CN110199709A - 甘蔗组培苗甘蔗鞭黑粉菌接种方法 - Google Patents

甘蔗组培苗甘蔗鞭黑粉菌接种方法 Download PDF

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韦金菊
宋修鹏
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Abstract

本发明公开了一种甘蔗组培苗甘蔗鞭黑粉菌接种方法。利用注射器将甘蔗鞭黑粉菌“+”和“‑”交配型野生型菌株的混合孢子悬浮液和甘蔗鞭黑粉菌“+”和“‑”交配型突变体菌株的混合孢子悬浮液，分别注射至甘蔗组培苗植株内生长点处附近。其中“+”和“‑”交配型菌株的混合孢子悬浮液浓度为1×107个/mL，孢子悬浮液注射量为1mL/株，所测试甘蔗组培苗为35‑45cm高度的组培苗。本发明接种甘蔗鞭黑粉菌后发病显著、可操作性强、缩短致病性测试周期，从而提高甘蔗鞭黑粉菌致病性缺陷突变体的筛选效率，为甘蔗鞭黑粉菌致病性相关基因鉴定及机理研究提供技术支持，具有重要意义。

Description

甘蔗组培苗甘蔗鞭黑粉菌接种方法
技术领域
本发明属于农业技术领域，涉及一种甘蔗组培苗甘蔗鞭黑粉菌接种方法。
背景技术
甘蔗黑穗病(Sugarcane smut)是重要的甘蔗病害，1877年甘蔗黑穗病首次报道于在南非纳塔尔，随后该病蔓延至东半球及西半球国家。我国则在1932年报道广州蔗区发生甘蔗黑穗病，随后广西、云南、福建，台湾、海南等省先后报道该病害的发生。美国和澳大利亚相续报道了甘蔗黑穗病的发生，并迅速蔓延，成为主要的甘蔗病害。迄今，甘蔗黑穗病已成为世界上各甘蔗产区一种普遍发生的甘蔗病害。平均发病率为18％，宿根蔗发病高达50％。
甘蔗黑穗病最明显特征是病蔗梢头具一条向下内卷的黑色鞭状物，长度约20厘米至1米，直径0.5cm左右。黑穗鞭中央是由寄主组织构成的心柱，外围包着一层厚垣孢子。染病蔗种萌芽早，茎细小，叶细长，淡绿，分蘖增多，分蘖后长出黑穗鞭。甘蔗鞭黑粉菌(Sporisorium scitamineum)是引起甘蔗黑穗病的重要病原，该病原菌属担子菌亚门黑粉菌属，是两型真菌，在其生活史中，存在两种形式的菌株：单倍体的单细胞菌体和由相对性系不同的单细胞菌体有性配合所产生的双核菌丝体。不同遗传交配型(“+”和“-”)的单倍体细胞通过有性配合形成双核菌丝体，在活的寄主组织中侵入寄主甘蔗体内发育，使甘蔗发病。感染甘蔗鞭黑粉菌的蔗株在2-4个月开始形成黑穗鞭。
目前甘蔗鞭黑粉菌致病机理研究需要大量突变体对甘蔗进行致病性测定，需要大量的甘蔗蔗苗进行接种。致病性测定主要采取人工接种的方法，先从田间采收成熟甘蔗，使用刀具坎成数段进行盆栽，由于盆栽甘蔗萌发率低，需要种植大量甘蔗以确保接种材料，这样造成需要大量蔗种材料，占用土地面积大；另外甘蔗出苗需生长2月左右才能接种，甚至更久，接种前期准备工作时间比较长，接种后至发病需要2-4个月时间，这个接种过程耗时长，且限制突变体测试数量。加之，甘蔗鞭黑粉菌接种结果不稳定，不准确，浪费大量的人力物力、时间和精力，从而影响甘蔗鞭黑粉菌致病性缺陷突变体的筛选效率，导致甘蔗鞭黑粉菌致病机理研究进度缓慢。
发明内容
本发明的目的是为高效筛选甘蔗鞭黑粉菌致病性缺陷突变体提供一种甘蔗组培苗甘蔗鞭黑粉菌接种方法，通过采用本发明方法，接种甘蔗鞭黑粉菌后发病显著、可操作性强、缩短致病性测试周期，从而提高甘蔗鞭黑粉菌致病性缺陷突变体的筛选效率，为甘蔗鞭黑粉菌致病性相关基因鉴定及机理研究提供技术支持。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种甘蔗组培苗甘蔗鞭黑粉菌接种方法，包括以下步骤：利用注射器将甘蔗鞭黑粉菌“+”和“-”交配型野生型菌株的混合孢子悬浮液和甘蔗鞭黑粉菌“+”和“-”交配型突变体菌株的混合孢子悬浮液，分别注射至甘蔗组培苗植株内生长点处附近。
所述注射器为医用塑料注射器，量程为1mL。
所述甘蔗鞭黑粉菌“+”和“-”交配型野生型菌株的混合孢子悬浮液和甘蔗鞭黑粉菌“+”和“-”交配型突变体菌株的混合孢子悬浮液的制备，其步骤如下：
将病标样“黑粉鞭”上的黑粉孢子经无菌水悬浮后涂板于YePSA(yeastextraction 1％,peptone 2％,sugar 2％,agar 2％)培养基中，于28℃培养2d；分离得到菌丝体，经无菌水悬浮后，稀释后涂板于YePSA培养基中，于28℃培养2d得到酵母状的单倍体；在YePSA平板上进行两两随机配合，分离出两类不同的“+”和“-”交配型菌株；将“+”和“-”交配型菌株分别在YePS(yeast extraction 1％,peptone 2％,sugar 2％,)液体培养基中，于28℃摇床，200rpm，培养2d，所得的“+”和“-”交配型菌株孢子液混合一起，得到甘蔗鞭黑粉菌“+”和“-”交配型野生型菌株的混合孢子悬浮液；将经农杆菌转化获得的甘蔗鞭黑粉菌“+”和“-”交配型突变体菌株分别在YePS(yeast extraction 1％,peptone 2％,sugar2％,)液体培养基中，于28℃摇床，200rpm，培养2d，所得的“+”和“-”交配型突变体菌株孢子液混合一起，得到甘蔗鞭黑粉菌“+”和“-”交配型突变体菌株的混合孢子悬浮液。
