CN109943488B

CN109943488B - 一种灵芝多糖高产菌株rwhbw-1及其应用

Info

Publication number: CN109943488B
Application number: CN201910120979.9A
Authority: CN
Inventors: 黄青; 马玉涵; 何华奇
Original assignee: Hefei Institutes of Physical Science of CAS
Current assignee: Hefei Institutes of Physical Science of CAS
Priority date: 2019-02-19
Filing date: 2019-02-19
Publication date: 2022-05-03
Anticipated expiration: 2039-02-19
Also published as: CN109943488A

Abstract

本发明公开一种灵芝多糖高产菌株，菌株名称为灵芝菌株RWHBW‑1(Ganoderma lucidum)，菌种保藏号为CCTCC NO.M2018499；本发明还公开灵芝菌株RWHBW‑1发酵产多糖的专用培养基，将灵芝菌株RWHBW‑1的种子接种于该专用培养基中促进灵芝菌株RWHBW‑1的生长及多糖合成。本发明的有益效果在于：本发明通过诱变方法获得的灵芝菌株RWHBW‑1具有稳定性强、高产灵芝多糖的性能；通过添加微藻粗提物进一步提高灵芝菌株RWHBW‑1的菌丝生长速度、液体发酵条件下菌丝体生物量、多糖含量，相比于子实体种植，其不受季节和条件影响，在生产上具有相当大的优势。

Description

一种灵芝多糖高产菌株RWHBW-1及其应用

技术领域

本发明涉及农业微生物领域技术领域，具体涉及一种灵芝多糖高产菌株RWHBW-1及其应用。

背景技术

灵芝多糖作为著名中草药材灵芝中很重要的药用成分之一，灵芝多糖具有抗肿瘤作用，通过调节整个免疫系统的各种细胞，单核巨噬细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、B淋巴细胞和T淋巴细胞等发挥作用。

李绪全报告的在15种灵芝菌株中，其菌丝体多糖含量最高为0.55g/L(李绪全.灵芝菌丝体多糖高产菌株筛选及多糖理化性质研究[D].上海师范大学,2005.)；Qing-HuaFang对灵芝液体发酵条件进行优化，其最佳条件下，灵芝胞内多糖含量为1.06g/L(Fang QH,Zhong J J. Effect of initial pH on production of ganoderic acid andpolysaccharide by submerged fermentation of Ganoderma lucidum[J].ProcessBiochemistry,2002,37(7):769-774.)。

肥料使用是保障农业增产增收的重要手段，然而化肥的大量使用带来了一系列的问题，包括土壤酸化、盐渍化、土传病害的流行、作物连作障碍、农作物品质下降等。研究表明，藻肥可以提高作物的胁迫抗性，促进营养物质吸收，提高农作物质量和产量、调节植物激素合成。雨生红球藻(Haematococcus Pluvialis)是一种湖生红球藻，在其生活史中产生诸如胡萝卜素、虾青素等多种次生代谢产物和生物调节物质，是生产藻肥、获取生物调节剂的有效方式。

发明内容

本发明的解决的技术问题在于提供一种灵芝多糖高产菌株RWHBW-1及其应用，提高灵芝多糖产量。

本发明是采用以下技术方案解决上述技术问题的：

一种灵芝多糖高产菌株，所述菌株名称为灵芝菌株Ganoderma lucidum RWHBW-1，菌种保藏号为CCTCC NO.M2018499，保藏日期为2018年7月25日。

本发明还提供灵芝菌株RWHBW-1发酵产多糖的专用培养基，所述培养基为在PDA固体培养基或PDB液体培养基的基础上添加微藻提取物。

优选的，所述微藻提取物的添加量为培养基体积的0.5％-2％。

优选的，所述微藻粗提物的制备方法包括研磨法或超声波处理法。

优选的，所述研磨法的步骤为：收集藻体，研磨，加入乙醇，研磨至藻体溶解，离心，收集上清液，获得研磨法微藻粗提物。

优选的，所述超声波处理法的步骤为：收集藻体，于300-500W、30-60KHz条件下处理 10-60min后，离心，收集上清液，获得超声波处理法微藻粗提物。

优选的，所述藻体为处于孢囊细胞时期的湿藻体。

优选的，所述离心转速为3000rpm，离心时间为5-10min。

优选的，所述微藻为雨生红球藻。

本发明还提供一种促进灵芝菌株RWHBW-1生长及多糖合成的方法，包括以下步骤：将灵芝菌株RWHBW-1的种子接种于添加微藻提取物的PDA固体培养基或PDB液体培养基中。

优选的，所述超声波处理法的步骤为：收集藻体，于200-500W、30-60KHz条件下处理 10-60min后，离心，收集上清液，获得超声波处理法微藻粗提物。

优选的，所述藻体为处于孢囊细胞时期的湿藻体。

优选的，所述离心转速为3000rpm，离心时间为5-10min。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明通过诱变方法获得的灵芝菌株RWHBW-1具有稳定性强、高产灵芝多糖的性能；

