具体实施方式
下述实施例中所述的方法,如无特别说明,均为常规方法。下述实施例中所示的百分含量,如无特别说明,均为质量百分含量。
实施例1、黑平菇提取物的提取方法及其TMV抑制实验
一、黑平菇的摇瓶培养条件的优化
1、菌种活化:将-20℃冷冻保存的黑平菇菌丝体,接种于PDA平板培养基上,25℃培养3天得到生长活力旺盛的黑平菇菌丝。
2、黑平菇的液体培养
1)一级菌种制备:将步骤1得到的平板活化的菌丝切成小块儿,转入装有100ml下述培养基的500ml摇瓶中,接种量为可为0.5-1.5g菌丝/L,本实施例采用1g/L,于27℃、220rpm摇培3天得到活化的菌丝,即一级菌种(浓度为30-40g/L)。
上述一级菌种制备的培养基配方:18g/L马铃薯淀粉、25g/L葡萄糖、30g/L玉米粉、25g/L豆浆粉、8g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、3g/L牛肉膏、3g/LKH2PO4、1g/LK2HPO4、1.5g/L MgSO4、30mg/L VB1。
2)黑平菇菌丝体的液体培养:
将步骤1)得到的一级菌种培养液按照体积百分比浓度为8%的接种量接种到装有100ml步骤1)所述的培养基的500ml摇瓶中,于27℃、220rpm摇瓶培养。
3、不同液体培养天数黑平菇菌丝粗提液的获得
接种摇瓶三天后开始取样,每隔24小时取1次,连续取六次,每次取2瓶,抽滤收集菌丝,然后按照下述方法获得黑平菇菌丝粗提液:
1)将上述获得的黑平菇菌丝于40℃烘箱中烘干,粉碎,过60目筛得到黑平菇菌丝粉末。
2)分别将2g通过步骤1)得到的黑平菇菌丝干粉与0.025mol/L pH8.0的PBS按照1g/10ml的比例混合,于4℃,浸提2小时,10000rpm离心25min,收集上清液,用0.025mol/L pH8.0的磷酸缓冲液定容至20ml,即为黑平菇菌丝粗提液。
4、不同培养天数对黑平菇菌丝粗提液总蛋白浓度的影响
用BCA蛋白浓度试剂盒(美国Pierce公司)检测步骤3得到的不同培养天数的黑平菇提取物粗提液的蛋白浓度,测定方法按照试剂盒的说明书进行。结果如表1所示,结果显示:随着培养天数的增加,菌丝干粉粗提液总蛋白的浓度先增加后下降,在培养的八天中,第五天的总蛋白浓度较高,说明该时期蛋白表达处于一个较高水平。在后续试验中,我们选择第五天的菌丝作为提取物的材料。
表1.不同培养天数的黑平菇菌丝缓冲液提取物总蛋白浓度
天数 | 三天 | 四天 | 五天 | 六天 | 七天 | 八天 |
总蛋白浓度mg/ml | 6.41 | 10.12 | 10.19 | 10.09 | 9.20 | 9.43 |
5、液体培养天数对黑平菇菌丝粗提液的抗烟草花叶病毒效果的影响
1)植株处理:将步骤3得到的发酵培养天数不同的黑平菇菌丝粗提液分别用水稀释得到总蛋白浓度为200μg/ml的溶液,分别对三至四叶期的枯斑三生烟(Nicotiana tabacum Samsun NN)进行整株喷雾,每个处理三个重复,每个重复三株,每株三片叶子。同时用清水喷施于三至四叶期的枯斑三生烟作为对照(CK),设置三个重复,每个重复三株,每株三片叶子。
2)病毒接种液的制备:病毒来源为本研究室保存的烟草花叶病毒普通株系(以普通烟为繁殖寄主,温室内活体保存),其获取方法是:将感染烟草花叶病毒普通株系的普通烟(Ncotiana tabacum Hawana38))烟叶去除主脉,与pH8.0的0.01mol/L的PBS按1g/20ml混合,每20mlPBS加0.015g金刚砂,将叶片充分研磨,得到接种液。
3)接种:将按步骤1)的方法喷雾72小时后得到的枯斑三生烟植株,用步骤2)得到的接种液进行摩擦接种(植病研究方法(第三版),方中达,中国农业出版社)接种后立即用清水冲洗,于温室中培养,培养条件为28℃光照12小时,18℃无光照12小时,交替进行。
