CN104877914B

CN104877914B - 一种高产猴头菌诱变菌株h07及制备方法

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Publication number: CN104877914B
Application number: CN201510289395.6A
Authority: CN
Inventors: 滕利荣; 张峻榕; 逯家辉; 胡爽; 孟庆繁; 闫国栋; 蔡广胜; 张洋; 权宇彤
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2015-06-01
Filing date: 2015-06-01
Publication date: 2018-12-14
Anticipated expiration: 2035-06-01
Also published as: CN104877914A

Abstract

本发明公开了一种猴头菌诱变菌株及其培育方法，于2014年12月26日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址：武汉大学，分类名称：猴头菌H07 Hericium erinaceus H07；保藏登记号为CCTCC NO：M 2014669。该菌株是通过化学诱变筛选分离得到的，其菌丝体干重提高了73%，多糖含量提高了69%，腺苷含量提高了20%，蛋白质含量提高了51%。本发明的猴头菌诱变菌株经10代以上传代培养不退化，具有遗传稳定性。本发明还公开了猴头菌诱变菌株的最适发酵培养基。

Description

一种高产猴头菌诱变菌株H07及制备方法

技术领域

本发明涉及到一种高产猴头菌诱变菌株H07及制备方法，为一种新的菌株品种，本发明还提供了该菌株的培育方法，属于生物发酵工程技术领域。

背景技术

猴头菌属于一种药食两用真菌，在分类学上隶属真菌界，担子菌门，担子菌纲，猴菇目，猴菇科。猴头菌所含有的营养成分与目前人工栽培的其他食用菌相比都居第一、二位。对猴头菌的基础与临床应用研究证实猴头菌拥有可靠的药效。它具有营养神经作用，治疗消化道疾病，抗肿瘤，并有促进人体新陈代谢，提高免疫力，增强人体抗病的活性能力。因为其毒副作用少，药效可靠，所以它具有很大的开发利用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一株猴头菌诱变菌株H07，为一种新的菌株，其菌丝体干重及有效成分多糖、腺苷、蛋白质的产量和原始菌株相比具有显著提高。

本发明还提供了该菌株的培育方法,适用于工业化生产。

本发明所述的猴头菌诱变菌株H07：于2014年12月26日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址：武汉大学，分类名称：猴头菌H07Hericium erinaceus H07；保藏登记号为CCTCC NO：M 2014669。

本发明所述的猴头菌诱变菌株H07，用以下方法诱变选育而制得，以猴头菌(CICC14026)为出发菌株，采用化学诱变处理技术，选育出高产的猴头菌高产突变菌株H07。

猴头菌诱变菌株H07的特征为：菌丝体干重、多糖、腺苷和蛋白质的含量均有明显提高，其中菌丝体干重较原出发菌株提高了73％，腺甘含量提高了20％，蛋白质含量提高了51％，多糖含量提高了69％。

该猴头菌诱变菌株H07菌丝生长快速，菌丝体为乳白色，可进行快速液体深层培养，该菌株的液体深层发酵特征如下：

(1)一级斜面菌种

斜面培养基：葡萄糖18～20g/L，胰蛋白陈18～20g/L，KH₂PO₄2～3g/L，MgSO₄.7H₂O1.0～2.0g/L，维生素B₁0.05～0.1g/L，琼脂15.0～18.0g/L；

斜面菌种培养温度26±1℃，3～5天菌丝长满斜面，放冰箱(2～4℃)保存备用；

(2)二级摇瓶菌种

种子培养基：葡萄糖18～20g/L，胰蛋白陈18～20g/L，KH₂PO₄2～3g/L，MgSO₄.7H₂O1.0～2.0g/L，维生素B₁0.05～0.1g/L；

种子培养方法：将斜面母种接入液体种子培养基，在26±1℃,120～160r/min的摇床培养6d；

(3)摇瓶发酵培养

将种子液按5％接种量接入液体发酵培养基(葡萄糖20～25g/L，胰蛋白陈20～25g/L，KH₂PO₄2～4g/L，MgSO₄.7H₂O 2.0～4.0g/L，维生素B₁0.1～0.2g/L)中进行液体发酵，发酵培养基装液量为250mL的摇瓶装100mL，培养温度26℃，摇床转速为150rpm，培养5d后收获菌丝体；

(4)100L发酵罐放大培养

将种子液按6％接种量接入60L液体发酵培养基中，于100L发酵罐中进行液体深层发酵培养，26℃，180r/min，通气量4L/min，初始pH为5.0，培养48h。

