CN105732839A - 一种高活性松茸多糖的制备方法 - Google Patents

一种高活性松茸多糖的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种制备高活性松茸多糖的方法。本发明的技术方案如下：A.原料的清洗：取1 kg松茸子实体，洗净，60℃烘干至恒重；B.原料的粉碎：将松茸粉碎，80目过筛；C.原料的预处理；D.松茸粗多糖的溶出，制备松茸多糖TMP；E.松茸多糖的乙醇分级，富集活性部位：利用不同的乙醇终浓度依次沉淀分级，得到系列精制多糖，从而获得高活性松茸多糖组分。本发明是一种新的提取纯化方法，使多糖活性部位得到了充分富集，生物活性得到了很大提高。本发明产品可以开发成药品或功能保健品，产品可以进一步加工成胶囊、片剂或口服液等形式。适用于规模化生产。

Description

一种高活性松茸多糖的制备方法
技术领域
本发明属于大型真菌有效成分提取领域，具体涉及一种高活性松茸多糖的制备方法。
背景技术
松茸(TricholomamatsutakeSing)，分属于担子菌亚门、口蘑科、口蘑属，亦称松口蘑。松茸子实体香气宜人，肉质鲜美，含有多糖、蛋白质、氨基酸、多种维生素（维生素B1、B2、维生素C、维生素PP等）和微量元素等成分，具有很高的食用价值和药用价值，被誉为“食用菌之王”。
研究表明，松茸多糖是其重要的活性成分，具有明显的增强机体免疫能力、抑制癌细胞增殖和治疗糖尿病等特殊功能，其中，以抗肿瘤活性最为显著，远远高于灵芝。日本的千原吴郎等（1969）实验结果发现，松茸子实体多糖对小鼠肉癌S-180的抑制率高达91.8%，对艾氏腹水癌的抑制率为70%。
松茸主要生长于海拨1600-3200米的松林或栎树林中，是一种典型的外生菌根菌，属林下产品。目前，松茸的人工栽培仍未获得成功，子实体的产生纯粹依靠自然形成，因此产量很低，一年中仅夏季收获一次，是一种非常珍贵的稀有野生资源。目前，人们通常将松茸子实体烹饪后直接食用，虽然亦不失为一种美味佳肴，但并不能使其原有功效充分发挥出来。因此，合理开发松茸的野生资源，充分发挥其有效成分的功效，具有非常重要的意义。
松茸中多糖种类复杂，包含多种多糖组分，它们具有不同的分子结构和不同的分子量范围，试验表明，多糖的生物活性与分子量的大小和化学结构都有非常密切的关系。目前对于松茸多糖的提取方法大多采用热水浸提法，往往仅以提取得率作为优化提取工艺的指标，这样提取的多糖的生物活性未必最高；多糖的制备方法通常采用一步醇沉法，其缺点是把不同分子量与结构不同的多糖都混杂在一起，不能使其有效的活性部位得到富集，因此所表现出的生物活性往往不明显。
发明内容
本发明提供一种松茸多糖分离纯化的工艺，是一种新的提取分离方法，使多糖的活性部位得到有效富集，生物活性得到了很大提高，适用于规模化生产。
本发明的技术方案如下：A.原料的清洗：取1kg松茸子实体，洗净，60℃烘干至恒重；B.原料的粉碎：将松茸粉碎，80目过筛；C.原料的预处理；D.松茸多糖的溶出，制备松茸多糖TMP；E.松茸多糖的乙醇分级，富集活性部位，利用不同浓度的乙醇依次沉淀，得到系列精制多糖，从而获得高活性的松茸多糖组分。
前面所述的方法，优选的方案是，步骤A．原料的清洗是指，去1kg松茸子实体，洗净，60℃烘干至恒重。
前面所述的方法，优选的方案是，步骤B．原料的粉碎是指，将烘干了的松茸子实体粉碎，80目过筛。
前面所述的方法，优选的方案是，步骤C．原料的预处理是指，取松茸粉末，置于8-16倍体积的60-95%乙醇溶液中浸泡18-30h（优选的，置于9-12倍体积的80-95%乙醇溶液中浸泡20-24h，更加优选的，置于10倍体积的95%乙醇溶液中浸泡24h），以除去脂肪、部分单（寡）糖及脂溶性色素，残渣于阴凉处风干。
前面所述的方法，优选的方案是，步骤D．松茸多糖的溶出是指，预处理后的残渣风干后，选择浸提时间为1-3h，提取温度为70-100℃，水（蒸馏水）料比为10-25mL/g（v/w），80-120目纱布过滤（优选的，选择时间为1.5-2.5h，温度为80-95℃，水（蒸馏水）料比为15-18mL/g（v/w），90-110目纱布过滤；更加优选的，选择时间为2h，温度为90℃，水（蒸馏水）料比为15mL/g（v/w），100目纱布过滤），滤渣重复提取2次。合并两次提取液，旋转蒸发仪浓缩至提取总体积的1/15-1/5（优选的，浓缩至提取总体积的1/10-1/5）。
前面所述的方法，优选的方案是，步骤E.松茸多糖的酒精分级，富集活性部位是指，采用终浓度为15-35%的乙醇沉淀多糖（优选的，采用终浓度为25-30%的乙醇沉淀多糖），收集沉淀并干燥，得到松茸多糖组分1；对剩余上清继续采用终浓度为50%-70%的乙醇沉淀多糖（优选的，采用终浓度为55-65%的乙醇沉淀多糖），收集沉淀并干燥，得到松茸多糖组分2；对剩余上清继续采用终浓度为70-90%的乙醇沉淀多糖（优选的，采用终浓度为75-85%的乙醇沉淀多糖），收集沉淀并干燥，得到松茸多糖组分3。
本发明公开了一种高活性松茸多糖的制备方法，与现有技术相比，具有如下优点：本发明的创新性在于：
（1）采用乙醇分级技术，选择合适的醇沉终浓度，将松茸粗多糖按不同结构和分子量进行分离纯化，将活性部位进行了有效富集，极大地提高了产品的生物活性。同时，还除去了水提物中的小分子杂质（包括一些寡糖、色素和蛋白质），显著提高了多糖产品的纯度。
