类风湿性关节炎等疾病，均取得显著疗效。

在本发明中，选育了一株安络小皮伞优良高产菌株，其发酵产物菌丝体产量较野生型安络小皮伞有显著提高，对其深入研究和广泛应用具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种安络小皮伞诱变菌株，为一种新的菌株，其发酵产物菌丝体产量较原始野生菌相比有显著提高。

本发明还提供了该菌株的培育方法，适用于工业化生产。

本发明的安络小皮伞诱变菌株：在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址：武汉武汉大学，保藏日期：2013年5月6日，分类名称：安络小皮伞T08 Marasmius androsaceus sp. T08，保藏登记号为CCTCC NO.M 2013175。

本发明所述的安络小皮伞菌株培育方法，包括以下步骤：

1）将安络小皮伞诱变菌株T08，接种于PDA斜面，26℃恒温箱中培养7-10天，向斜面试管中注入无菌生理盐水，振荡后用无菌脱脂棉过滤，稀释成浓度为1×10⁶个/mL的孢子悬液；

2）取制备得到的孢子悬液5 mL，转入灭菌的发酵培养基中，在温度26℃，150rpm转速的恒温摇床中6天后；

3）将活化的菌株进行传代，传代后26℃，150rpm 恒温摇床中培养6天，收集菌丝体产物，测定菌丝体干重。

4）菌株适宜的发酵培养基按照以下药物重量份数比配制：蔗糖20 g/L、酵母浸粉20 g/L、MgSO₄·7H₂O 3 g/L、KH₂PO₄ 3 g/L。

本发明所述的安络小皮伞诱变株的特征为：

1）安络小皮伞诱变菌株菌丝体干重和胞内多糖含量与原始菌株相比均有显著提高，其中菌丝体干重可达11122 g/L，较原始菌株提高了3434%；胞内多糖含量可达123g/L，较原始菌株提高了123123%。

2）经过10次以上的连续传代培养不退化，具有遗传稳定性。

本发明的积极效果在于：诱变的安络小皮伞新菌株经10次以上传代培养不退化，具有遗传稳定性，并且发酵产物菌丝体产量和胞内多糖含量远远高于原始菌株。

具体实施方法

为了便于理解本发明，特例举以下实施例。其作用被理解为是对本发明的阐释而非对本发明的任何形式的限制。

实施例1： 安络小皮伞突变株的诱变和选育方法

（1）安络小皮伞诱变

将安络小皮伞原始菌株Marasmius androsaceus 50030，接种于PDA斜面，26℃恒温箱中培养7天，向斜面试管中注入无菌生理盐水1.0 mL，振荡后用无菌脱脂棉过滤，稀释成浓度为1×10⁶个/mL的孢子悬液。取孢子悬液2 mL，加入1 mL 0.2M NaNO₂溶液和1 mL pH4.4 醋酸缓冲液，室温震荡并计时，诱变30 min，取0.1 mL悬液加入到5 mL 0.2M pH8.0 磷酸缓冲液中，终止诱变，取诱变后孢子悬液于无菌生理盐水中逐级稀释，PDA培养基平板培养6天后，将菌株于48孔板保存。用灭菌的牙签将48孔板中菌株挑到PDA培养基的平板上，每板20个菌落，26℃恒温培养箱中培养5天；将生长较迅速的菌落，再次挑到PDA培养基中，每板10株左右，26℃恒温培养箱中培养5天；将生长较迅速的菌落挑到盛有PDA培养基的摇瓶中复苏6 天；将菌株传代培养，在盛有100 mL PDA培养基的250 mL锥形瓶中，接种安络小皮伞诱变菌株菌悬液3 mL，26℃恒温摇床中培养6 天。将诱变得到的突变菌株保存于试管斜面培养基中，离心菌丝体，5000 rpm，离心10 min，水洗一次，菌丝体铺于平板冻干，冻干粉末称重，粉碎，过60目筛。

（2）胞内多糖成分的提取及含量测定

    称取安络小皮伞菌丝体干粉0.1g，加入5ml蒸馏水，80℃水浴提取3h，8000rpm离心10min，取上清液测定菌丝体胞内多糖含量。采用蒽铜-硫酸法测定总糖含量，DNS方法测定还原糖含量，多糖含量=总糖含量 - 还原糖含量。