4)抑制率计算:接种72小时后观察枯斑三生烟叶片产生枯斑数量,按下式计算出枯斑抑制率。
X=(CK-Y)/CK×100 (式I)
式I中,X为枯斑抑制率,单位:%;CK为清水对照叶片的平均枯斑个数,单位:个;Y为经黑平菇菌丝粗提液诱导处理后叶片的平均枯斑个数,单位:个。
结果如表2所示,结果显示,液体培养3-7天后的菌丝进行提取得到的黑平菇菌丝提取物粗提液对烟草花叶病毒的平均抑制率均在40%以上,其中发酵培养5天后的菌丝进行提取得到的黑平菇菌丝提取物粗提液对烟草花叶病毒的平均抑制率达到68.38%,效果最好(抑制率实验照片如图2中A所示),方差显著性分析也同样显示了如上结果。
表2.不同培养天数的黑平菇菌丝提取物粗提液对烟草花叶病毒的抑制率的影响
二、黑平菇菌丝粗提液中抗烟草花叶病毒蛋白组分的筛选
利用不同饱和度的硫酸铵对步骤一的步骤3获得的培养5天的黑平菇菌丝粗提液中的蛋白组分进行分离,并分别对不同饱和度硫酸铵沉淀的蛋白组分进行抗烟草花叶病毒活性测定。
硫酸铵分级沉淀条件如下:
1、选取硫酸铵饱和度范围:0~30%、30%~60%、60%~85%,进行硫酸铵分级沉淀具体方法为:
1)在步骤一的步骤3获得的发酵5天的黑平菇菌丝粗提液中加入硫酸铵至饱和度为30%,于4℃放置8小时后,10000rpm离心收集沉淀即为0~30%饱和硫酸铵沉淀组分;
2)将步骤1)离心得到的上清液继续加入硫酸铵至饱和度为60%,于4℃放置8小时后,10000rpm离心收集沉淀即为30%~60%饱和硫酸铵沉淀组分;
3)将步骤2)离心得到的上清液继续加入硫酸铵至饱和度为85%,于4℃放置8小时后,10000rpm离心收集沉淀即为60%~85%饱和硫酸铵沉淀组分。
上述步骤1)、2)和3)得到0~30%、30%~60%和60%~85%沉淀组分于7000d透析袋中4℃透析过夜,期间换水3~4次。经充分透析后(请提供透析的具体步骤或者将该透析步骤删除)用水稀释得到总蛋白浓度在200μg/ml的溶液,分别对三至四叶期的枯斑三生烟进行整株喷雾,每个处理三个重复,每个重复三株,每株三片叶子。同时用清水喷施于三至四叶期的枯斑三生烟作为对照(CK),设置三个重复,每个重复三株,每株三片叶子。病毒的制备、接种、抑制率计算同步骤一的步骤5。
结果如表3所示,结果表明硫酸铵饱和度在30%~60%和60%~85%时沉淀的蛋白对烟草花叶病毒的抑制率较高,可达66.3%和62.11%,故选取30%~85%硫酸铵饱和度进行进一步分级。
表3.30~30%、30%~60%、60%~85%饱和硫酸铵沉淀组分对烟草花叶病毒的抑制率
2、选取硫酸铵饱和度范围:30%~40%、40%~50%、50%~60%、60%~70%、70%~85%;进行硫酸铵分级沉淀,具体方法为:
1)在步骤一的步骤3获得的培养5天的黑平菇菌丝粗提液中加入硫酸铵至饱和度为30%,于4℃放置8小时后,10000rpm离心收集上清液;上清液继续加入硫酸铵至饱和度为40%,于4℃放置8小时后,10000rpm离心收集上清液和沉淀,沉淀即为30%~40%饱和硫酸铵沉淀组分;
2)将步骤1)离心得到的上清液继续加入硫酸铵至饱和度为50%,于4℃放置8小时后,10000rpm离心收集沉淀即为40%~50%饱和硫酸铵沉淀组分;
3)将步骤2)离心得到的上清液继续加入硫酸铵至饱和度为60%,于4℃放置8小时后,10000rpm离心收集沉淀即为50%~60%饱和硫酸铵沉淀组分。
4)将步骤3)离心得到的上清液继续加入硫酸铵至饱和度为60%,于4℃放置8小时后,10000rpm离心收集沉淀即为60%~70%饱和硫酸铵沉淀组分。
5)将步骤4)离心得到的上清液继续加入硫酸铵至饱和度为60%,于4℃放置8小时后,10000rpm离心收集沉淀即为70%~85%饱和硫酸铵沉淀组分。