本发明培养猴头菌诱变菌株H07的培养基，其特征在于是由以下原料按重量份数比制成的：葡萄糖20.032g/L，胰蛋白陈19.976g/L，KH₂PO₄3.021/L，MgSO₄.7H₂O 1.793g/L，维生素B₁0.095g/L。

本发明的积极效果在于：诱变的猴头菌诱变菌株经10次以上传代培养不退化，具有遗传稳定性，菌丝体干重、多糖、腺苷和蛋白质的含量均有明显提高，其中菌丝体干重较原出发菌株提高了73％，腺甘含量提高了20％，蛋白质含量提高了51％，多糖含量提高了69％。

附图说明

图1为原出发菌株与株突变株的有效成分比较；

图2为葡萄糖浓度和胰蛋白胨浓度对D值影响的响应面和等高线图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，特例举以下实施例。其作用被理解为是对本发明的阐释而非对本发明的任何形式的限制。

实施例1：

猴头菌诱变菌株H07的诱变和选育方法。

本发明所述获得高产猴头菌诱变菌株的诱变方法为亚硝基胍化学诱变。

1)将猴头菌(CICC 14026)菌株，以3％接种量接种至产孢培养基中，产孢培养基的培养为：葡萄糖20.032g/L，胰蛋白陈19.976g/L，KH₂PO₄3.021/L，MgSO₄.7H₂O 1.793g/L，维生素B₁0.095g/L。26℃恒温摇床中150r/min培养4天后，将猴头菌菌株，接种于斜面培养基中(葡萄糖20g/L，胰蛋白陈20g/L，KH₂PO₄3g/L，MgSO₄.7H₂O 2.0g/L，维生素B₁0.1g/L，琼脂18.0g/L)，23～26℃恒温箱中培养5天，向斜面试管中注入无菌生理盐水，振荡后用无菌脱脂棉过滤，稀释成浓度为2×10⁷～3×10⁷个/mL的孢子悬液；

2)在培养皿中加入亚硝基胍10mg及0.5mL丙酮后，用PH＝6.0无菌磷酸缓冲液9mL溶解亚硝基胍，亚硝基胍终浓度为1mg/mL，加入步骤1)中得到的孢子悬液1mL，开始诱变；分别诱变2～25min之后，取菌悬液于无菌蒸馏水中逐级稀释，至浓度为3×10⁷个/mL，斜面培养基培养3～5天后，将菌株于96孔板保存；

3)利用平板初步筛选生长迅速的菌株；

4)将筛选获得的菌株在摇瓶中复苏，传代后26℃150rmp恒温摇床中培养3～5天，得菌丝体。

5)获得的高产诱变猴头菌诱变菌株经过连续传代，培养条件为26℃，150r/min恒温摇床中培养80h，测定各代的菌丝体干重、多糖、腺苷和蛋白质的含量，以筛选高产突变株。采用HPLC法测定菌丝体中腺甘含量；采用苯酚—硫酸法测定多糖含量；利用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。

共得到3株高产菌株分别命名为H07、H12、H15，其中H07的干重、多糖、腺苷和蛋白质含量均高于出发菌株，这3株突变株与出发菌株的有效成分比较见图1。选取H07为高产突变株，命名为：猴头菌Hericium erinaceus，该诱变菌株已于2014年12月26日保藏于《中国典型培养物保藏中心》，保藏号为：CCTCC NO：M 2014669，根据真菌的系统分类学和鉴定的进化树表明，菌株属于真菌界，担子菌门，担子菌纲，猴菇目，猴菇科。

实施例2：

猴头菌诱变菌株H07与出发菌株比较及遗传稳定性考察

1)将原始出发菌株与诱变菌株H07分别再培养于种子培养基(葡萄糖20～25g/L，胰蛋白陈20～25g/L，KH₂PO₄2～4g/L，MgSO₄.7H₂O 2.0～4.0g/L，维生素B₁0.1～0.2g/L)中，于26℃，150r/min培养5d进行发酵培养，猴头菌诱变菌株菌丝体干重、多糖、腺苷和蛋白质的含量均有明显提高，菌体体干重达6.733g/L，较原始出发菌提高了73％；多糖含量可达1.573g/L，较原出发菌提高了69％；腺苷含量可达0.0237/L，较原出发菌提高了20％；蛋白质含量可达1.621g//L，较原出发菌提高了51％。

表1.原始出发菌株与诱变菌株工H07有效成分含量比较

	干重(g·L^-1)	多糖(g·L^-1)	腺苷(mg·L^-1)	蛋白质(g·L^-1)
					原始出发菌株	3.894	0.932	0.198	1.075
诱变菌株	6.733	1.573	0.237	1.621
					提高比例	73％	69％	20％	51％