（3）高产诱变株的筛选

从诱变的安络小皮伞突变体中，筛选出菌丝体干重明显提高的优良菌株（见表1），然后进行传代培养，每隔一代测定菌株干重，测量方法同步骤（1），共培养10代，考察筛选得到高产诱变株的稳定遗传特征。

表1  诱变菌株四项指标提高值 

指标	原始菌株	T08	提高值（%）
				干重（g/L)	1.037	1.321	27.39
胞内多糖（g/L)	0.246	0.391	58.94

实施例2：

安络小皮伞诱变菌株发酵培养基的优化

以菌丝体干重为考察指标，进行安络小皮伞诱变菌株T08发酵培养基的优化。

在培养基优化的过程中，利用单因素实验对影响期望值的碳源和氮源种类分别进行考察。

1）碳源种类筛选

以PDA培养基为基础培养基，分别采用20 g/L蔗糖、果糖、甘油、麦芽糖、乳糖和葡萄糖作为碳源，制备培养基，培养基装液量为100 mL/250 mL，分别以5%的接种量接入种子液，150 rpm、26℃培养6天。测定每种碳源培养基条件下各菌丝体干重，以选择合适的碳源种类。结果采用蔗糖作为碳源时，其值最高，因此选择蔗糖为最佳碳源。

2）氮源种类筛选

以PDA培养基为基础培养基，分别采用20 g/L大豆蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨和酵母浸粉作为氮源，制备培养基，培养基装液量为100mL/250mL，以5%的接种量接入种子液，150rpm、26℃培养6天。测定每种氮源培养基条件下各菌丝体干重，以选择合适的碳源种类。结果采用蔗糖作为碳源时，其值最高，因此选择酵母浸粉为最佳碳源。

综合上述实验结果，该安络小皮伞诱变菌株的培养基配方为（g/L）：蔗糖 20、酵母浸粉20、MgSO₄·7H₂O 3、KH₂PO₄ 3。

Claims (3)

1.一种安络小皮伞诱变菌株，于2013年5月6日在中国典型培养物保藏中心保藏，分类名称：安络小皮伞T08 Marasmius androsaceus sp. T08，保藏登记号为CCTCC NO.M 2013175。

2. 培养权利要求1所述安络小皮伞诱变菌株的方法，包括以下步骤：

1）将安络小皮伞原始菌株Marasmius androsaceus 50030，接种于PDA斜面，24-26℃恒温箱中培养5-7 天，向斜面试管中注入无菌生理盐水，振荡后用无菌脱脂棉过滤，稀释成浓度为1×10⁶个/mL的孢子悬液；

2）取孢子悬液2 mL，加入1 mL 0.2M NaNO₂溶液和1 mL pH4.4 醋酸缓冲液，室温震荡并计时，诱变30 min，取0.1 mL悬液加入到5 mL 0.2M pH8.0 磷酸缓冲液中，终止诱变，取诱变后孢子悬液于无菌生理盐水中逐级稀释，PDA培养基平板培养5-7天后，将菌株于48孔板保存；

3）用灭菌的牙签将48孔板中菌株挑到PDA培养基的平板上，用平板筛选生长迅速的菌株；

4）筛选生长较迅速的菌落，将其挑到盛有PDA培养基的摇瓶中复苏6 d；将菌株传代培养，在盛有100 mL PDA培养基的250 mL锥形瓶中，接种安络小皮伞诱变菌株菌悬液3 mL，26℃恒温摇床中培养6 d；

将诱变得到的突变菌株保存于试管斜面培养基中，离心菌丝体，5000 rpm，离心10 min，水洗一次，菌丝体铺于平板冻干，冻干粉末称重，粉碎，过60目筛，测定其胞内多糖含量，筛选高产的安络小皮伞菌株；

5）获得的高产安络小皮伞诱变菌株经过连续传代，培养条件为26℃，150rpm恒温摇床中培养6天，测定菌丝体干重和胞内多糖含量，考查诱变菌株的遗传稳定性，从而最终确定目的菌株。

3. 培养权利要求1所述的安络小皮伞诱变菌株的培养基，其特征在于是由以下药物按重量份数比制成的：

蔗糖20 g/L、酵母浸粉20 g/L、MgSO₄·7H₂O 3 g/L、KH₂PO₄ 3 g/L。