CN103202864B - 一种黑平菇提取物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黑平菇提取物及其应用。本发明所提供的黑平菇提取物的制备方法，按照包括如下步骤的方法制备：1）黑平菇干粉与体积百分比浓度为70%-90%的乙醇溶液混合，加热去除单糖和双聚糖等小分子物质，过滤，收集滤渣；2）将滤渣与蒸馏水按照比例为1g：10-100ml的比例混合，在70-100℃水浴中提取1-2小时，过滤，分别收集滤液和滤渣；重复此步骤的操作1-4次，合并所有的滤液；3）向滤液中加入三氯乙酸，去除其中的蛋白，离心，收集上清液；4）向上清液里加入双氧水进行脱色，浓缩，得含黑平菇提取物的溶液。本发明可以用于制备增强免疫功能的药物或者食品，制备方法简单，原料易得，成本较低，适于生产和应用。

Description

一种黑平菇提取物及其应用

技术领域

本发明涉及一种黑平菇提取物及其应用。

背景技术

提高免疫力是我国卫生部倡导的健康生活中重要的部分，机体增强对疾病的抵抗力、抗感染、抗肿瘤和维持自身生理平衡具有重要意义。预防和改善免疫功能低下的疾病和免疫缺陷症的有效方法是通过营养学中改善膳食结构来实现的，但在临床上应用的免疫增强剂多来源于化学合成类药物，其中大多存在着毒副作用或成本高的问题，应用上存在一定的局限性。而天然食品提取物往往存在着低毒、低副作用的优势，因此，筛选对人体安全性高，成本低廉的天然活性成分是解决这一问题的有效途径。研究显示，天然产物中存在多种具有生物活性的成分，其中展现免疫调节活性的成分多为多糖和糖蛋白类物质。

多糖广泛存在于动物、植物、微生物中，从20世纪70年代开始人们逐渐发现多糖具有多方面的药理作用，主要包括：增强免疫、抗肿瘤、降血压、降血脂、降血糖、抗衰老、增强骨髓造血机能、抗辐射、对肝肾等主要脏器的保护作用等。由于多糖多种的生物活性以及在保健、疾病治疗领域的广泛使用，使多糖生物资源的开发利用和研究成为天然药物、生物化学、生命科学的研究热点。

食用菌多糖是目前被认为临床效果较为确切的一类低毒并且免疫活性强的物质。它们是一种非特异性免疫促进剂，能提高、调整机体免疫功能。其作用机制多为通过各种信号传导路径激活巨噬细胞对癌症细胞以及病原菌的细胞毒性，增大巨噬细胞的吞噬能力，刺激其分泌多种细胞分裂因子和化学干扰因子等，从而增强机体的免疫功能；或是通过不同的途径激活补体系统，在宿主防御机制中起重要作用，发挥其免疫调节的重要作用。

平菇（Pleurotus ostreatus），属担子菌亚门（Basidiomycotina），侧耳属（Pleurotus）。黑平菇是平菇的一个菌株，其子实体颜色为深黑色，色泽的深浅随温度的变化而有变化，栽培简易，深层发酵生物量高，品质好。到目前为止，国内外尚未有关于黑平菇菌株多糖增强免疫力的任何报道。相比较其他食用菌多糖，黑平菇更容易大量获得其多糖。

发明内容

本发明的目的是提供一种黑平菇提取物及其制备方法。

本发明所提供的一种黑平菇提取物的制备方法，按照包括如下步骤的方法制备：

1）黑平菇干粉与体积百分比浓度为70%-90%的乙醇溶液混合，加热去除单糖和双聚糖等小分子物质，过滤，收集滤渣；

2）将步骤1）获得的滤渣与蒸馏水按照比例为1g：10-100ml的比例混合，在70-100℃水浴中提取1-2小时，过滤，分别收集滤液和滤渣；重复此步骤的操作1-4次，合并所有的滤液；