2)为了研究诱变菌株的高生产性能遗传特性是否稳定，采用群体传代的方法考察了高产诱变菌株H07的遗传稳定性，菌株连续传代培养十代，每一代分别接种到种子培养基中，于26℃，150r/min培养5d进行发酵培养，发酵结束后测有效成分的产量。

表2.诱变菌株工LN10遗传稳定性考察

传代次数	干重(g·L^-1)	多糖(g·L^-1)	腺苷(mg·L^-1)	蛋白质(g·L^-1)
					第1代	6.733	1.573	0.237	1.621
第2代	6.702	1.567	0.219	1.619
					第3代	6.734	1.562	0.199	1.620
第4代	6.689	1.567	0.220	1.599
					第5代	6.701	1.570	0.229	1.613
第6代	6.691	1.570	0.236	1.609
					第7代	6.812	1.621	0.260	1.681
第8代	6.677	1.558	0.229	1.621
					第9代	6.713	1.569	0.236	1.619
第10代	6.731	1.571	0.237	1.617

实施例3：

猴头菌高产诱变菌株H07发酵培养基的筛选

1)期望函数的建立

分别以菌丝体干重、多糖、腺苷和蛋白质含量的产量为考察指标，对猴头菌高产菌株发酵工艺进行优化，采用期望函数将多个考察指标综合为一个考察指标期望值(D)，每一个考察指标(响应值)均按式(1)转换成无量纲的期望值，期望函数的平衡尺度d范围为0～1，d＝0时说明响应值严重偏离目标值，d＝1说明响应值与目标值接近。d随着所期望的响应值增加而增加。

为第i个考察指标的响应值，L_i为第i个考察指标期望不能低于该响应值；E_i第i个考察指标期望的最高响应值。

w_i为第i个指标的权重值，猴头菌诱变菌株发酵的考察指标和期望最低响应值，期望最高响应值及权重值如表3所示。

表3考察指标和期望最低响应值,最高响应值及权重值

指标	干重(g·L^-1)	多糖(g·L^-1)	腺苷(mg·L^-1)	蛋白质(g·L^-1)
					L_i	3.00	2.00	0.00	0.10
E_i	20.0	3.00	0.15	0.50
					w_i	0.25	0.10	0.20	0.35

2)猴头菌诱变菌株H07发酵碳源筛选

以种子培养基为初始培养基。分别考察以葡萄糖、乳糖、蔗糖、淀粉、果糖、麦芽糖作为碳源，碳源浓度为20g/L，其它成分固定，进行发酵培养，筛选出20g/L葡萄糖为最优碳源。发酵条件为：种龄为3d，接种量为5％，装液量为250mL的摇瓶装100mL，培养温度26℃，摇床转速为150r/min，培养时间为5d。

3)猴头菌诱变菌株H07发酵氮源筛选

以种子培养基为初始培养基。分别考察以胰蛋白酶、蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母浸粉和牛肉膏，氮源浓度为20g/L，而其它成分不变进行发酵培养，筛选出20g/L胰蛋白酶为最适氮源。

4)PB试验筛选猴头菌诱变菌株H07发酵培养基中影响显著的成分

进行PB试验筛选碳源、氮源对猴头菌诱变菌株H07发酵影响显著成分的分析。结果其中的葡萄糖(X₁)、胰蛋白酶(X₂)为显著项。因此，选用葡萄糖、胰蛋白酶进一步优化。

5)爬坡试验逼近影响显著成分的最优浓度

在PB试验的基础进行爬坡试验设计，使影响显著成分的浓度接近最优区域。

6)猴头菌诱变菌株发酵中心组合设计试验

在以上试验的基础上进行中心组合试验，葡萄糖、胰蛋白胨以期精确优化猴头菌诱变菌株发酵培养基，分别采用多元二次回归模型(RSM)，对试验结果进行相应的分析并搜寻最优培养基方案。对RSM拟合的模型进行统计分析，图2显示葡萄糖和胰蛋白酶的交互作用对期望值D的影响，交互作用显著。统计学分析方法得到的最佳培养基配方为：葡萄糖20.05g/L，胰蛋白陈20.21/L，KH₂PO₄3.01/L，MgSO₄.7H₂O 1.93g/L，维生素B₁0.15g/L。在培养条件为：150r/min，26℃，培养5d，此时得到的D值为0.55147。

Claims

1.一种猴头菌诱变菌株H07：于2014年 12月26 日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址：武汉大学，分类名称：猴头菌（Hericium erinaceus） H07；保藏登记号为CCTCC NO：M 2014669。