所述甘蔗组培苗的高度为35-45cm。
所述甘蔗鞭黑粉菌“+”和“-”交配型野生型菌株的混合孢子悬浮液和甘蔗鞭黑粉菌“+”和“-”交配型突变体菌株的混合孢子悬浮液的浓度均为1×107个/mL，注射量均为1mL/株。
甘蔗鞭黑粉菌致病机理研究需要大量突变体对甘蔗进行人工接种，以确定突变体的致病性。以传统的蔗种栽培后人工接种，前期准备工作比较久，这个致病性测定过程耗时长，需要投入大量资金和劳动力，且接种结果不稳定，不准确。本方法利用注射器将甘蔗鞭黑粉菌“+”和“-”交配型野生型菌株的混合孢子悬浮液和甘蔗鞭黑粉菌“+”和“-”交配型突变体菌株的混合孢子悬浮液，分别注射至甘蔗组培苗植株内生长点处附近，其中“+”和“-”交配型菌株的混合孢子悬浮液浓度为1×107个/mL，孢子悬浮液注射量为1mL/株，该方法所测试甘蔗组培苗为35-45cm高度的组培苗，组培苗盆栽后即可进行致病性测试(接种)，节省了前期的大量准备工作，且可进行大量甘蔗组培苗接种，大大提高测试突变体数量，一个月后开始发病，缩短了甘蔗鞭黑粉菌致病性缺陷突变体筛选的周期，从而提高筛选效率，致病性测定(接种)结果稳定，有效节约试验用地和资金投入。本发明接种甘蔗鞭黑粉菌后发病显著、可操作性强、缩短致病性测试周期，从而提高甘蔗鞭黑粉菌致病性缺陷突变体的筛选效率，为甘蔗鞭黑粉菌致病性相关基因鉴定及机理研究提供技术支持。
本发明具有以下有益效果：
(1)通过采用注射器吸取甘蔗鞭黑粉菌野生型菌株及突变体“+”和“-”交配型的混合孢子悬浮液注射至甘蔗组培苗植株内生长点处附近，增加组培苗感染甘蔗鞭黑粉菌的机会，试验中有些突变体发病比甘蔗鞭黑粉菌野生型早，有些突变体发病比甘蔗鞭黑粉菌野生型晚，接种结果比较稳定，达到甘蔗鞭黑粉菌致病性缺陷突变体筛选的效果。
(2)采用注射器吸取甘蔗鞭黑粉菌野生型菌株及突变体“+”和“-”交配型的混合孢子悬浮液注射至甘蔗组培苗，操作方便、成本低、可对大量甘蔗组培苗进行接种，大大提高测试突变体数量，从而提高甘蔗鞭黑粉菌致病性缺陷突变体筛选的效率。
(3)采用注射器吸取甘蔗鞭黑粉菌野生型菌株及突变体“+”和“-”交配型的混合孢子悬浮液注射至甘蔗组培苗，节约了传统接种的前期准备工作，如砍甘蔗、盆栽、甘蔗发株等所需时间至少2个月，缩短了甘蔗鞭黑粉菌致病性缺陷突变体的筛选周期，即致病性测定周期，提高筛选效率，有效节约筛选时间。
(4)采用注射器吸取甘蔗鞭黑粉菌野生型菌株及突变体“+”和“-”交配型的混合孢子悬浮液注射至甘蔗组培苗，提高了甘蔗鞭黑粉菌致病性缺陷突变体筛选效率，节约了试验用地和前后期资金及劳动力的投入。
(5)甘蔗组培苗接种甘蔗鞭黑粉菌后发病显著，且重演性好、试验周期短、可操作性强。该方法可服务于甘蔗鞭黑粉菌致病性缺陷突变体的筛选，为甘蔗鞭黑粉菌致病性相关基因鉴定及机理研究提供技术支持。
具体实施方式
下面对发明作进一步说明
1.盆栽组培苗的准备
甘蔗组培苗由广西壮族自治区农业科学院甘蔗研究所提供，选择高度为35-45cm的甘蔗组培苗栽入长宽高分别为1m、0.5m和0.2m的塑料盆中，每盆可栽30株组培苗，盖上泥土没过根部。
2.甘蔗鞭黑粉菌“+”和“-”交配型野生型菌株的混合孢子悬浮液和甘蔗鞭黑粉菌“+”和“-”交配型突变体菌株的混合孢子悬浮液按以下操作配制
甘蔗鞭黑粉菌病标样采集于广西壮族自治区农业科学院甘蔗研究所甘蔗栽培区的甘蔗黑穗病标本中分离获得。
将病标样“黑粉鞭”上的黑粉孢子经无菌水悬浮后涂板于YePSA(yeastextraction 1％,peptone 2％,sugar 2％,agar 2％)培养基中，于28℃培养2d。将分离得到菌丝体，经无菌水悬浮后，稀释后涂板于YePSA培养基中，于28℃培养2d得到酵母状的单倍体。在YePSA平板上进行两两随机配合，分离出两类不同的“+”和“-”交配型菌株。将“+”和“-”交配型菌株分别在YePS(yeast extraction 1％,peptone 2％,sugar 2％,)液体培养基中，于28℃摇床，200rpm，培养2d，所得的“+”和“-”交配型菌株孢子液混合一起，配置浓度为1×107个/mL混合孢子悬浮液。将经农杆菌转化获得的甘蔗鞭黑粉菌“+”和“-”交配型突变体菌株分别在YePS(yeast extraction 1％,peptone 2％,sugar 2％,)液体培养基中，于28℃摇床，200rpm，培养2d，所得的“+”和“-”突变体菌株孢子液混合一起，配置浓度为1×107个/mL混合孢子悬浮液。
3.甘蔗鞭黑粉菌接种甘蔗组培苗
采用医用1mL注射器吸取上述甘蔗鞭黑粉菌“+”和“-”交配型野生型菌株的混合孢子悬浮液和甘蔗鞭黑粉菌“+”和“-”交配型突变体菌株的混合孢子悬浮液各1mL，将悬浮液分别注射至甘蔗组培苗植株内生长点处附近，用标签牌做好标记。
4.甘蔗黑穗病发病调查
接种1个月后检查发病，最早发病(出现症状)时间为46天，之后，每个10天调查1次，3个月内甘蔗黑穗病发病率为90％以上。