3）向步骤2）中得到的滤液中加入三氯乙酸，去除其中的蛋白，离心，收集上清液；

4）向步骤4）中的上清液里加入双氧水进行脱色，浓缩，得含黑平菇提取物的溶液。

所述方法还包括将步骤4）获得的含黑平菇提取物的溶液与体积百分比浓度为80-100%的乙醇溶液按照体积比为1:2-4（优选为1:3）混合，静置沉淀，离心，收集沉淀，取上清液重复此步骤1-4次（优选为3次），合并沉淀，将合并后的沉淀烘干获得黑平菇提取物粉末；所述此步骤中的乙醇溶液的体积百分比浓度优选为95%。

所述步骤1）中，加热去除单糖和双聚糖等小分子物质的步骤是在50-70℃水浴中回流提取30-60分钟；所述水浴温度优选为60℃；所述提取时间优选为45分钟。

所述步骤1）中所述乙醇溶液的体积百分比浓度为85%；所述黑平菇干粉与乙醇溶液的比例为1g：100-300ml，优选为1g：100ml。

所述步骤2）中，所述滤渣与蒸馏水的比例为1g：30ml；所述的水浴温度为95℃；所述提取的时间为1小时；重复所述步骤2）的操作的次数为3次。

所述步骤3）中，所述三氯乙酸的终质量百分比浓度为15%-25%，优选为20%。

所述步骤4）中，所述双氧水的终质量百分比浓度为10%-20%，优选为15%；所述浓缩后，原溶液与浓缩液的体积比例为2-5:1，优选为4:1。

所述烘干获得黑平菇提取物粉末中的烘干温度为40-70℃，优选为60℃。

本发明所提供的黑平菇提取物是上述方法获得的黑平菇提取物。

黑平菇由于其是人类常用食物，其中本发明提取的黑平菇提取物主要含有黑平菇多糖，安全可靠，对人体无毒副作用，可以用于制备增强免疫功能的药物或者食品。

本发明还保护本发明提取的黑平菇提取物在制备增强免疫功能的药物或者食品中的应用。所述增强免疫功能为提高碳粒廓清能力和/或提高胸腺重量和/或脾脏重量。

其中，提高碳粒廓清能力体现在提高碳粒廓清系数，其检测方法如实施例4所示。提高胸腺重量和/或脾脏重量（提高免疫器官重量）体现在提高免疫器官系数，具体检测方法如实施例5所示。

本发明具有的优点和有益效果：（1）本发明黑平菇提取物的作用效果明显，以15、30、60mg/kg的给药剂量进行实验，给药14天后，均可明显提高小鼠碳粒廓清指数，与对照差异显著（P<0.01），同时上述给药剂量实验中可显著提高胸腺系数，与对照差异显著（P<0.05-0.01）。表明本发明对小鼠碳粒廓清指数（K值）、胸腺系数具有明显的提高作用，能够增强小鼠的免疫功能。

（2）本发明黑平菇提取物制备原料易得，成本较低，适于生产和应用。

（3）本发明提取工艺简单，提取率高，稳定性好。

具体实施方式

下述实施例中所述的方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所示的百分含量，如无特别说明，液体溶液含量均为体积百分含量；固体溶液含量均为质量百分含量。

实施例1、本发明黑平菇提取物的制备

黑平菇提取物的制备按照如下方法进行：

1）将黑平菇在30～40℃下烘干后打碎成粉，过60～200目筛筛子获得黑平菇干粉2g与体积百分浓度为85%的乙醇溶液200ml混合，在60℃水浴中回流提取45分钟，去除单糖和双聚糖等小分子物质，过滤，收集滤渣；

2）向上述滤渣中加入蒸馏水，固液比例为1g：30ml，在95℃水浴中回流提取1小时，过滤，分别收集滤液和滤渣；取滤渣重复此步骤三次，合并所有的滤液。

3）向步骤2）中得到的滤液中加入三氯乙酸（TCA）（使其终质量百分浓度为20%）去除其中的蛋白，离心，收集上清液；

4）向步骤3）中的上清液里加入双氧水（使其终质量百分浓度为15%）进行脱色，低压浓缩，浓缩体积与原体积比例为4:1，得黑平菇提取物的浓缩液；

5）向上述浓缩液中加入体积百分浓度为95%的乙醇溶液，浓缩液与乙醇溶液的体积比例为1:3，静置（室温（25℃）静置至不再有沉淀析出），离心，收集沉淀；取上清液重复此步骤3次，合并沉淀；