(2)本发明采用微藻粗提物用于固体发酵灵芝多糖高产菌株，其菌丝生长速度达到 0.5-0.6cm/天，用于液体发酵条件下菌丝体生长，菌丝体干重可达0.6-0.8g/100mL，在液体发酵条件下，可以获得0.9-1.4g/L灵芝多糖；通过添加微藻粗提物进一步提高灵芝菌株 RWHBW-1的灵芝多糖产量；

(3)微藻中含有较高含量的虾青素，对人体有益，且可以促进发酵条件下灵芝多糖高产菌株的生长和多糖的合成，相比于子实体种植，其不受季节和条件影响，在生产上具有相当大的优势。

附图说明

图1为本发明实施例4中雨生红球藻粗提物对灵芝菌株RWHBW-1菌丝生长速度的影响结果图；

图2为本发明实施例4中灵芝菌株RWHBW-1菌丝体生长图；其中A为研磨处理雨生红球藻粗提物处理组，B研磨处理雨生红球藻粗提物5倍稀释液，C超声处理雨生红球藻粗提物，D为超声处理雨生红球藻粗提物5倍稀释液，CK为对照组；

图3为本发明实施例5中雨生红球藻粗提物的添加量对灵芝菌株RWHBW-1菌丝生长速度的影响结果图；

图4为本发明实施例6中雨生红球藻粗提物的添加量对灵芝菌株RWHBW-1菌丝体干重的影响结果图；

图5为本发明实施例6中雨生红球藻粗提物的添加量对灵芝菌株RWHBW-1多糖含量的影响结果图；

灵芝菌株RWHBW-1，保藏编号：CCTCC NO.M2018499，保藏日期：2018年7月25 日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山。

具体实施方式

以下将结合说明书附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得；

实施例1

灵芝菌株RWHBW-1的获得

(1)灵芝菌株的诱变方法

对野生采集的灵芝菌株通过PDA固体培养和PDB液体培养，获得大量菌丝体，利用酶解方法获得灵芝原生质体，对灵芝原生质体进行等离子体放电诱变处理，稀释后在重建培养基中涂布获得单一菌落，挑取后得到处理菌株，对该菌株进行灵芝多糖含量检测，以筛选获得灵芝多糖高产菌株。

(2)诱变灵芝多糖高产菌株的筛选

利用红外光谱-灵芝多糖含量检测方法，该方法在文献(Ma Y,He H,Wu J,Wang C,Chao K, Huang Q.Assessment of Polysaccharides from Mycelia of genus Ganodermaby Mid-Infrared and Near-Infrared Spectroscopy.Scientific Reports.2018；8(1):1±10.)中公开，对大量的诱变灵芝光谱进行初筛；并对其中含量较高的菌株利用化学方法(硫酸蒽酮法)进行复筛；对经过复筛的菌株进行RAPD分析，以剔除诱变假阳性结果；对诱变成功的菌株进行传代培养以观察其诱变稳定性，分析方法在文献(黄浩,许国权,周世力.几种中国栽培灵芝品种的RAPD及rDNA 分子标记鉴定[J].江汉大学学报(自然科学版),2013,41(02):70-74.)及(王锦锋,李晶,I.L.Datti,张健,林志魁,林占熺.利用拮抗、ITS和RAPD技术对灵芝属菌株分类的研究[J].西南农业学报,2017,30(01):26-33.)中公开，以获得稳定的灵芝多糖高产菌株，命名为灵芝菌株RWHBW-1 (Ganoderma lucidum)。

采用药典中记载的硫酸蒽酮法，每组三个平行样，测得灵芝菌株RWHBW-1的菌丝多糖含量为1.327g/L。

实施例2

利用研磨法制备雨生红球藻粗提物的方法，包括以下步骤：

(1)待雨生红球藻生长至红色孢囊细胞时期时收集湿藻体，用滤纸吸取表面培养基，称重2g；本实施例中雨生红球藻来源于中国科学院武汉水生生物研究所；

(2)置于研钵中研磨，加入乙醇，边加入边研磨，至5-10mL溶解，3000rpm离心5-10min，去除藻体残渣，留取上清液，获得研磨处理雨生红球藻粗提物，稀释5-100倍后备用。

实施例3

利用超声波处理法制备雨生红球藻粗提物的方法，包括以下步骤：

(2)于300W，40KHz条件下处理30min后，3000rpm离心5-10min，去除藻体残渣，留取上清液，获得研磨处理雨生红球藻粗提物，稀释5-100倍后备用。

实施例4

实施例2和实施例3中制备的雨生红球藻粗提物对灵芝菌株RWHBW-1菌丝生长速度的影响：

以不添加雨生红球藻粗提物为对照组(CK)；以超声处理雨生红球藻粗提物5倍稀释液、超声处理雨生红球藻粗提物、研磨处理雨生红球藻粗提物5倍稀释液、研磨处理雨生红球藻粗提物为实验组，添加至PDA固体培养基中，接种对数期灵芝菌株RWHBW-1种子0.5cm见方，于28℃下培养，分别在接种后第6天、第7天、第8天和第11天观察并测量菌落半径以评估不同处理后菌丝体在固体培养基下生长速度。