Claims (5)

1.一种甘蔗组培苗甘蔗鞭黑粉菌接种方法，其特征在于，包括以下步骤：利用注射器将甘蔗鞭黑粉菌“+”和“-”交配型野生型菌株的混合孢子悬浮液和甘蔗鞭黑粉菌“+”和“-”交配型突变体菌株的混合孢子悬浮液，分别注射至甘蔗组培苗植株内生长点处附近。
2.根据权利要求1所述的甘蔗组培苗甘蔗鞭黑粉菌接种方法，其特征在于，所述注射器为医用塑料注射器，量程为1mL。
3.根据权利要求1所述的甘蔗组培苗甘蔗鞭黑粉菌接种方法，其特征在于，所述甘蔗鞭黑粉菌“+”和“-”交配型野生型菌株的混合孢子悬浮液和甘蔗鞭黑粉菌“+”和“-”交配型突变体菌株的混合孢子悬浮液的制备，其步骤如下：
将病标样“黑粉鞭”上的黑粉孢子经无菌水悬浮后涂板于YePSA培养基中，于28℃培养2d；分离得到菌丝体，经无菌水悬浮后，稀释后涂板于YePSA培养基中，于28℃培养2d得到酵母状的单倍体；在YePSA平板上进行两两随机配合，分离出两类不同的“+”和“-”交配型菌株；将“+”和“-”交配型菌株分别在YePS液体培养基中，于28℃摇床，200rpm，培养2d，所得的“+”和“-”交配型菌株孢子液混合一起，得到甘蔗鞭黑粉菌“+”和“-”交配型野生型菌株的混合孢子悬浮液；将经农杆菌转化获得的甘蔗鞭黑粉菌“+”和“-”交配型突变体菌株分别在YePS液体培养基中，于28℃摇床，200rpm，培养2d，所得的“+”和“-”交配型突变体菌株孢子液混合一起，得到甘蔗鞭黑粉菌“+”和“-”交配型突变体菌株的混合孢子悬浮液。
4.根据权利要求1所述的甘蔗组培苗甘蔗鞭黑粉菌接种方法，其特征在于，所述甘蔗组培苗的高度为35-45cm。
5.根据权利要求1所述的甘蔗组培苗甘蔗鞭黑粉菌接种方法，其特征在于，所述甘蔗鞭黑粉菌“+”和“-”交配型野生型菌株的混合孢子悬浮液和甘蔗鞭黑粉菌“+”和“-”交配型突变体菌株的混合孢子悬浮液的浓度均为1×107个/mL，注射量均为1mL/株。
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