（2）采用多糖得率和生物活性两种指标进行提取工艺的优化（常规的提取工艺一般仅以多糖得率作为考察指标），为制备出高活性的松茸多糖提供了技术保障。
（3）从松茸原料的清洗到松茸粗多糖的分离纯化，整个制备过程安全无毒，对空气无污染，有利于保护环境。适合大规模工业化生产。
附图说明
图1高活性松茸多糖的制备流程图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明技术方案详加描述，但保护范围不受此限制。实施例中所用的材料为松茸子实体，购自昆明食用菌研究所；本发明所用的乙醇均为分析纯，购自莱阳经济技术开发区精细化工厂。
实施例1一种制备高活性松茸多糖的方法，包括如下步骤：
A.原料的清洗：取1kg松茸子实体洗净，60℃烘干至恒重。
B．原料的粉碎：将烘干了的松茸子实体粉碎，80目过筛。
C．原料的预处理：取松茸粉末，置于15倍体积的95%乙醇溶液中浸泡24h，以除去脂肪、部分单（寡）糖及脂溶性色素，残渣于阴凉处风干。
D．松茸多糖的溶出：预处理后的残渣风干后，选择浸提时间为2h，温度为90℃，水（蒸馏水）料比为15mL/g（v/w），100目纱布过滤，滤渣重复提取2次。合并两次提取液，旋转蒸发仪浓缩至提取总体积的1/8。
E.松茸多糖TMP的酒精分级，富集活性部位：采用终浓度为25-30%的乙醇沉淀多糖，收集沉淀并干燥，得到松茸多糖组分1；对剩余上清继续采用终浓度为55-65%的乙醇沉淀多糖，收集沉淀并干燥，得到松茸多糖组分2；对剩余上清继续采用终浓度为75-85%的乙醇沉淀多糖，收集沉淀并干燥，得到松茸多糖组分3。
实施例2一种制备高活性松茸多糖的方法，包括如下步骤：
A.原料的清洗：取1kg松茸子实体洗净，60℃烘干至恒重。
B.原料的粉碎：将烘干了的松茸子实体粉碎，80目过筛。
C.原料的预处理：取松茸粉末，置于15倍体积的95%乙醇溶液中浸泡24h，以除去脂肪、部分单（寡）糖及脂溶性色素，残渣于阴凉处风干。
D.松茸多糖的溶出：预处理后的残渣风干后，选择浸提时间为2h，温度为80℃，水（蒸馏水）料比为25mL/g（v/w），100目纱布过滤），滤渣重复提取2次。合并两次提取液，旋转蒸发仪浓缩至提取总体积的1/8。
E.松茸多糖的酒精分级，富集活性部位：采用终浓度为25-30%的乙醇沉淀多糖，收集沉淀并干燥，得到松茸多糖组分1；对剩余上清继续采用终浓度为55-65%的乙醇沉淀多糖，收集沉淀并干燥，得到松茸多糖组分2；对剩余上清继续采用终浓度为75-85%的乙醇沉淀多糖，收集沉淀并干燥，得到松茸多糖组分3。
实施例3一种制备高活性松茸多糖的方法，包括如下步骤：
A.原料的清洗：取1kg松茸子实体洗净，60℃烘干至恒重。
B.原料的粉碎：将烘干了的松茸子实体粉碎，80目过筛。
C.原料的预处理：取松茸粉末，置于15倍体积的95%乙醇溶液中浸泡24h，以除去脂肪、部分单（寡）糖及脂溶性色素，残渣于阴凉处风干。
D.松茸多糖的溶出：预处理后的残渣风干后，选择浸提时间为2h，温度为100℃，水（蒸馏水）料比为20mL/g（v/w），100目纱布过滤），滤渣重复提取2次。合并两次提取液，旋转蒸发仪浓缩至提取总体积的1/8。
E.松茸多糖的酒精分级，富集活性部位：采用终浓度为25-30%的乙醇沉淀多糖，收集沉淀并干燥，得到松茸多糖组分1；对剩余上清继续采用终浓度为55-65%的乙醇沉淀多糖，收集沉淀并干燥，得到松茸多糖组分2；对剩余上清继续采用终浓度为75-85%的乙醇沉淀多糖，收集沉淀并干燥，得到松茸多糖组分3。
表1不同实施例中松茸多糖TMP提取得率的比较
由表1可以看出，不同实施例中松茸多糖的提取得率不同，实施例1中的4种松茸多糖的得率均为最高，实施例3的次之，实施例2的得率最低。
试验例1松茸多糖的DPPH自由基活性测定
（1）试验材料：本发明中的3个实施例所得松茸多糖（TMP、TMP1、TMP2和TMP3）。
（2）试验方法：取mL样品和1mL0.2mMDPPH无水乙醇溶液充分混匀，室温下避光反应30min，在517nm处测其吸光值(A i)；1mL样品与1mL无水乙醇充分混匀，室温下避光反应30min，在517nm处测其吸光值(A j)；1mL0.2mMDPPH无水乙醇溶液与1mL无水乙醇混合均匀，温室避光反应30min，在517nm处测其吸光值(A 0)，作为参比。抗坏血酸用作阳性对照，蒸馏水用作空白对照。试验重复3次。
DPPH自由基清除率I(%)=[1-(A i-A j)/A 0]×100%
表2不同松茸多糖（TMP、TMP1、TMP2和TMP3）对DPPH自由基清除率（%）
（3）试验结论：在4种多糖（TMP、TMP1、TMP2和TMP3）中（表2所示），TMP3对DPPH的清除能力最高，其他3种清除能力相当，对于DPPH的EC50值（EC50是指当DPPH的清除率为50%时的样品浓度）分别为：721、832、861和260μg/mL。4种多糖对DPPH自由基的清除活性大小顺序为：TMP3>TMP>TMP1>TMP2。结果充分表明，利用不同浓度的乙醇进行分级可以使抗氧化活性组分有效富集，TMP3比其上一级组分TMP的DPPH自由基的清除能力提高了177%。
另外，3个实施例中的3种松茸多糖（TMP）在500μg/mL时，对DPPH自由基的清除能力分别为45.2%、41.8%和38.7%（未列在表中）。结果表明，不同的提取工艺对松茸多糖TMP的提取得率和抗氧化活性影响很大。
本发明的完成由山东省自然基金资助(No.ZR2015CL008)。