6）将上述沉淀烘干（60℃干燥）得到精制黑平菇提取物。该提取物主要成分为黑平菇多糖成分。

实施例2、本发明黑平菇提取物的制备

黑平菇提取物的制备按照如下方法进行：

1）菌株黑平菇干粉（黑平菇干粉的制备同实施例1）2g与体积百分浓度为70%的乙醇溶液600ml混合，在50℃水浴中回流提取60分钟，去除单糖和双聚糖等小分子物质，过滤，收集滤渣；

2）向上述滤渣中加入蒸馏水，固液比例为1g：100ml，在70℃水浴中回流提取2小时，过滤，分别收集滤液和滤渣；取滤渣重复此步骤4次，合并所有的滤液。

3）向步骤2）中得到的滤液中加入三氯乙酸（TCA）（使其终质量百分浓度为15%）去除其中的蛋白，离心，收集上清液；

4）向步骤3）中的上清液里加入双氧水（使其终质量百分浓度为10%）进行脱色，低压浓缩，浓缩体积与原体积比例为2:1，得黑平菇提取物的浓缩液；

5）向上述浓缩液中加入体积百分比浓度为80％的乙醇溶液，浓缩液与乙醇溶液的体积比例为1:4，，静置（室温（25℃）静置至不再有沉淀析出），离心，收集沉淀；取上清液重复此步骤1次，合并沉淀；

6）将上述沉淀烘干（60℃干燥）得到精制黑平菇提取物。该提取物主要成分为黑平菇多糖成分。

实施例3、本发明黑平菇提取物的制备

黑平菇提取物的制备按照如下方法进行：

1）菌株黑平菇干粉（黑平菇干粉的制备同实施例1）2g与体积百分浓度为90%的乙醇溶液200ml混合，在70℃水浴中回流提取30分钟，去除单糖和双聚糖等小分子物质，过滤，收集滤渣；

2）向上述滤渣中加入蒸馏水，固液比例为1g：10ml，在100℃水浴中回流提取1小时，过滤，分别收集滤液和滤渣；取滤渣重复此步骤1次，合并所有的滤液。

3）向步骤2）中得到的滤液中加入三氯乙酸（TCA）（使其终质量百分浓度为25%）去除其中的蛋白，离心，收集上清液；

4）向步骤3）中的上清液里加入双氧水（使其终质量百分浓度为20%）进行脱色，低压浓缩，浓缩体积与原体积比例为2:1，得黑平菇提取物的浓缩液；

5）向上述浓缩液中加入乙醇，浓缩液与乙醇的体积比例为1:2，静置（室温（25℃）静置至不再有沉淀析出），离心，收集沉淀；取上清液重复此步骤4次，合并沉淀；

6）将上述沉淀烘干（60℃干燥）得到精制黑平菇提取物。该提取物主要成分为黑平菇多糖成分。

实施例4黑平菇提取物影响小鼠碳粒廓清指数的增强免疫功能实验

1、实验动物的筛选：选择健康体重在20-22g范围内的昆明种小鼠（购自承德医学院）40只，随机分为4组，每组10只，采取自由取食的方式饲养，实验前12小时禁食，饮水不限。

2、药物灌胃：将实施例1制备的黑平菇提取物用蒸馏水溶解稀释成不同浓度药剂，按照表1的剂量分别进行灌胃给药，空白对照组给予等体积的蒸馏水，连续给药14天，每天灌胃一次，取食、饮水不限。

3、碳粒检测：最后一次给药40分钟后，从小鼠尾静脉以0.05ml/10g的比例注射印度墨汁。注射后2分钟和20分钟时间点上，分别从眶后静脉丛取血20μl，溶于2ml0.1%Na₂CO₃溶液中摇匀，测定溶液在600-800nm下的吸光值。

