CN102559513B - 一种高产白囊耙齿菌诱变菌株及培育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种白囊耙齿菌诱变菌株及其培育方法，该菌株（CCTCC NO：M2011146）是通过化学诱变筛选分离得到的，其菌丝体干重较原出发菌株提高了25.00%，腺苷含量提高了17.07%，甘露醇含量提高了45.60%，多糖含量提高了139.25%。本发明的白囊耙齿菌诱变菌株经10次以上传代培养不退化，具有遗传稳定性。本发明还公开了白囊耙齿菌诱变菌株的最适发酵培养基。
Description
技术领域
本发明涉及到一种高产白囊耙齿菌诱变菌株，为一种新的菌株品种，本发明还提供了该菌株的培育方法，属于生物发酵工程技术领域。
背景技术
白囊耙齿菌（Irpex lacteus Fr.）是木材腐朽真菌的一种，属于非褶菌目，多孔菌科，耙齿菌属，别名白囊孔。白囊耙齿菌的发酵提取物具有抗菌、消炎、利尿作用，用于治疗因免疫功能失调而引起的慢性肾小球肾炎，为“益肾康胶囊”的原料。目前，临床主要用于治疗因肾小球肾炎所导致的尿少、浮肿、腰痛、血压升高等症，能明显消除或减少慢性病人的尿蛋白、红细胞，是极具市场潜力的抗肾炎药物。它的主要生物活性物质是多糖、多肽和皂甙。白囊耙齿菌的多糖具有免疫调节作用，具体功能是通过双向免疫调节，提高巨噬细胞的吞噬能力，灭杀致病因素；促进细胞因子的产生，增强体液免疫反应，隔离致病因素。
发明内容
本发明的目的是提供一株白囊耙齿菌诱变菌株，为一种新的菌株，其有菌丝体干重及效成分腺苷、多糖和虫草酸的产量和原始菌株相比具有显著提高。
本发明公开了上述菌的培育方法。
本发明还提供了白囊耙齿菌诱变菌株多糖提取的最佳工艺条件。
本发明的目的是通过如下的技术方案实现的：
本发明公开的白囊耙齿菌诱变菌株，命名为：白囊耙齿菌ILN10（Irpex lacteusFr. ILN10），该诱变菌株已于2011年4月28日保藏《中国典型培养物保藏中心》，保藏号为：CCTCC NO：M 2011146，根据真菌的系统分类学和鉴定的进化树表明，菌株属于，属于非褶菌目，多孔菌科，耙齿菌属。
本发明所述的高产白囊耙齿菌诱变菌株ILN10，其有以下方法诱变选育而制得，以白囊耙齿菌为出发菌株，采用高压诱变处理技术，选育出高产的白囊耙齿菌高产突变菌株ILN10。
白囊耙齿菌诱变菌株ILN10的特征为：菌丝体干重、腺苷、甘露醇及多糖的含量均有明显提高，其中菌丝体干重较原出发菌株提高了25.00 %，腺苷含量提高了17.07%，甘露醇含量提高了45.60%，多糖含量提高了139.25%。
该白囊耙齿菌诱变株ILN10菌丝生长快速，菌丝体为白色，可进行快速液体深层培养，该菌株的液体深层发酵特征如下：
（1）一级斜面菌种：
斜面培养基：葡萄糖18-22 g/L，蛋白胨8-12 g/L，酵母浸粉8-12 g/L，KH2PO4 0.1-0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.1-0.5 g/L，维生素B1 0.05-0.1 g/L，琼脂18 g/L。
斜面菌种培养温度26±1℃，4-5天菌丝长满斜面，放冰箱（2-4℃）保存备用。
（2）二级摇瓶菌种
种子培养基：葡萄糖18-22 g/L，蛋白胨8-12 g/L，酵母浸粉8-12 g/L， KH2PO4 0.1-0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.1-0.5 g/L，维生素B1 0.05-0.1 g/L。
种子培养方法：将斜面母种接入液体种子培养基，在26±1℃，120-160 r/min的摇床培养6 d。
（3）摇瓶发酵培养
将种子液按5%接种量接入液体发酵培养基（乳糖：26-27 g/L，酵母浸粉：23-24 g/L，(NH4)2SO4：0.30-0.35 g/L，KH2PO4：0.4-0.5 g/L，MgSO4：0.4-0.5 g/L，VB1：0.01-0.15 g/L）中进行液体发酵，发酵培养基装液量为250mL的摇瓶装100mL，培养温度26℃，摇床转速为150rpm，培养5 d后收获菌丝体。