Claims (6)

1.采用乙醇分级技术制备高活性松茸多糖的方法，其特征是，包括如下步骤：A.原料的清洗；B.原料的粉碎；C.原料的预处理；D.松茸多糖的溶出，制备松茸多糖TMP；E.松茸多糖的乙醇分级，富集活性部位，获得高活性的松茸多糖组分。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤A．原料的清洗是指，去1kg松茸子实体，洗净，60℃烘干至恒重。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤B．原料的粉碎是指，将烘干了的松茸子实体粉碎，80目过筛。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤C.原料的预处理是指，取松茸粉末，置于8-16倍体积的60-95%乙醇溶液中浸泡18-30h（优选的，置于9-12倍体积的80-95%乙醇溶液中浸泡20-24h，更加优选的，置于10倍体积的95%乙醇溶液中浸泡24h），以除去脂肪、部分单（寡）糖及脂溶性色素，残渣于阴凉处风干。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤D．松茸多糖的溶出是指，预处理后的残渣风干后，选择浸提时间为1-3h，提取温度为70-100℃，水（蒸馏水）料比为10-25mL/g（v/w），80-120目纱布过滤（优选的，选择时间为1.5-2.5h，温度为80-95℃，水（蒸馏水）料比为15-18mL/g（v/w），90-110目纱布过滤；更加优选的，选择时间为2h，温度为90℃，水（蒸馏水）料比为15mL/g（v/w），100目纱布过滤），滤渣重复提取2次；合并两次提取液，旋转蒸发仪浓缩至提取总体积的1/15-1/5（优选的，浓缩至提取总体积的1/10-1/5）。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤E.松茸多糖的酒精分级，富集活性部位是指，采用终浓度为15-35%的乙醇沉淀多糖（优选的，采用终浓度为25-30%的乙醇沉淀多糖），收集沉淀并干燥，得到松茸多糖组分1；对剩余上清继续采用终浓度为50%-70%的乙醇沉淀多糖（优选的，采用终浓度为55-65%的乙醇沉淀多糖），收集沉淀并干燥，得到松茸多糖组分2；对剩余上清继续采用终浓度为70-90%的乙醇沉淀多糖（优选的，采用终浓度为75-85%的乙醇沉淀多糖），收集沉淀并干燥，得到松茸多糖组分3。
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