将上述步骤1)—5)得到的各级饱和硫酸铵沉淀组分于7000d透析袋中4℃透析过夜,期间换水3~4次。经充分透析后(请提供透析的具体步骤或者将该透析步骤删除)用水稀释得到总蛋白浓度在200μg/ml的溶液,分别对三至四叶期的枯斑三生烟进行整株喷雾,每个处理做三个重复,每个重复三株,每株三片叶子。同时用清水喷施于三至四叶期的枯斑三生烟作为对照(CK),设置三个重复,每个重复三株,每株三片叶子。病毒的制备、接种、抑制率计算同步骤一的步骤5。
结果如表4所示,结果表明硫酸铵饱和度在40%~50%、50%~60%、60%~70%沉淀的蛋白对烟草花叶病毒的抑制率分别达到60.92%、63.81%和59.13%,故选取硫酸铵饱和度在40%~70%的沉淀蛋白进行后续分离。
表4.30%~85%饱和硫酸铵按10%分级所得蛋白对烟草花叶病毒的抑制率
根据上述结果,按照下述方法对步骤一的步骤3获得的培养5天的黑平菇提取物粗提液进一步提取:
1)在步骤一的步骤3获得的培养5天的黑平菇菌丝粗提液中加硫酸铵至饱和度为40%,于4℃放置8小时后,10000rpm离心收集上清液。
2)在步骤1)得到的上清液中,继续加入硫酸铵至饱和度70%,在4℃放置8小时后,10000rpm离心,收集沉淀,即得到黑平菇抗烟草花叶病毒蛋白提取物。
按照步骤一的步骤5的方法检测该黑平菇抗烟草花叶病毒蛋白提取物的抗烟草花叶病毒效果,结果如图2中B所示,结果表明,上述黑平菇抗烟草花叶病毒蛋白提取物以200μg/ml浓度喷施时,对烟草花叶病毒抑制率为62.30%(抑制率实验照片如图2中B所示)。
实施例2、黑平菇蛋白提取物的提取方法及TMV抑制实验
按照实施例1的步骤一中的步骤1和步骤2的方法发酵培养黑平菇菌丝,发酵培养5天的菌丝为原料,按照下述方法获得黑平菇提取物(提取方法流程图如图1所示):
1)将上述获得的黑平菇菌丝于40℃烘箱中烘干,粉碎,过60目筛得到黑平菇菌丝粉末。
2)分别将步骤1)得到的黑平菇菌丝粉末与0.025mol/L pH7.0的磷酸缓冲液按照1g/10ml的比例混合;在2℃,浸提2小时后,10000rpm离心25min,收集上清液,即为黑平菇菌丝粗提液。用BCA蛋白浓度试剂盒(美国Pierce公司)检测该黑平菇菌丝粗提液的蛋白浓度。
3)在步骤2)得到的黑平菇提取物粗提液中加硫酸铵至饱和度为40%,在2℃放置8小时后,10000rpm离心收集上清液。
4)在步骤3)得到的上清液中,继续加入硫酸铵至饱和度70%,在2℃放置8小时后,10000rpm离心,收集沉淀,即得到黑平菇抗烟草花叶病毒蛋白提取物。
按照实施例1的步骤一的步骤5的方法,分别对步骤2)和步骤4)获得的黑平菇提取物进行烟草花叶病毒抑制率检测实验,结果如表5所示。
表5.本发明的黑平菇提取物的烟草花叶病毒抑制率检测实验结果
| 重复一 | 重复二 | 重复三 | 平均值 | 差异显著性(α=0.05) | 差异性 |
黑平菇菌丝粗提液 | 49.32 | 51.26 | 43.59 | 48.06 | a | 3.99 |
黑平菇蛋白提取物 | 45.21 | 44.88 | 50.01 | 46.70 | a | 2.87 |
实施例3、黑平菇提取物的获得及TMV抑制实验
按照实施例1的步骤一中的步骤1和步骤2的方法发酵培养黑平菇菌丝,发酵培养5天的菌丝为原料,按照下述方法获得黑平菇提取物:
1)将上述获得的黑平菇菌丝于40℃烘箱中烘干,粉碎,过60目筛得到黑平菇菌丝粉末。
2)分别将步骤1)得到的黑平菇菌丝粉末与0.025mol/L pH7.0的磷酸缓冲液按照1g/20ml的比例混合;在6℃,浸提2小时后,10000rpm离心25min,收集上清液,即为黑平菇菌丝粗提液。用BCA蛋白浓度试剂盒(美国Pierce公司)检测该黑平菇菌丝粗提液的蛋白浓度,测定方法按照试剂盒的说明书进行。
3)在步骤2)得到的黑平菇提取物粗提液中加硫酸铵至饱和度为40%,在6℃放置8小时后,10000rpm离心收集上清液。