实验结果：

如图1和图2所示，灵芝固体发酵条件下菌丝生长速度，研磨处理雨生红球藻粗提物＞研磨处理雨生红球藻粗提物5倍稀释液＞超声处理雨生红球藻粗提物＞超声处理雨生红球藻粗提物5倍稀释液＞对照组。

实施例5

实施例2中制备的雨生红球藻粗提物的添加量对灵芝菌株RWHBW-1菌丝生长速度的影响：

以不添加雨生红球藻粗提物为对照组(CK)；以加入PDA固体培养基总体积0.5％、1％、 1.5％、2％的研磨处理雨生红球藻粗提物为实验组；接种对数期灵芝菌株RWHBW-1种子0.5cm 见方，于28℃下培养，观察在7d内不同处理组灵芝菌丝的生长速度。

实验结果：

如图3所示，当加入研磨处理雨生红球藻粗提物与PDA固体培养基体积比为0.5％时，灵芝菌株RWHBW-1的菌丝生长速度达到0.54cm/天；当加入研磨处理雨生红球藻粗提物与 PDA固体培养基体积比为1％时，灵芝菌株RWHBW-1的菌丝生长速度达0.44cm/天；当加入研磨处理雨生红球藻粗提物与PDA固体培养基体积比为1.5％时，灵芝菌株RWHBW-1的菌丝生长速度达0.433cm/天。

实施例6

实施例2中制备的雨生红球藻粗提物的添加量对灵芝菌株RWHBW-1菌丝体干重和多糖含量的影响：

以不添加雨生红球藻粗提物为对照组(CK)；以加入PDB液体培养基总体积0.5％、1％、 1.5％、2％的研磨处理雨生红球藻粗提物为实验组；接种0.5cm见方对数期灵芝菌株RWHBW-1 种子。

菌丝体干重测定：待菌丝体长满锥形瓶后，捞取液体发酵灵芝菌丝体，无菌水清洗后置于冷冻干燥器中干燥后称量干重。

菌丝体多糖含量测定：待菌丝体长满锥形瓶后，捞取液体发酵灵芝菌丝体，无菌水清洗后置于冷冻干燥器中干燥后测定其多糖含量，其测定方法为药典中记录的硫酸蒽酮法。

实验结果：

如图4所示，当加入研磨处理雨生红球藻粗提物与PDB液体培养基体积比为0.5％时，灵芝菌株RWHBW-1菌丝体干重达到0.722g/100mL；当加入研磨处理雨生红球藻粗提物与PDB液体培养基体积比为1％时，灵芝菌株RWHBW-1菌丝体干重达到0.662g/100mL；当加入研磨处理雨生红球藻粗提物与PDB液体培养基体积比为1.5％时，灵芝菌株RWHBW-1菌丝体干重达到0.582g/100mL。

如图5所示，当加入研磨处理雨生红球藻粗提物与PDB液体培养基体积比为0.5％时，灵芝菌株RWHBW-1多糖含量达到1.327g/L，当加入研磨处理雨生红球藻粗提物与PDB液体培养基体积比为1％时，灵芝菌株RWHBW-1多糖含量达到1.277g/L；当加入研磨处理雨生红球藻粗提物与PDB液体培养基体积比为1.5％时，灵芝菌株RWHBW-1多糖含量达到0.9255g/L。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，与本发明构思无实质性差异的各种工艺方案均在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种促进灵芝菌株RWHBW-1生长及多糖合成的方法，其特征在于：将灵芝菌株RWHBW-1的种子接种于添加微藻提取物的PDA固体培养基或PDB液体培养基中，所述微藻提取物的添加量为培养基体积的0.5％-1％，所述灵芝菌株RWHBW-1(Ganoderma lucidum)的菌种保藏号为CCTCC NO .M2018499，保藏日期为2018年7月25日；所述微藻为雨生红球藻。

2.根据权利要求1所述的促进灵芝菌株RWHBW-1生长及多糖合成的方法，其特征在于：所述微藻提取物的制备方法包括研磨法或超声波处理法。

3.根据权利要求2所述的促进灵芝菌株RWHBW-1生长及多糖合成的方法，其特征在于：所述研磨法的步骤为：收集藻体，研磨，加入乙醇，研磨至藻体溶解，离心，收集上清液，获得研磨法微藻粗提物。

4.根据权利要求2所述的促进灵芝菌株RWHBW-1生长及多糖合成的方法，其特征在于：所述超声波处理法的步骤为：收集藻体，于300-500W、30-60KHz条件下处理10-60min后，离心，收集上清液，获得超声波处理法微藻粗提物。

5.根据权利要求3或4所述的促进灵芝菌株RWHBW-1生长及多糖合成的方法，其特征在于：所述藻体为处于孢囊细胞时期的湿藻体。

6.根据权利要求3或4所述的促进灵芝菌株RWHBW-1生长及多糖合成的方法，其特征在于：所述离心转速为3000rpm，离心时间为5-10min。