（4）100L发酵罐放大培养
将种子液按7 %接种量接入60L液体发酵培养基中,于100L发酵罐中进行液体深层发酵培养，26℃，200 r/min，通气量4 L/min，初始pH为5.0，培养40 h。
本发明培养白囊耙齿菌诱变株的培养基，其特征在于是由以下原料按重量份数比制成的：蛋白胨 4.1466 g/L，酵母浸粉 2.0426 g/L，葡萄糖 5.0954 g/L，MgSO4 0.1652 g/L和VB1 0.0280 g/L。
本发明的积极效果在于：诱变的白囊耙齿菌诱变株经10次以上传代培养不退化，具有遗传稳定性。
附图说明
图1为原出发菌株与株突变株的有效成分比较；
图2为乳糖浓度和酵母浸粉浓度对D值影响的响应面和等高线图。
具体实施方式
实施例1、白囊耙齿菌诱变株ILN10的诱变和选育方法
本发明所述获得高产白囊耙齿菌诱变菌株的诱变方法为亚硝基胍诱变。
1) 将白囊耙齿菌菌株，以3%接种量接种至产孢培养基中，产孢培养基的培养为：蛋白胨 4.1466 g/L，酵母浸粉 2.0426 g/L，葡萄糖 5.0954 g/L，MgSO4 0.1652 g/L和VB1 0.0280 g/L。26℃恒温摇床中150rpm培养4天，无菌脱脂棉过滤，得到孢子悬液；
2) 在无菌条件下将步骤 1)中得到的孢子悬液1mL装入铝箔聚丙烯袋中，封口。在温度26℃、压力200M Pa条件下处理30min后，取孢子悬液于无菌蒸馏水中逐级稀释，涂布至种子培养基平板培养3-4天后，将菌株于96孔板保存；
3） 将培养好的突变株用接种针逐个接种至种子培养基中进行活化，于26℃恒温摇床中150rpm培养4天，测定菌丝体干重、腺苷、多糖和甘露醇含量，以筛选高产突变株。采用HPLC法测定菌丝体中腺苷含量；采用蒽铜－硫酸法测定总糖含量；利用分光光度法测定甘露醇含量。
共得到4株高产菌株分别命名为ILN10、ILN16、ILN19和ILN23，其中ILN10的干重、腺苷、多糖和甘露醇含量均高于出发菌株，这四株突变株与出发菌株的有效成分比较见图1。选取ILN10为高产突变株，命名为：白囊耙齿菌Irpex lacteus，该诱变菌株已于2011年5月5日保藏《中国典型培养物保藏中心》，保藏号为：CCTCC NO：M 2011146，根据真菌的系统分类学和鉴定的进化树表明，菌株属于非褶菌目，多孔菌科，耙齿菌属。
实施例2、白囊耙齿菌诱变株ILN10与出发菌株比较及遗传稳定性考察
1） 将原出发菌株与诱变菌株ILN10分别再种子培养基（葡萄糖17-25 g/L，蛋白胨8-15 g/L，酵母浸粉8-15 g/L，KH2PO4 0.1-0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.1-0.5 g/L，维生素B1 0.05-0.1 g/L）中，于26℃，150rpm，培养5 d进行发酵培养，白囊耙齿菌诱变菌株菌丝体干重、腺苷、甘露醇及多糖的含量均有明显提高，其中，菌体体干重达6.40 g/L，较原出发菌提高了25.00 %；腺苷含量可达0.0348 g/L，较原出发菌提高了17.07％；甘露醇含量可达0.1275 g/L，较原出发菌提高了45.6%；多糖含量可达1.0792 g/L，较原出发菌提高了139.25%。
表1 原出发菌株与诱变菌株ILN10有效成分含量比较
| 干重（g·L-1） | 腺苷（mg·L-1） | 甘露醇（g·L -1） | 多糖（g·L -1） | |
| 原出发菌株 | 5.12 | 0.0297 | 0.08758 | 0.4511 |
| 诱变菌株ILN10 | 6.40 | 0.0348 | 0.1275 | 1.0792 |
| 提高比率（%） | 25.00 | 17.07 | 45.60 | 139.25 |