4)在步骤3)得到的上清液中,继续加入硫酸铵至饱和度70%,在6℃放置8小时后,10000rpm离心,收集沉淀,即得到黑平菇抗烟草花叶病毒蛋白提取物。
按照实施例1的步骤一的步骤5的方法,分别对步骤2)和步骤4)获得的黑平菇提取物进行烟草花叶病毒抑制率检测实验,结果如表6所示。
表6.本发明的黑平菇提取物的烟草花叶病毒抑制率检测实验结果
| 重复一 | 重复二 | 重复三 | 平均值 | 差异显著性(α=0.05) | 差异性 |
黑平菇菌丝粗提液 | 46.79 | 49.32 | 52.41 | 49.51 | a | 2.81 |
黑平菇蛋白提取物 | 45.88 | 46.25 | 43.11 | 45.08 | a | 1.72 |
实施例4、黑平菇提取物的获得及TMV抑制实验
按照实施例1的步骤一中的步骤1和步骤2的方法液体培养黑平菇菌丝,培养5天的菌丝为原料,按照下述方法获得黑平菇提取物:
1)将上述获得的黑平菇菌丝于40℃烘箱中烘干,粉碎,过60目筛得到黑平菇菌丝粉末。
2)分别将步骤1)得到的黑平菇菌丝粉末与0.025mol/L pH9.0的磷酸缓冲液按照1g/10ml的比例混合;在2℃,浸提2小时后,10000rpm离心25min,收集上清液,即为黑平菇菌丝粗提液。用BCA蛋白浓度试剂盒(美国Pierce公司)检测该黑平菇菌丝粗提液的蛋白浓度,测定方法按照试剂盒的说明书进行。
3)在步骤2)得到的黑平菇提取物粗提液中加硫酸铵至饱和度为40%,在2℃放置8小时后,10000rpm离心收集上清液。
4)在步骤3)得到的上清液中,继续加入硫酸铵至饱和度70%,在2℃放置8小时后,10000rpm离心,收集沉淀,即得到黑平菇抗烟草花叶病毒蛋白提取物。
按照实施例1的步骤一的步骤5的方法,分别对步骤2)和步骤4)获得的黑平菇提取物进行烟草花叶病毒抑制率检测实验,结果如表7所示。
表7.本发明的黑平菇提取物的烟草花叶病毒抑制率检测实验结果
| 重复一 | 重复二 | 重复三 | 平均值 | 差异显著性(α=0.05) | 差异性 |
黑平菇菌丝粗提液 | 51.22 | 48.86 | 46.33 | 48.81 | a | 2.45 |
黑平菇蛋白提取物 | 47.73 | 49.98 | 43.22 | 46.98 | a | 3.44 |
实施例5、本发明的黑平菇提取物的获得及其效果实验
按照实施例1的步骤一中的步骤1和步骤2的方法液体培养黑平菇菌丝,培养5天的菌丝为原料,按照下述方法获得黑平菇提取物:
1)将上述获得的黑平菇菌丝于40℃烘箱中烘干,粉碎,过60目筛得到黑平菇菌丝粉末。
2)分别将步骤1)得到的黑平菇菌丝粉末与0.025mol/L pH9.0的磷酸缓冲液按照1g/20ml的比例混合;在6℃,浸提2小时后,10000rpm离心25min,收集上清液,即为黑平菇菌丝粗提液。用BCA蛋白浓度试剂盒(美国Pierce公司)检测该黑平菇菌丝粗提液的蛋白浓度,测定方法按照试剂盒的说明书进行。
3)在步骤2)得到的黑平菇提取物粗提液中加硫酸铵至饱和度为40%,在6℃放置8小时后,10000rpm离心收集上清液。
4)在步骤3)得到的上清液中,继续加入硫酸铵至饱和度70%,在6℃放置8小时后,10000rpm离心,收集沉淀,即得到黑平菇抗烟草花叶病毒蛋白提取物。
按照实施例1的步骤一的步骤5的方法,分别对步骤2)和步骤4)获得的黑平菇提取物进行烟草花叶病毒抑制率检测实验,结果如表8所示。
表8.本发明的黑平菇提取物的烟草花叶病毒抑制率检测实验结果
| 重复一 | 重复二 | 重复三 | 平均值 | 差异显著性(α=0.05) | 差异性 |
黑平菇菌丝提取物 | 55.31 | 51.27 | 49.36 | 63.86 | a | 3.04 |
黑平菇蛋白提取物 | 52.22 | 53.87 | 48.13 | 51.41 | a | 2.96 |