4、廓清指数计算：测定吸光值后，根据文献方法获得廓清指数公式：

廓清指数（K）=（LogA20-LogA2）/（20-2）

A20、A2指步骤3中20分钟和2分钟时间点上测得的吸光值。

通过公式计算得出不同浓度黑平菇提取物溶液的K值。

表1黑平菇提取物对小鼠碳粒廓清指数的影响（x±s）的数据）

与空白比较**P﹤0.01

结果从表1可以看出黑平菇提取物处理组小鼠的碳粒廓清指数均显著增高，与对照组比较差异显著（P﹤0.01），影响度在提取物剂量达到60mg/kg时，呈现出较大的增高。

实施例5、黑平菇提取物对小鼠免疫器官的影响实验

实验动物的筛选：选择体重在20-22g范围内的昆明种小鼠80只，随机分为8组，每组10只，采取自由取食的方式饲养，实验前12小时禁食，饮水不限。

药物灌胃：将实施例1制备的黑平菇提取物用蒸馏水溶解稀释成不同浓度药剂，按照表2、表3的剂量，分别进行灌胃给药，空白对照组给予等体积的蒸馏水，连续给药14天，每天灌胃一次，取食、饮水不限。

免疫器官重量测定：最后一次给药后，禁食12小时，测量小鼠体重，麻醉处死小鼠，解剖取其胸腺和脾脏，用滤纸吸干表面组织液，精密称重，按下式计算器官系数。

器官系数=器官质量（mg）/体重（10g）

表2黑平菇提取物对小鼠胸腺系数的影响（x±s）

与空白比较*P﹤0.05，**P﹤0.01

表3黑平菇提取物对小鼠脾脏系数的影响（x±s）

结果从表2、3可以看出黑平菇提取物处理组小鼠的胸腺系数显著增高，与对照组比较差异显著（P﹤0.05-0.01），而黑平菇提取物在各剂量处理中对小鼠的脾脏系数均无明显影响。

从上述结果来看，黑平菇提取物具有提高免疫力的功效。

Claims (11)

1.一种黑平菇提取物的制备方法，按照包括如下步骤的方法制备：

1)将黑平菇干粉与体积百分比浓度为70％-90％的乙醇溶液以1g：100-300ml的比例混合，在50-70℃水浴中加热，回流提取30-60分钟去除单糖和双聚糖等小分子物质，过滤，收集滤渣；

2)将步骤1)获得的滤渣与蒸馏水按照1g：10-100ml的比例混合，在70-100℃水浴中提取1-2小时，过滤，分别收集滤液和滤渣；重复此步骤的操作1-4次，合并所有的滤液；

3)向步骤2)中得到的滤液中加入三氯乙酸，去除其中的蛋白，离心，收集上清液；所述三氯乙酸的添加终质量百分比浓度为15-25％；

4)向步骤3)中的上清液里加入双氧水进行脱色，浓缩，得含黑平菇提取物的溶液；所述双氧水的添加终质量百分比浓度为10-20％；所述浓缩后，原溶液与浓缩液的体积比例为2-5:1。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括5)将步骤4)获得的含黑平菇提取物的溶液与体积百分比浓度为80-100％的乙醇溶液按照体积比为1:2-4混合，静置沉淀，离心，收集沉淀，取上清液重复此步骤1-4次，合并沉淀，将沉淀烘干获得黑平菇提取物粉末；所述烘干获得黑平菇提取物粉末中的烘干温度为40-70℃。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述水浴温度为60℃；所述提取时间为45分钟。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中所述乙醇溶液的体积百分比浓度为85％。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述滤渣与蒸馏水的比例为1g：30ml；所述的水浴温度为95℃；所述提取的时间为1小时；重复所述步骤2)的操作的次数为3次。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述三氯乙酸的添加终质量百分比浓度为20％。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤4)中，所述双氧水的添加终质量百分比浓度为15％；所述浓缩后，原溶液与浓缩液的体积比例为4:1。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤5)中，所述烘干获得黑平菇提取物粉末中的烘干温度为60℃。

9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤5)中，所述乙醇溶液的体积百分比浓度为95％。

10.权利要求1-9中任意一项所述的方法获得的黑平菇提取物。

11.权利要求9所述的黑平菇提取物在制备增强免疫功能的药物或者食品中的应用。