2） 为了研究诱变菌株的高生产性能遗传特性是否稳定，采用群体传代的方法考察了诱变菌株ILN10的遗传稳定性，菌株连续传接十代，每一代分别接种到种子培养基中，于26℃，150rpm，培养5 d进行发酵培养，发酵结束后测有效成分的产量。
表2 诱变菌株ILN10遗传稳定性考察
| 传代次数 | 干重（g·L-1） | 腺苷（mg·L-1） | 甘露醇（g·L -1） | 多糖（g·L -1） |
| 第1代 | 6.40 | 0.0348 | 0.1275 | 1.0792 |
| 第2代 | 6.44 | 0.0351 | 0.1243 | 1.0654 |
| 第3代 | 6.58 | 0.0338 | 0.1195 | 1.0352 |
| 第4代 | 6.38 | 0.0354 | 0.1266 | 1.1045 |
| 第5代 | 6.52 | 0.0332 | 0.1214 | 1.0583 |
| 第6代 | 6.25 | 0.0346 | 0.1298 | 1.0298 |
| 第7代 | 6.30 | 0.0354 | 0.1302 | 1.0357 |
| 第8代 | 6.48 | 0.0341 | 0.1282 | 1.0863 |
| 第9代 | 6.35 | 0.0345 | 0.1229 | 1.0472 |
| 第10代 | 6.43 | 0.0336 | 0.1251 | 1.0548 |
实施例3、白囊耙齿菌诱变株ILN10发酵培养基的筛选
1） 期望函数的建立
分别以菌体干重，胞内多糖，腺苷，甘露醇为考察指标，对诱变菌株ILN10发酵工艺进行优化，采用期望函数将多个考察指标综合为一个考察指标期望值（D），每一个考察指标（响应值）均按式（1）转换成无量纲的期望值，期望函数的平衡尺度d范围为0～1，d=0时说明响应值严重偏离目标值，d=1说明响应值与目标值接近。d随着所期望的响应值增加而增加。
wi为第i个指标的权重值，白囊耙齿菌发酵的考察指标和期望最低响应值，期望最高响应值及权重值如表1
表1考察指标和期望最低响应值，最高响应值及权重值
| 指标 | 干重/g·L-1 | 腺苷/g·L-1 | 甘露醇/g·L-1 | 胞内多糖/g·L-1 |
| L i | 2.00 | 0.01 | 0.00 | 0.10 |
| E i | 15.00 | 0.15 | 0.80 | 2.50 |
| w i | 0.25 | 0.30 | 0.15 | 0.30 |
2）白囊耙齿菌诱变株ILN10发酵碳源筛选
以种子培养基为初始培养基。分别考察以葡萄糖、牛肉膏、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、甘油、淀粉作为碳源，碳源浓度为20 g/L其它成分固定，进行发酵培养，筛选出20 g/L乳糖为最优碳源。发酵条件为：种龄为3.5 d，接种量为5 %，装液量为250 mL的摇瓶装100 mL，培养温度26 ℃，摇床转速为150 rpm，培养时间为5 d。
3）白囊耙齿菌诱变株ILN10发酵氮源筛选
以20 g/L乳糖碳源，分别采用20 g/L乙酸胺、多价胨、大豆蛋白胨、硫酸铵，酵母浸粉和酵母膏，而其它成分不变进行发酵培养，筛选出20 g/L酵母浸粉为最适氮源。
4）PB试验筛选白囊耙齿菌诱变株ILN10发酵培养基中影响显著的成分
在以上试验的基础上，进行BP试验筛选乳糖、母浸粉及无机盐对诱变菌株ILN10发酵影响显著的成分。结果其中的乳糖（X 1）、酵母浸粉（X 2）、 (NH4)2SO4（X 7）为显著项。因此，选用乳糖、酵母浸粉、(NH4)2SO4进一步优化。
表3诱变菌株ILN10培养基筛选的PB试验的因素水平表
| 因素（g/L） | 编号 | -1 | 1 |
| 乳糖 | X 1 | 15 | 25 |
| 酵母浸粉 | X 2 | 15 | 25 |
| KH2PO4 | X 3 | 0.1 | 0.5 |
| MgSO4 | X 4 | 0.1 | 0.5 |
| NaCl | X 5 | 0.1 | 0.5 |
| (NH4)2SO4 | X6 | 0.1 | 0.5 |
| KNO3 | X 7 | 0.1 | 0.5 |
| VB1 | X 8 | 0.05 | 0.15 |
5） 爬坡试验逼近影响显著成分的最优浓度
在BP试验的基础进行爬坡试验设计，使影响显著成分的浓度接近最优区域。
6）白囊耙齿菌诱变株ILN10发酵中心组合设计试验
在以上试验的基础上进行中心组合试验，乳糖、酵母浸粉和(NH4)2SO4以期精确优化白囊耙齿菌发酵培养基，分别采用多元二次回归模型（RSM），对试验结果进行相应的分析并搜寻最优培养基方案。对RSM拟合的模型进行统计分析，图2显示乳糖和酵母浸粉的交互作用对期望值D的影响，从图中可以看出乳糖的浓度和(NH4)2SO4的浓度对期望值D影响显著，交互作用显著。统计学分析方法得到的最佳培养基配方为：乳糖浓度为 26.75 g/L，酵母浸粉为23.92 g/L；(NH4)2SO4为0.33 g/L；KH2PO4 0.5 g/L；MgSO4·7H2O 0.5 g/L；VB1 0.15 g/L。在培养条件为：150 rpm，26 ℃，培养5 d，此时得到的D值为0.5195。
7）白囊耙齿菌诱变株ILN10发酵验证试验
用最优的培养基方案进行3次平行发酵试验，以确定模型和优化方法的可靠性和准确性。
表4 白囊耙齿菌诱变株ILN10发酵验证试验结果
| 试验号 | 干重/g·L-1 | 腺苷/g·L-1 | 甘露醇/g·L-1 | 多糖/g·L-1 |
| 1 | 11.36 | 0.0691 | 0.2661 | 1.5807 |
| 2 | 11.56 | 0.0700 | 0.2566 | 1.5937 |
| 3 | 11.46 | 0.0694 | 0.2554 | 1.5807 |
Claims (2)
1. 一种白囊耙齿菌诱变菌株，其保藏号为：CCTCC NO：M 2011146。
2. 采用权利要求1所述白囊耙齿菌诱变菌株进行液体深层发酵的方法，包括以下步骤完成：
（1）一级斜面菌种：
斜面培养基：葡萄糖18-22 g/L，蛋白胨8-12 g/L，酵母浸粉8-12 g/L，KH2PO4 0.1-0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.1-0.5 g/L，维生素B1 0.05-0.1 g/L，琼脂18 g/L；
斜面菌种培养温度26±1℃，4-5天菌丝长满斜面，放冰箱中2-4℃保存备用；
（2）二级摇瓶菌种
种子培养基：葡萄糖18-22 g/L，蛋白胨8-12 g/L，酵母浸粉8-12 g/L， KH2PO4 0.1-0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.1-0.5 g/L，维生素B1 0.05-0.1 g/L；
种子培养方法：将斜面母种接入液体种子培养基，在26±1℃，120-160 r/min的摇床培养6 d；
（3）摇瓶发酵培养
将种子液按5%接种量接入液体发酵培养基中进行液体发酵，发酵培养基为乳糖：26-27 g/L，酵母浸粉：23-24 g/L，(NH4)2SO4：0.30-0.35 g/L，KH2PO4：0.4-0.5 g/L，MgSO4：0.4-0.5 g/L，VB1：0.01-0.15 g/L；发酵培养基装液量为250mL的摇瓶装100mL，培养温度26℃，摇床转速为150rpm，培养5 d后收获菌丝体；
（4）100L发酵罐放大培养
将种子液按7 %接种量接入60L液体发酵培养基中,于100L发酵罐中进行液体深层发酵培养，26℃，200 r/min，通气量4 L/min，初始pH为5.0，培养40 h，即得。
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